Summary
時間をかけて、この複雑な混合物は、化学変換を受けるので、原油の低エネルギーの水収容フラクション（LEWAF）は、分析する困難なシステムです。このプロトコルはLEWAFサンプルの調製のために捕捉されたイオン移動度分光分析、FT-ICR MSにより光照射および化学分析を行うための方法を示す図です。
Abstract
複数の化学プロセスはまた、経時的に発生する化学反応を海水中に組み込まれ、どのように原油を制御します。このシステムを研究することは正確に自然界に存在する水を収容画分の自然形成を再現するために、サンプルの慎重な準備が必要です。低エネルギーの水収容フラクション（LEWAF）を慎重に設定された比率で原油と水とを混合することによって調製されます。吸引瓶は、次に照射され、設定された時点で、水を採取し、標準的な技術を用いて抽出しました。第二の課題を考慮に時間をかけて起こる化学的変化を取らなければならないサンプルの代表的な特性評価、です。 LEWAFの芳香族留分の標的分析は、特注のトラップされたイオン移動度分光分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（TIMS-FTに接続された大気圧レーザーイオン化源を用いて行うことができます-ICR MS）。 TIMS-FT-ICR MS分析は、さらに、それらの衝突断面積（CCS）と化学式の異性体成分の同定を可能にする高解像度のイオン移動度と超高分解能MS分析を、提供します。結果は、油 - 水混合物が光に曝されるように、表面油のかなりの光可溶化は、水の中に存在することを示しています。時間が経つにつれて、可溶化された分子の化学変換は、典型的には、基油で観察されたよりも窒素と高い酸素含有量を有するものが有利で硫黄含有種の同定の数の減少で、行われます。
Introduction
原油への環境暴露の多数の供給源は、自然の原因からと人為的暴露からの両方があります。環境への放出の際に、特に海で、原油は、表面に油膜の形成、大気中への揮発性成分の損失、及び沈降して、パーティショニングを受けることができます。しかし、古典的可溶化しない難溶性油と水が発生し、そしてこの混合物を低エネルギーの混合は、低エネルギーの水収容フラクション（LEWAF）と呼ばれるものを形成します。水中の油成分の可溶化は、典型的には、太陽放射への油 - 水界面の露光中に増強されます。海の原油の写真可溶化は、太陽放射および/またはによる酵素分解1,2のこの曝露に起因する有意な化学変化を受けることができます。これらの化学的変化を理解し、彼らはバルクマトリックス（ すなわち、原油）の存在下で生じるどのようにこの暴露が環境に影響を緩和するための基本です。
以前の研究では、原油は、酸素、生物に害を与える汚染物質の毒性の高いソースを表し、特に多環式芳香族炭化水素（PAH）を受ける生物蓄積を受け、生物活性3、5、6であることを示しています。彼らは唯一のバルクマトリックスの存在下で生じるので、異なる酸素化プロセスの製品を理解することは困難です。したがって、単一の、標準的な分析は、自然界に起こる変化の代表ではないかもしれません。 LEWAFの製造は、環境設定で起こる自然のプロセスを複製する必要があります。特に興味深いのは、太陽放射による発生のPAHの酸素、です。
トン ">水収納フラクションの研究における第二の課題は、サンプル中の異なる化学成分の分子同定である。その高い質量と酸素の程度によって引き起こされるサンプルの複雑、に、酸素生成物であります例えば、FT-ICR MS（伝統的な分析は、MS分析7,8と組み合わせたガスクロマトグラフィーにより行った。別のアプローチは、超高質量分解能MS技術を利用することによって、試料の化学式の変化を特徴づけるために、典型的には不向き）。FT-ICR MSにTIMSを結合することにより、MSドメイン内のアイソバリック分離に加えて、イオン移動度分光分析（IMS）の寸法は、サンプル9、10、11中に存在する異なる異性体用分離及び特性情報を提供します。大気圧レーザーと組み合わせイオン化（APLI）ソース、分析がPAH類が正確に12、13を特徴とする受けることの変更を可能にする、サンプルで見つかった共役系分子に選択的であり得ます。この研究では、油成分の変換プロセスを研究するために、光照射をLEWAFsの調製のためのプロトコールを記載します。我々はまた、光照射時に生じる変化、ならびにサンプル抽出のための手順を示します。また、光への曝露の関数としてLEWAF中のPAHを特徴づけるためにFT-ICR MSと相まってTIMSとAPLIの使用を紹介します。
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Protocol
低エネルギーの水を収容する画分の調製（LEWAF）
- 任意の潜在的な汚染物質を除去するために、塩化メチレンでボトルを洗浄することにより清浄な2リットルのアスピレーターボトル。
- 、塩化メチレン50mLでボトルを記入し、それらを閉じて、30秒間攪拌します。適切な廃棄物容器にそれらを排出します。合計3回の洗浄のために繰り返します。
- 照射曝露と対照サンプルのような他のボトルのための1つのアスピレーターボトルを使用します（各可能な場合の重複セットを実行します）。
- 33部1,000回あたりの最終塩分濃度のために使用される水の1リットルあたりの海の塩混合物の35グラムを混合することにより、人工海水を準備します。少し下に溶液または0.45ミクロン以下の細孔サイズのフィルタを備えたろ過装置を使用して揮発性化合物の損失を防ぐために、負圧をフィルタリングします。
- ヘッドスペースの〜20％、または400ミリリットルを残し、人工海水とアスピレーターボトルを埋めます。 1グラムの油/ Lの公称濃度のガスタイトシリンジを用いて予め測定された海水に原油を追加します。
注：より多くの粘性油は、重量で送達されるべきです。 - 油を加えた後、暗所で24時間、溶液を混合（またはアルミホイルで吸引瓶を覆うことによって）可能にするために、渦（約100回転）が発生することなく、低速度で作動攪拌プレートを使用して溶液中にどこへ行くと粒子状油の混入を避けるために、すべての水溶性成分。
2. LEWAF光照射、サンプル収集、および処理
- 各光照射実験用のボトルの2セットを準備します。
- アルミホイルでアスピレーターボトルの1組をカバーします。これは暗い制御されます。
- 太陽照射装備のwiの内側に25℃の温度でアスピレーターボトルを維持するように設定温度制御水浴中でアスピレーターボトルを置きます765 W / m 2での光強度で1500-Wキセノンアークランプ番目。
- （この実験は115時間続いた）所望の時間連続してサンプルを照射します。何の最大時間はありません。
- 設定時間の後、（本実験では15、24、48、および115時間）をアスピレーターボトルuncorking、ドレインバルブを開くことにより、ガラスアスピレータの底から水150mLを集めます。
- 分液漏斗を利用して定期的に吹き飛ばしからストッパーを避けるために漏斗を排出2分間サンプルを振盪し、塩化メチレン50mLのアリコートを加えることにより、塩化メチレンで液液抽出を行います。
- 相を分離し、漏斗からストッパーを除去することにより、下部有機相を除去し、ゆっくりと排水弁を開放することを可能にします。 Na 2 SO 4での100グラムを充填した漏斗を備えた平底フラスコに試料を排出します。 increasするために、抽出を3回実行し、追加の塩化メチレンで漏斗をすすぎます抽出効率を電子。
注：複数の抽出を手順の抽出効率を向上させるために行われます。 - 漏斗を取り外し、スナイダーの列を追加し、58℃に設定湯浴中で平底フラスコを置きます。試料を15mLが残るまで蒸発させます。
- 集中管に試料を移し、飛散することにより、試料の損失を避けるために慎重に穏やかな窒素流を用いて、サンプルを乾燥させます。
分析のための試料の調製
注：分析のためのサンプル調製が鍵であり、注意が試料中に浸出原因となる、特に任意のプラスチックの使用を通じて、外国の汚染物質の導入を避けるようにしなければなりません。
- 1、V：1の混合物を調製Vメタノール：トルエンLC-MS最適グレードの溶媒を用いました。
- 、100：正の変位のマイクロピペットを用いて、ガラスバイアルに溶媒を追加した後、1の割合でサンプルを追加第一の溶媒の990μLを添加することにより、その後、10μLの試料を追加します。
注：ガラスマイクロピペットが原因で、塩化メチレンまたはトルエンに注文避けるのリーチングに使用されています。 - オプション：イオン移動度を校正するためにチューニングミックスを使用してください。
注：これは、定期的にキャリブレーション標準として使用される場合、API源は、多くの場合、浸出します。千倍希釈較正イオンがスペクトルに存在しない場合、混合物は1で試料に標準溶液の一部を添加することにより調製することができます。
4.フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（FT-ICR MS）分析
- 動作ボタンをクリックして「操作」モードに楽器を設定します。
- サンプルシリンジにサンプルをロードします。
- APIソース]タブの下で、200μL/ hの速度で注入速度を設定します。
- 1バールの噴霧器の圧力と300℃に気化温度を設定します。
- 1.2に設定し、ドライガス料金L / minで220℃までの温度。
注：この手順はAPPIとAPCIの両方に適用可能です。 - チューニングボタンをクリックして「チューニング」モードに楽器を設定します。スペクトルは、画面に表示されるはずです。
注：必要に応じて、機器は、電圧、RF周波数、および振幅などの機器パラメータを変更することにより、検体のm / z範囲内のイオン透過及び検出を改善するために最適化されてもよいです。質量分析計を再較正する必要があることに注意してください。 - 停止ボタンをクリックすることで、「チューニング」モードを停止します。
- 通常、質量スペクトルあたり20から200のスキャンの間に、平均的にスキャン数を設定し、質量スペクトルを取得するための取得ボタンを押してください。
注：複数のスペクトルを平均化するノイズを減少させ、低存在量の種14のための信号を増加させることによって、全体的な信号対雑音比を改善します。
5.トラップされたイオンモビリティーSPECTRometry（TIMS）の分析
- FT-ICR取得プログラムの「クロマトグラフィー」モードを有効にします。
- TIMSへの外部ブレーカーのスイッチを回して「TIMS」モードを有効にします。
注：TIMSに使用される電圧は、機器外部から制御されています。第2のソフトウェアは、IMS分析を実行するための器具の入口漏斗を制御します。 - 補足粗引きポンプをオンにして、TIMSの制御バルブを使用して、所望の範囲への入口と出口の圧力を調整する（この実験では、P1は1.4ミリバールに2.8ミリバール、P2に設定されていました）。
注：ガス速度の変化はスペクトルにエラーが発生しますので、外部ポンプは、ポンプは暖かいですし、その性能がIMS分析中に均一であることを保証するために、分析前に数時間オンにする必要があります。 - 最初のIMS分析を実行するために必要とされる電圧範囲を特定します。これはで、広い電圧範囲にわたって高速、ざっと検索（250 V）で行われます低IMS解像度（1 V /フレーム）。
- 使用される電圧は、全体のスペクトルを分析するのに十分である場合には、高解像度の分析のためのTIMS調整、実験を繰り返します。これを行うには、0.1 VのV /フレームを減少させ、ΔV ランプのすべてをカバーするフレームの数を変更します。
注：ユーザーがFT-ICR MS分析に先立って、衝突セルに蓄積されたTIMS実験の数を最適化する必要があるかもしれません。
6.データ解析
- データ解析ソフトウェアでMSデータを開きます。
- 6信号対雑音上記のものを選択し、「ピークを探す」機能を使用するには、ピークピッキングの基準を設定します。
注：結果として得られるスペクトルは、内部で溶液中に存在する標準を使用して再キャリブレーションされています。これは、化学的系列を識別するために使用され、次に広域要素割り当ての精度を向上させるために再び再較正されます。 - 式アサインを使用して、元素割り当てを実行ツールやソフトウェアをメンター。
注：式H 1-100 N 0-2 O 0-7 S 0-2、奇数と偶数の電子構成は、許可されているC 1から100の範囲、および0.5 ppmのMが+の質量公差と[M + H] +イオンの形 - データ解析ソフトウェアにIMS-MSデータをインポートし、全体の分析範囲の平均質量スペクトルを生成します。
- 6信号対雑音上記のピークを選択します。超高分解能MS分析で同定された系列を使用して、内部のスペクトルの再較正
- FT-ICR MS分析から式の識別を使用して、すべてのターゲットのm / zのリストを生成し、データフォルダ内の「Flist.txt」としてこれを保存します。このリストは、データ処理の第1段階で使用されます
- ロードとは、リスト内のすべてのターゲットのm / zのための抽出イオンクロマトグラム（EIC）を抽出するために提供されたスクリプトを実行します。
- 入力ファイルのディレクターにPythonスクリプトを変更します。Y、始動電圧、ステップサイズ、およびそのターゲット分析11のステップ数。
- IMSのデコンボリューションスクリプトを実行します。
注：これは、各EICを開き、反復ガウシアンフィッティングによってピークを同定します。結果はExcelファイル形式13で出力されます。
注：フィッティングした後、一定の基準以下のピークは、典型的には、（一定の幅以下のピークは一般的にあるため、ランダムノイズスパイクの分析から除外されている）は、ピークの高さ、幅、面積に基づいて、除外されます。 - チューニングピークを利用して、イオン11のモビリティする電圧からイオン移動度を校正します。これは、メーソン - Schamp式を用いて衝突断面積に変換することができます。
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Representative Results
m / zとTIMSトラップ電圧に基づいて、2次元スペクトルにおけるTIMS-FT-ICR MSの結果によってLEWAF分析。化学式の分布とIMS（ 図1参照）によって同定異性寄与によって観察されるように種々の時点で採取した試料の各々は、従って、変化の化学組成に基づいて特徴付けることができます。典型的には、 のm / zの情報を分析し、ピークに基本式を割り当てるために利用することができます。 APLIの使用は、分子のクラスの広い範囲を電離、より高い感度15と芳香族二重結合を有する分子の分析を可能にする（ 例えば、HC、O 1-4、NO 0-4、およびSO 0-4）13。この情報は、DBE式、炭素数のヘテロ原子含有量の関数としての点の分布を示すプロットに編成され、式の。これは、炭素数及び環および分子内に二重結合の数（ 図2参照 ）の関数としての、化学式の変化は違いとして観察されることを可能にします。
サンプルの二次元の特徴付けは、サンプルが、各分子についてのm / z、イオン式、および衝突断面を特徴とすることを可能にします。これは、カラースケールで、分子のDBEを表すことができ、移動度対炭素数のプロットとして示されています。これは、特定の化学家族のための分子サイズの相関を可能にします（同じヘテロ原子とDBE、 図3を参照してください）。 CCS情報が分析の間の変化を示す、分子の潜在的な構造に関する情報を提供し、異性体の含有量の分析を可能にします。
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LEWAFsの図1. 2D-TIMS-FT-ICR MS。これは、24時間後に回収画分についてTIMS-FT-ICR MSから取得された典型的な二次元スペクトルを表します。単一の傾向は、データで観察されているかに注意してください。このデータの信号が非常に凝縮され、高度に芳香族化学構造、から来ています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
炭素数対2 DBE図。 6の異なる化学クラス（HC、N、O、O 2、O 3、及びOS）の割り当ての分布を示す代表的なプロット。 x軸は、構造中の炭素数であり、y軸は、によって記述二重結合等価です52 / eq1.jpg "/>。各ドットの色は、強度の対数である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
炭素数対3モビリティ図。このプロットは、カラースケールは、DBEのサイズを有する直鎖状である逆移動度の変化、及び炭素数プロットを示しています。同じ6ヘテロクラスは（HC、N、O、O 2、O 3、及びOS）個別に示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
LEWAFsの化学的複雑さは正確に自然に発生するものを反映するために実験室での実験のための順序で正確な準備が必要です。データの有効性評価は、三つの基準にかかっ：（ 例えば、LEWAFの準備、サンプリング、抽出、および分析のための試料調製）を取り扱うサンプル全体のアーティファクトの導入を最小限に抑え、暗いコントロールを使用して実験プロトコル（ すなわち、検証します）光照射実験のために、（ すなわち、）標準の使用を介してMSとIMSパフォーマンスを検証する装置の性能を検証します。
データ処理および解釈も挑戦を提示することができます。最初の課題は、観察されたピークの分子式の割当てです。これは、データの潜在的な誤った割り当てを回避するために、高質量精度が必要となります。 IMSの解釈がありますまた、複雑な検証が必要です。現在のシステムは、実験スペクトルの5％の偏差内のガウスピークを一連のデータを特徴付ける、およびデータは、ピーク幅、面積、及び信号対雑音比の基準を満たしていないピークを除去するために濾過されます。
修正およびトラブルシューティング
調製LEWAFは、異なる実験および光酸化、微生物分解、または両方の組み合わせの可能性を探る分析技術の一連のために使用することができます。これらは、その後、劣化油のための新規分子署名を特定しようとするために、このような結果の毒性、生物への摂取量の割合、および分子特性など、さまざまな基準に評価することができます。
高IMS解像度解析を行う際に、別の課題は、より低い感度であることができます。これはincreasiは、衝突セル内の蓄積数を増加させることによって対処することができますサンプルの全体的な信号対雑音比をngの。別の解決策は、典型的には、感度を高める、TIMS分析器の入口と出口の圧力差を減少させることです。
この技術の制限事項
TIMS-FT-ICR MSはLEWAF分子量領域に適用することができる（M / Z = 100〜900）。しかし、イオン化源（APLI）はTIMS-FT-ICRのMSに導入することができる分子イオンの種類を制限することができます。したがって、イオン化工程が考慮分子クラスターゲットの関心を取るために調整する必要があります。この特定の実験では、酸素の芳香族製品に焦点を当てています。そのようなエレクトロスプレーイオン化、大気圧光イオン化、大気圧化学イオン化、またはレーザー脱離イオン化のような他のイオン源は、LEWAFの相補的な分子クラスを標的化するために使用することができます。そのためTIMS-FT-ICR MS分析の時間スケールの、オンラインchromatographic分離は不可能です。しかしながら、オフライン分別戦略が可能です。
代替方法に関して、この技術の重要性
APLI-TIMS-FT-ICR MSの使用は、化学的分布だけでなく、分子の異性体の寄与を評価する、ヘテロ原子のPAHの特徴付けを可能にします。典型的に、これは、PAH類及びそれらの分解生成物のいずれに限られていました。しかし、典型的な結果は、時間の経過とともに、酸素分子のより大きな数を観察しながら時間をかけて減少純粋な炭化水素と分子の分布に大きな変化があることを示しています。したがって、従来のPAH分析が不十分サンプルを特徴付けることができます。他のクロマトグラフィー法とは異なり、例えば、GCなどの揮発性の要件に起因する分子の大きさには制限はありません。また、IMSの測定は異なり、普遍的である分子構造上の特性情報を提供しますLC法。
この技術のさらなる応用
この技術はLEWAFsの研究に限定されるものではなく、それはまた、複雑な混合物を、超高質量分解能、解決する必要のある異性体の干渉を有するものが必要とする高同重体干渉と特に非標的の分析に適用することができます。これは、環境試料、汚染物質の標的分析、溶解有機物質、石油、さらに生物学的材料の広い範囲の分析の両方に適用することができます。
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Disclosures
著者には、競合する金融利益を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（FFLへの助成金番号R00GM106414）によってサポートされていました。私たちは、彼らのサポートのためにフロリダ国際大学の高度な質量分析施設を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| methylene chloride, Optima | Fisher Scientific | DS-151-4 | Used as received |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Scientific | A456-4 | Used as received |
| toluene, Optima | Fisher Scientific | T291-4 | Used as received |
| Na2SO4, Granular, Anhydrous | Fisher Scientific | S415-212 | Combusted at 450 °C/Stored at 105 °C |
| Crude oil | Various sources | ||
| Instant Ocean® | Aquarium Systems | SS1200 | 33 ppt salinity with 0.45 μm pore filtration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Suntext XLS+ | Atlas Chicalo Ill, USA | 1,500 W xeon arc lamp, light intensity of 765 W/m2 | |
| Atmospheric Pressure Laser Ionization | Bruker Daltonics Inc, MA | Note a 266 nm laser is used | |
| TIMS-FT-ICR MS Instrument | Bruker Daltonics Inc, MA | The set up we had consisted of a 7 T magnet with an infinity cell | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| DataAnalysis 4.2 | Bruker Daltonics Inc, MA | ||
| Python 2.7 | Requires Numpy, Scipy, Pandas, glob, oct2py, and os | ||
| Octave 4.0 |
References
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