Summary
La prevenzione della trichinellosi umana in molti paesi del mondo si basa su analisi di laboratorio di campioni muscolari di animali sensibili con metodi di digestione, le cui modalità agitatore magnetico è considerato il gold standard.
Abstract
La trichinellosi è una malattia debilitante in esseri umani ed è causata dal consumo di carne cruda o poco cotta di animali infettati con le larve di nematodi del genere Trichinella. Le fonti più importanti di infezioni umane in tutto il mondo sono selvaggina e prodotti di carne di maiale o di maiale. In molti paesi, la prevenzione di trichinellosi umana si basa sulla individuazione di animali infetti mediante digestione artificiale dei campioni di muscolo da carcasse animali sensibili.
Esistono diversi metodi basati sulla digestione della carne ma il metodo agitatore magnetico è considerato il gold standard. Questo metodo consente l'individuazione di Trichinella larve al microscopio dopo la digestione enzimatica di campioni di muscolo e successive fasi di filtrazione e sedimentazione. Anche se questo metodo non richiede attrezzature speciali e costose, controlli interni non possono essere utilizzati. Pertanto, la gestione della qualità rigorosa dovrebbe essere applied durante tutta la prova. Lo scopo del presente lavoro è quello di fornire istruzioni di manipolazione dettagliate e punti critici di controllo del metodo gli analisti, sulla base dell'esperienza del laboratorio di riferimento dell'Unione europea per i parassiti e il Laboratorio Nazionale di riferimento della Germania per Trichinella.
Introduction
I nematodi del genere Trichinella possono essere rilevati nei muscoli striati di carnivori e onnivori mammiferi, uccelli e rettili in tutto il mondo. Questi nematodi zoonotici possono raggiungere gli esseri umani quando crudo o carne semi-prime e prodotti di carne derivati da suini, cavallo e selvaggina vengono ingeriti. Questo zoonosi può essere una grave malattia negli esseri umani caratterizzati da segni e sintomi patognomonici, ad esempio, diarrea, febbre, edema periorbitale e mialgia e le possibili complicazioni, come la miocardite, malattia tromboembolica e l'encefalite 1.
Trichinella spiralis è l'agente eziologico più diffusa di infezione Trichinella negli animali selvatici e domestici e provoca la maggior parte delle infezioni umane in tutto il mondo. In Europa, Nord e West Africa e Asia occidentale, Trichinella britovi è un'altra fonte di infezioni umane. Inoltre, altri dieci taxa sono meno comunemente riportati come causale agenti della malattia umana e si trovano in diverse regioni del mondo, di solito in animali selvatici 2. Oltre agli animali selvatici come cinghiali, orsi, trichechi e tassi, carne di maiale rappresenta la più importante fonte di infezione umana in tutto il mondo.
Il modo migliore per prevenire la trichinellosi è quello di astenersi dal mangiare prodotti di carne cruda e per cucinare qualsiasi tipo di carne, soprattutto carne gioco a temperature sicure (> 65 ° C per 1 minuto, vale a dire per cambiare il colore della carne dal rosa al marrone nel nucleo della prodotti a base di carne) 3. L'Unione europea e USDA hanno specificato di congelamento e tempi di cottura e le temperature per i prodotti di carne di maiale che possono essere utilizzati per uccidere T. spiralis larve nella carne 4, 5. Inoltre, le raccomandazioni per l'inattivazione di Trichinella nella carne e derivati sono stati pubblicati dalla Commissione internazionale sulla Trichinellosi"xref"> 6. In Europa, oltre all'introduzione di condizioni di stabulazione controllata in allevamenti suini commerciali in cui il rischio di infezione da Trichinella è trascurabile, la prevenzione di trichinellosi umana si basa su analisi di laboratorio dei campioni di muscolo da animali sensibili 4.
Per motivi di sicurezza alimentare, i saggi di digestione sono le uniche procedure affidabili per la rilevazione diretta di larve di Trichinella nella carne 3, 7. Anche se ci sono diverse varianti del saggio di digestione, il metodo agitatore magnetico è il metodo accettato internazionalmente riferimento 3, 4, 7. Questo test si basa sul rilevamento di larve di Trichinella nei tessuti muscolari striate. Dopo la digestione enzimatica di campioni di muscolo e successive fasi di filtrazione e sedimentazione, Trichinella larve sono identificati al microscopio. A seconda obblighi commerciali e la legislazione nazionale, ci sono una moltitudine di piccole variazioni nel protocollo generale del metodo agitatore magnetico. Qui, i dettagli tecnici si basano su requisiti UE 4, le specifiche ISO 8, linee guida ICT 6, e l'esperienza del laboratorio di riferimento dell'Unione europea per i Parassiti (EURLP) e il laboratorio tedesco di riferimento per Trichinella.
Protocol
1. preparati
- raccolta dei campioni
Nota: Il metodo agitatore magnetico può essere utilizzato per i campioni muscolari singole o in pool.- Raccogliere campioni dai siti di predilezione appropriati e in una quantità appropriata 9. Fare riferimento ai requisiti nazionali o alle raccomandazioni del TIC, UIE o ISO.
- Per l'Unione europea, ad esempio, prendere un campione di 1 g da un pilastro del diaframma nella zona di transizione verso la parte tendinea dei suini domestici. Assicurarsi che tutti i campioni muscolari sono privi di tutto il grasso e fascia.
- Se la lingua è testato, rimuovere lo strato superficiale prima del test.
- Fare attenzione se i campioni sono congelati, come la maggior parte delle larve di Trichinella non sono congelare resistente e Srotolare dopo la morte, sono meno resistenti alla digestione e tendono ad aderire alle pareti del contenitore, con conseguente diminuzione della sensibilità del test.
Nota: Se congelato, raddoppiare la dimensione del campione a Lest e aumentare il tempo di sedimentazione (vedi sotto).
- Raccogliere campioni dai siti di predilezione appropriati e in una quantità appropriata 9. Fare riferimento ai requisiti nazionali o alle raccomandazioni del TIC, UIE o ISO.
- Preparazione di liquido di digestione
- Aggiungere 25% HCl (16 ± 0,5 mL) per 2 L di acqua di rubinetto preriscaldato a 46 - 48 ° C in un bicchiere di vetro 3 L. Troppo basso di un risultato di temperatura in incompleta digestione; troppo elevato di temperatura disattiva le proprietà enzimatiche della pepsina.
- Inserire una barra di agitazione nel becher, e agitare la soluzione su una piastra preriscaldata (46 - 48 ° C).
- Aggiungere 10 ± 0,2 g di pepsina (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP) alla soluzione acida.
Nota: La qualità della pepsina è della massima importanza e l'attività enzimatica devono essere certificati dal produttore. Per motivi di sicurezza di laboratorio e per mantenere l'attività della pepsina, la sequenza di aggiunta componenti fluidi digestione deve essere rispettata.
- Preparazione del campione muscolare
- Tritare fino a 100 g di campioni di muscolo in un frullatore o macinino. Per facilitare blending, aggiungere 2 ml preriscaldata acqua per i campioni e si fondono alla massima velocità per 2 - 3 s.
- Prima della seconda fusione, aprire il frullatore e trasferire qualsiasi campione di muscolo in cima miscelazione ciotola margine del bordo di fondo e ripetere la miscelazione. Continuare la miscelazione con esplosioni di 2 - 3 s fino a quando non frammenti visibili di carne rimangono.
Nota: Troppo poco miscelazione può causare digestione incompleta, mentre troppa fusione può danneggiare il Trichinella larve presenti nei campioni 6.
2. procedura
- Muscle campione digestione
- Trasferire 1 L del fluido di digestione in un cilindro. Trasferire la carne macinata nel becher e diffondere nel fluido di digestione con un cucchiaio o forchetta. Sciacquare la ciotola coperchio frullatore, lama e frullatore con 500 ml di succo di digestione preriscaldato nel 3 L bicchiere.
Nota: risciacquo incompleta può comportare la perdita di sensitivity. - Coprire il becher con foglio di alluminio e mantenere una temperatura costante 44 - 46 ° C e controllare con un termometro.
- Mescolare il succo di digestione per 30 minuti per creare un vortice profondo senza spruzzi fino a quando le particelle di carne scompaiono. A seconda del tipo di carne provati (per esempio carne di animali selvatici), aumentare il tempo di digestione fino ad un massimo di 60 min.
- Trasferire 1 L del fluido di digestione in un cilindro. Trasferire la carne macinata nel becher e diffondere nel fluido di digestione con un cucchiaio o forchetta. Sciacquare la ciotola coperchio frullatore, lama e frullatore con 500 ml di succo di digestione preriscaldato nel 3 L bicchiere.
- Filtrazione e sedimentazione del fluido di digestione
- Per determinare la quantità di tessuto non digerito, regolare la scala a zero, pesare il setaccio prima dell'uso, e annotare il suo peso. Il setaccio deve essere pulita e priva di eventuali particelle di tessuto, che potrebbero ostacolare le larve di Trichinella raggiungere l'imbuto di sedimentazione. Controllare che l'imbuto di separazione è livellato in senso verticale.
- Dopo la digestione, con attenzione versare il liquido di digestione attraverso un setaccio di 180 micron in un imbuto di vetro di separazione. La larghezza del imbuto di vetro di separazione non deve be più grande di 55% della lunghezza per consentire una buona larva sedimentazione. Fare attenzione per evitare qualsiasi troppo pieno.
- Per evitare la perdita di sensibilità, sciacquare il bicchiere di vetro e il setaccio con circa 200 ml di acqua di rubinetto da una bottiglia di lavaggio squeeze e trasferire l'acqua di risciacquo nell'imbuto bicchiere sedimentazione. Fare attenzione a lavare con cura i bordi del 3 L bicchiere. Sollevare il setaccio e lavare l'area sotto il setaccio accuratamente.
- Determinazione della quantità di tessuto non digerito
Nota: A causa di errori nella esecuzione del metodo, tessuto muscolare può rimanere sul setaccio, nonché fascia e tessuto connettivo che sono indigeribili. La quantità di tessuto non digerito è determinato durante la prima fase di sedimentazione 10 min (vedere 2.5). Questo permette circa 30 minuti per il setaccio a secco, come l'acqua residua può influenzare il peso determinato del tessuto non digerito.- Mettere un tovagliolo di carta su una scala, e pesare il setaccio con le undigestessuti TED.
- Sottrarre il peso del setaccio prima della filtrazione dal peso del setaccio con i tessuti non digerite. Il processo di digestione è considerato soddisfacente se non più del 5% del peso del campione iniziale rimane sul setaccio (cioè 5 g / 100 g materiale di partenza).
- Se la quantità di tessuto non digerito supera il 5%, ripetere il test utilizzando campioni di muscolo freschi. Se il tessuto rimanente è prevalentemente costituito da tessuto muscolare non digerito e campioni freschi non sono disponibili, digerire ancora i resti non digeriti ed esaminare in aggiunta ai campioni originali.
- La sedimentazione del fluido di digestione
- Mantenere il fluido di digestione filtrato nell'imbuto separatore per 30 min. Se lasciati indisturbati, le larve Trichinella si depositerà sul fondo dell'imbuto.
- Se si utilizzano campioni congelati, aumentare il tempo di sedimentazione a un massimo di 60 min.
- Una volta che la sedimentazione è completa, aprire completamente il rubinettodell'imbuto separatore di lasciare almeno 40 ml di succo di digestione rapidamente in un recipiente cilindrico (80 mL se campioni di muscolo erano stati precedentemente congelati).
- Per prima cosa, la metà del fluido nel cilindro e quindi aprire completamente il rubinetto nella direzione opposta per consentire 10 ml di succo di digestione per passare. Infine, aprire il rubinetto in senso opposto per altri 10 mL. Questa procedura garantisce che larve di Trichinella non sono intrappolati nel rubinetto.
Nota: è necessaria la velocità sufficiente per evitare le larve che rimane nella imbuto separatore, diminuendo la sensibilità.
- La sedimentazione del fluido di digestione nel cilindro
- Lasciare il sedimento nel cilindro per 10 minuti per permettere alle larve di sedimenti. Rimuovere 30 mL surnatante mediante aspirazione con una pipetta senza disturbare il sedimento 10 mL.
- Per ridurre la quantità di fibre di tessuto nel campione, aggiungere 30 ml di acqua di rubinetto per il sedimento e lasciar riposare per altri 10 ma. Ripetere fino a quando il liquido è chiaro.
- Rimuovere il surnatante e trasferire i 10 ml lavato sedimenti di una capsula di Petri a griglia o vaschetta per il conteggio delle larve. Lavare il cilindro con 10 mL di acqua di rubinetto e quindi aggiungere l'acqua al campione.
Nota: Come grandi quantità di detriti nel campione possono impedire l'identificazione delle larve Trichinella (Figura 1), ulteriori fasi di lavaggio devono essere eseguite, se necessario.
- Esame microscopico
- Utilizzare trichinoscopio o stereomicroscopio con una sorgente luminosa sottostadio trasmessa di intensità regolabile da 15 a 20 ingrandimenti per esaminare i campioni immediatamente dopo le fasi di lavaggio.
- Dopo aver versato il campione nella capsula di Petri con griglia, esaminare il piatto / bacino sistematicamente griglia per griglia. Se non si trovano le strutture sospette, spostare delicatamente il liquido nella scatola di Petri con griglia o vaschetta per il conteggio delle larve in modo circolare per consentire a qualsiasi Trichinella larvae, che sono stati potenzialmente trascurato, si accumuli nel centro del piatto Petri. Ripetere l'esame.
- Se viene trovata una struttura di sospetto, aumentare l'ingrandimento di 40 - 100X. Rimuovere larve di Trichinella dal piatto / vasca con una pipetta e raccogliere in un tubo con etanolo al 90%.
- Dopo il piatto completo è stato esaminato, ripetere la procedura partendo dal leggero scuotimento del piatto / bacino. Ripetere la procedura almeno tre volte o fino a quando non più larve si trovano.
- Contare il numero di larve. Correlare alla quantità di tessuto muscolare testati e presente come larve per grammo (GPL).
- Se troppe le larve sono presenti nel succo di digestione per determinare il numero delle larve in modo affidabile, restituire il fluido contenente le larve al cilindro di misura, sciacquare con acqua di rubinetto da una bottiglia di lavaggio di compressione, e lasciare le larve di depositarsi sul fondo.
- Dopo un tempo di sedimentazione 10 min, ridurre il supernatante in un volume definito (ad esempio10 mL). Per determinare il volume esatto, trasferire il surnatante in un nuovo cilindro con una pipetta.
- Sospendere larve omogeneamente nel fluido da agitazione vigorosa. Durante il movimento di agitazione, aggiungere 12 gocce di 20 microlitri di sospensione delle larve su una capsula di Petri.
- Esaminate ogni goccia al microscopio. Determinare il numero di larve in 240 ml ed eliminare il più alto e il più basso conteggio. Estrapolare il numero di larve al volume totale (ad esempio 10 ml) del surnatante.
Nota: La qualità della stereomicroscopio è di fondamentale importanza per l'identificazione di larve di Trichinella. - Quando le larve sono raccolti in un tubo da una pipetta, verificare attentamente che le larve non ha attaccato sulla parete pipetta, ma vengono trasferiti al tubo.
Nota: Trichinella Positive risultati di campioni aggregati devono essere ricondotte dalla piscina alla carcassa di origine. Qui, la dimensione del pool dovrebbe progressivamente diminuire fino a quando la carcassa positivo è identificata. La dimensione del campione può essere aumentata durante questo processo per aumentare la sensibilità. Se l'esame di un campione aggregato produce un risultato positivo o incerto, un ulteriore campione di 20 g è preso da ciascun suino. I 20 g di campioni provenienti da cinque suini vengono raggruppati ed esaminati con il metodo descritto. In questo modo saranno esaminati campioni provenienti da 20 gruppi di cinque suini. Quando viene rilevato Trichinella in un campione composito da cinque suini, campioni di 20 g vengono raccolti dai singoli suini del gruppo e ciascuno viene esaminato separatamente fino a quando viene rilevata la carcassa positiva di origine.
Representative Results
Dopo la digestione, la forma delle larve muscolare infettivo può variare, rendendo più difficile l'identificazione. Forme tipiche includono larve strettamente arrotolato, larve leggermente arrotolata o a forma di C o larve completamente srotolato (Figure 2B - 2C). Il numero di larve trovato per grammo può variare considerevolmente e può variare da una larva a qualche centinaio larve.
La morfologia della larva muscolare infettivo è mostrato nella Figura 2A. Trichinella larve sono 0,7 a 1,5 mm e circa 0,3 mm di larghezza. L'esofago è stretta e ha una fine leggermente arrotondata. La cuticola è liscia. Nella metà anteriore della cavità del corpo, il stichosome, una struttura costituita da un lungo tubo sottile circondata da una fila di 45 a 55 grandi cellule (stichocytes), può essere osservato. Il retto è anche arrotondata senza sporgenze o appendici 10, 11.
t "> altre strutture, oltre larve di Trichinella, possono essere trovati dopo la digestione muscolare Alcuni esempi sono riportati nelle figure 3A -.. 3F Gli animali selvatici sono spesso infettati con altri parassiti o campioni di muscolo disponibili per i test sono contaminati durante il processo di eviscerazione da animato o strutture inanimate / organismi. la lunghezza delle larve, l'aspetto delle estremità anteriore e posteriore e la presenza della guida stichosome di discriminare tra i diversi generi nematode 12.
Figura 1: esame microscopico di larve di Trichinella Dopo (A) insufficiente e (B) adeguato risciacquo passi. Barre di scala indicano 100 micron. Clicca qui per visualizzare un grande version di questa figura.
Figura 2: Morfologia del infettiva larve di Trichinella Mostrando il retto, Stichosome e l'esofago della larva (A). Possibili forme delle larve muscolare dopo digestione mostra (B) strettamente avvolti e leggermente arrotolati movimento larve e (C) srotolato larve. Barre di scala indicano 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di risultati in secondo piano dopo la digestione di Muscle Campioni con il metodo agitatore magnetico. (A) capelli setole-comelombrico trovato nei cinghiali; (B) Alaria alata di cinghiale; (C) delle fibre muscolari di cinghiale; (D) Metastrongylus sp. di cinghiale; Fibra (E) impianto trovato in cinghiale (F): Toxocara sp. larva di cinghiale. Barre di scala indicano 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Sebbene il metodo agitatore magnetico può essere facilmente eseguita, non strettamente aderente ai dettagli tecnici conduce alla sensibilità insufficiente, mettendo così in pericolo la salute dei consumatori. I punti critici di controllo sono stati evidenziati nel testo di cui sopra. Inoltre, l'uso di attrezzature adeguate è fondamentale per il buon esito del test. Tutte le navi devono essere di punte di vetro e pipette rivestite con silicone per ridurre l'aderenza delle larve in superficie.
La sensibilità del metodo di digestione dipende dalla densità larvale nei muscoli e la quantità di campione di muscolo testato. Per una densità larvale di 3 - 5 lpg di tessuti muscolari, è stata riportata una sensibilità del 100%, ma inferiore 1 lpg la sensibilità è scesa al 40% 13. A seconda della specie ospite animali esaminate, la sensibilità del test può essere migliorata aumentando la quantità di campione usato. l'infection onere di fauna selvatica è solitamente basso, campioni di conseguenza più grandi dimensioni vengono utilizzati 14. I siti di predilezione variano anche tra gli animali ospiti. Qui, la digeribilità inferiore alcuni tessuti muscolari come la lingua deve essere presa in considerazione, che può anche provocare campione più taglie 15.
Inoltre, è importante comprendere che il metodo agitatore magnetico non include controlli interni. Pertanto, la gestione garanzia di qualità dal campionamento alla documentazione è essenziale per ottenere risultati accurati e precisi. La qualità delle prestazioni del laboratorio per rilevare larve di Trichinella nei campioni di muscolo deve essere monitorata dalla partecipazione regolare di ogni analista in prove di competenza.
Ulteriori limitazioni del metodo sono che la fase di identificazione finale delle larve muscolare al microscopio è molto soggettiva e heaVily dipende dalla conoscenza della morfologia larvale dall'analista esaminando.
Un metodo alternativo interessante per aggirare questo problema è il metodo agitatore magnetico / isolamento mediante filtraggio seguito da rilevamento larve mediante un test di agglutinazione al lattice. Tuttavia, secondo la legislazione UE questo metodo è considerato solo equivalente per la sperimentazione di carni di suini domestici, ma non per gli animali che sono a più alto rischio di infezione, come cinghiale 4. L'identificazione dell'antigene larvale con anticorpi monoclonali rende il test più obiettivo, ma nega il laboratorio la possibilità di determinare il numero di larve per grammo di carne 16.
Ulteriori variazioni del metodo agitatore magnetico comprendono la tecnica metodo / sedimentazione digestione di campioni aggregati assistito meccanicamente, lo scavo campione composito assistito meccanicamenteMetodo estion / sulla tecnica di isolamento del filtro, e il metodo di digestione automatica per campioni aggregati tecnica fino a 35 g. Queste tecniche sono tutti basati sulla digestione artificiale della carne e la visualizzazione e conteggio delle larve di Trichinella, ma differiscono per l'apparecchiatura utilizzata per le fasi di filtrazione e sedimentazione.
Le larve isolato può essere ulteriormente identificato a livello di specie da un test molecolare (ad esempio, multiplex PCR) 17. Secondo la legislazione UE, tutti i campioni positivi devono essere trasmessi al laboratorio nazionale di riferimento o al EURLP per la determinazione delle specie Trichinella.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Abbiamo gentilmente Ringraziamo Sabine Reckinger per l'assistenza tecnica eccellente e di sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knife, Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
| Blender | With a sharp chopping blade | ||
| Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
| Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
| Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation. | ||
| Stands, rings and clamps | |||
| Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
| Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
| Glass beaker | Capacity 3 L | ||
| Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube | ||
| Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
| Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
| Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
| 25% hydrochloric acid | |||
| Pepsin | Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL | ||
| Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
| Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
| Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
| Metal tray | Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice | ||
| Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 mL) | ||
| Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C | ||
| Siphon | For tap water |
References
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