Summary
多くの国で人間の旋毛虫症の予防は、世界的な磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられるの消化、の方法による感受性動物から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。
Abstract
旋毛虫症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、属旋毛虫の線虫の幼虫に感染した動物の生や加熱が不十分な肉の消費によって引き起こされます。ヒトへの感染の最も重要な情報源は、世界中のゲーム肉と豚肉や豚肉製品です。多くの国では、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物の死骸からの筋肉試料の人工的な消化によって、感染動物の識別に基づいています。
肉の消化が、磁気攪拌法がゴールドスタンダードと考えられているに基づいていくつかの方法があります。この方法は、筋肉のサンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化後の顕微鏡による旋毛虫の幼虫の検出を可能にします。この方法は、特殊で高価な装置を必要としないが、内部対照を使用することができません。そのため、厳しい品質管理がapplieする必要がありますテストを通して、D。本研究の目的は、寄生虫のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所と旋毛虫のためのドイツの国立リファレンス研究所の経験に基づいて、アナリストに詳細な取扱説明書及び方法の重要管理点を提供することにあります。
Introduction
属旋毛虫の線虫は、世界中の肉食動物と雑食哺乳類、鳥類、爬虫類の横紋筋で検出することができます。これらの人獣共通線虫は、豚、馬から人間の生または半生肉や肉派生した製品を達することができ、ゲームの動物が摂取されています。この人獣共通感染症は疾病の徴候や症状、 例えば下痢、発熱、眼窩周囲浮腫および筋肉痛や、心筋炎、血栓塞栓症や脳炎1できるだけ合併症によって特徴づけられる、ヒトに重篤な疾患であることができます。
旋毛虫は野生と家畜における旋毛虫感染の最も普及している病原体であると世界中のヒトへの感染の大部分の原因となります。ヨーロッパ、北と西アフリカ、西アジアでは、 旋毛虫britoviは、ヒトへの感染の別のソースです。また、10他の分類群は、あまり一般的原因として報告されていますおよびヒト疾患の薬剤は、通常、野生動物2に、世界のさまざまな地域で発見されています。そのようなイノシシ、クマ、セイウチやアナグマなどの野生動物に加えて、豚肉は、世界中のヒトへの感染の最も重要なソースを表します。
旋毛虫症を防ぐための最善の方法は、のコアに茶色にピンクから肉の色を変更するには、すなわち 、1分間> 65°C（安全な温度に生の肉製品を食べることを控えるようにし、任意の肉を調理するために、特にゲームの肉であります肉製品）3。欧州連合（EU）と米国農務省は肉4、5でのT. spiralisの幼虫を殺すために使用することができ豚肉製品の冷凍調理時間と温度を指定しました。また、肉と肉製品中の旋毛虫の不活性化のための提言は、旋毛虫症に関する国際委員会によって発行されました"外部参照"> 6。ヨーロッパでは、 旋毛虫感染のリスクが無視できる商業豚の群れにおける制御住宅事情の導入に加えて、人間の旋毛虫症の予防は、感受性動物4から筋肉サンプルの臨床検査に基づいています。
食品の安全性のために、消化アッセイは肉3,7における旋毛虫幼虫の直接検出のための唯一の信頼性のある手順です。消化アッセイのいくつかのバリエーションがあっても、磁気攪拌方法は、国際的に認められた基準法3、4、7です。このアッセイは、横紋筋組織における旋毛虫の幼虫の検出に基づいています。筋肉サンプルとその後の濾過および沈殿段階の酵素消化した後、 トライchinella幼虫を顕微鏡で識別されます。貿易債務と国内法に応じて、磁気撹拌法の一般的なプロトコルの小さな変動が多数あります。ここでは、技術的な詳細は、EUの要件4、ISO仕様8、ICTガイドライン6、および寄生虫（EURLP）のための欧州連合（EU）のリファレンス研究所の経験や旋毛虫のためのドイツのリファレンスラボラトリーに基づいています。
Protocol
1.準備
- 試料捕集
注：磁気攪拌方法は、単一のまたはプールされた筋肉試料のために使用することができます。- 適切な好みのサイトからサンプルを収集し、適切な量の9インチ国の要件やICT、OIEやISOの勧告を参照してください。
- 欧州連合（EU）のために、例えば、国内の豚の筋張った部分への移行でダイアフラム柱から1グラムのサンプルを取ります。すべての筋肉サンプルは、すべての脂肪と筋膜の自由であることを確認してください。
- 舌がテストされている場合は、試験前に表面層を除去します。
- サンプルが凍結している場合は注意してください、ほとんどの旋毛虫の幼虫として耐凍結されていないと死の後ほどく、消化に耐性が低いと減少し、アッセイ感度が得られ、容器の壁に固執する傾向があります。
注：凍結した場合は、lのサンプルサイズを倍増沈降時間を東と増加（下記参照）。
- 適切な好みのサイトからサンプルを収集し、適切な量の9インチ国の要件やICT、OIEやISOの勧告を参照してください。
- 消化液の調製
- 3Lのガラスビーカーに48°C - 46で予熱水道水の2リットルに25％塩酸（16±0.5ミリリットル）を追加します。不完全消化の温度結果の低すぎます。温度が高すぎるペプシンの酵素特性を無効にします。
- ビーカーに攪拌棒を置き、予熱したプレート上のソリューション攪拌（46から48°C）を。
- （1：10,000 NF、1：12,500 BP、2000 FIP 1）酸性溶液にペプシンの10±0.2グラムを追加します。
注：ペプシンの品質が最も重要と酵素活性がプロデューサーによって認定されなければならないのです。実験室の安全上の理由及びペプシン活性を維持するために、消化液の成分を添加する順序は、に付着されなければなりません。
- 筋肉試料調製
- ブレンダーやグラインダーで筋肉サンプルの100グラムに切り刻みます。 BLENを容易にするために鼎は、サンプルに2 mLの水を予熱追加し、2のための最大速度でブレンド - 3秒。
- 第二ブレンドする前に、ブレンダーを開き、下部にブレンドボウルエッジマージンの一番上にある任意の筋肉のサンプルを転送し、ブレンド繰り返します。肉の目に見える片がなくなるまで3秒 - 2のバーストとブレンド進みます。
注：あまりにも多くのブレンドは、サンプル6における旋毛虫の幼虫の存在を損傷することができますが少なすぎるとブレンドは、不完全な消化をもたらす可能性があります。
2.手順
- マッスルサンプル消化
- シリンダ内に消化液の1 Lを転送します。ビーカーにひき肉を移し、スプーンやフォークでの消化液に広めます。徹底的に3Lのビーカーに予熱した消化液500mLでブレンダーの蓋、ブレードとブレンダーボウルをすすぎます。
注：不完全なすすぎは、SENSの損失につながることができますitivity。 - アルミホイルでビーカーを覆い、44の一定温度に保つ - 46°Cを、温度計を監視します。
- 肉粒子が消えるまで飛散することなく、深い渦を作成するために、30分間の消化液を攪拌します。試験された肉の種類（野生動物の肉など ）に応じて、60分の最大まで消化時間を増加させます。
- シリンダ内に消化液の1 Lを転送します。ビーカーにひき肉を移し、スプーンやフォークでの消化液に広めます。徹底的に3Lのビーカーに予熱した消化液500mLでブレンダーの蓋、ブレードとブレンダーボウルをすすぎます。
- 濾過および消化液の沈降
- 未消化組織の量を決定するために、ゼロにスケールを調整し、使用前にふるいを計量し、その重量に注意してください。ふるいは、沈降漏斗に到達する旋毛虫の幼虫を妨げる可能性があり、清潔で、任意の組織粒子を欠いているでなければなりません。分離漏斗を垂直に平準化されていることを確認してください。
- 消化後、慎重に分離ガラス漏斗に180μmの篩を通して消化液を注ぎます。分離ガラス漏斗の幅はbはしないでください良い幼虫の沈降を可能にする長さの55％よりも電子も大きいです。任意のオーバーフローを避けるように注意してください。
- 感度の損失を回避するために、徹底的にスクイズ洗浄瓶から水道水の約200ミリリットルのガラスビーカーやふるいをすすぎ、沈降ガラス漏斗にすすぎ水を移します。慎重に3リットルのビーカーの縁を洗浄するために注意してください。ふるいを持ち上げて、徹底的にふるい下の面積をすすぎます。
- 未消化組織量の決意
注：メソッドの実行中にエラーが原因で、筋肉組織が十分に筋膜と難消化性である結合組織として、篩上に残ることができます。未消化組織の量は、最初の10分間の沈降段階（2.5参照）の間に決定されます。残留水は、未消化の組織の決定された重量に影響を与えることができるので、これは、ふるいを乾燥させるために約30分を許可します。- 規模で紙タオルを置き、undigesでふるいの重量を量りますテッド組織。
- 未消化の組織とのふるい重量からろ過する前にふるいの重量を引きます。出発試料の重量の5％以下がふるい（ 即ち 、5 gで/ 100gで、出発物質）のままであれば、消化プロセスが十分考えられます。
- 未消化組織の量が5％を超える場合は、新鮮な筋肉サンプルを使用してテストを繰り返して。残りの組織は、主に未消化の筋肉組織と新鮮なサンプルで構成されている場合は利用できません、再び未消化の遺骨を消化し、元のサンプルに加えて調べます。
- 消化液の沈降
- 30分間分液漏斗中で濾過消化液を保管してください。放置した場合、 旋毛虫の幼虫は、漏斗の底に沈降します。
- 凍結したサンプルを使用する場合、60分の最大沈降時間を増加させます。
- 沈降が完了したら、完全にストップコックを開き、（筋肉サンプルは、以前に凍結していた場合は80 mL）で消化液の少なくとも40 mLの迅速測定シリンダーにオフに実行させるための分液漏斗の。
- まず、シリンダ内に流体の半分をさせ、その後、完全に消化液10mLを通過できるように反対方向にコックを開きます。最後に、別の10 mLのための反対方向にコックを開きます。この手順は、 旋毛虫の幼虫は、活栓の中に閉じ込めていないことを保証します。
注：十分な速度、感度を低下させる、分液漏斗中に残っている幼虫を回避するために必要とされます。
- シリンダ内の消化液の沈降
- 幼虫が沈降することを可能にするために10分間シリンダー内の堆積物を残します。 10 mLの堆積物を乱すことなくピペットで吸引することにより、30 mLの上清を取り除きます。
- 試料中の組織の繊維の量を減少させるために、沈殿物を30mLの水道水を追加し、さらに10メートル残します液体が透明になるまでに。繰り返します。
- 上清を除去し、10 mLのを転送するグリッドペトリ皿や幼虫計数盆地に堆積物を洗浄しました。 10mLの水道水でシリンダーを洗浄した後、サンプルに水を追加します。
注：サンプル中の破片の大量旋毛虫幼虫 （ 図1）の識別を防止することができるように必要であれば、さらなる洗浄工程が行われるべきです。
- 顕微鏡検査
- すぐに洗浄工程後の試料を検査するために15 20Xの倍率で調節可能な強度のサブステージ送信光源とtrichinoscopeまたはステレオ顕微鏡を使用してください。
- グリッドペトリ皿に試料を注いだ後、グリッドによって系統的グリッドディッシュ/盆地を調べます。何の容疑者構造が見つからない場合は、静かに任意の旋毛虫ラを可能にするために、循環方式でグリッド化ペトリ皿や幼虫計数流域内の流体を移動させます潜在的に見過ごされたrvaeは、ペトリ皿の中心に蓄積します。検査を繰り返します。
- 100X - 疑わしい構造が見つかった場合、40に倍率を上げます。ピペットでシャーレ/盆地から旋毛虫の幼虫を削除し、90％エタノールでチューブに集めます。
- 完全な皿が検討された後、シャーレ/盆地の穏やかに振盪から出発し、手順を繰り返します。少なくとも3回、またはそれ以上の幼虫までの手順を繰り返します発見されました。
- 幼虫の数をカウントします。筋組織の量に相関は、試験の結果、グラム（LPG）あたりの幼虫として存在します。
- あまりにも多くの幼虫が確実に幼虫の数を決定するために、消化液中に存在している場合は、メスシリンダーに幼虫を含む流体を返すスクイーズ洗浄瓶から水道水ですすぎ、そして底に沈殿する幼虫を残します。
- 10分間の沈降時間の後、所定容量の上清を低減する（ 例えば10mL）で。正確な量を決定するために、ピペットで新しいシリンダーに上清を移します。
- 激しく振盪による流体に均一に幼虫を一時停止します。揺れ運動中に、ペトリ皿に20μLの幼虫の懸濁液の12滴を追加します。
- 顕微鏡で各液滴を調べます。 240μL中の幼虫の数を決定し、最高と最低のカウントを削除します。上清の総容量（ 例えば 10ミリリットル）に幼虫の数を推定。
注：ステレオ顕微鏡の品質は、 旋毛虫幼虫の同定のために最も重要です。 - 幼虫はピペットでチューブに回収された場合、幼虫はピペット壁に固執しませんでしたが、チューブに移していることを慎重に確認してください。
注：プールされたサンプルからの正旋毛虫の発見は、起源のカーカスに戻ってプールからトレースする必要があります。正の死体がアイデンなるまでここでは、プールのサイズを徐々に減少させるべきですtified。サンプルサイズはまた、感度を高めるために、このプロセスの間に増加することができます。集団サンプルの検査が陽性または不確実な結果を生成する場合には、さらに20グラムのサンプルは、各ブタから採取されます。 5匹のブタから20gのサンプルをプールし、記載された方法を用いて検査されます。このように5匹のブタの20グループからのサンプルを検討します。 旋毛虫は 5匹のブタからのプールされた試料中に検出されたときに、20gのサンプルは、グループ内の個々のブタから収集され、原点のプラスのカーカスが検出されるまで、それぞれを別々に検討します。
Representative Results
消化の後、感染性筋幼虫の形状は、識別をより困難に、変えることができます。典型的な形はしっかり巻か幼虫、軽くコイル状幼虫またはC字形または完全に解か幼虫（ - 2C図2B）が挙げられます。グラム当たり見つかった幼虫の数は大幅に変えることができ、1幼虫から数百幼虫の範囲とすることができます。
感染筋幼虫の形態は、 図2Aに示されています。 旋毛虫の幼虫長く、幅約0.3ミリメートル0.7〜1.5mmです。食道が狭く、わずかに丸みを帯びた端部を有します。キューティクルがスムーズです。体腔、stichosomeの前半では、構造は、45〜55大細胞（stichocytes）の列に囲ま細長い管から構成され、観察することができます。直腸は、任意の突起なしにも丸みを帯びているか、10、11の付属します。
トン">その他の構成は、 旋毛虫の幼虫のほか、筋肉の消化後に見つけることができるいくつかの例は、 図3Aに示されている- 。。3F野生動物は、多くの場合、他の寄生虫に感染しているか、テストのために利用可能な筋肉サンプルは、アニメーションによって摘出プロセス中に汚染されていますまたは構造/生物無生物。幼虫の長さは、前部と後部の外観が終了し、stichosomeヘルプの発生が異なる線虫属12を区別します。
図1：（A） が不足し、（B）、十分なすすぎ工程後旋毛虫幼虫の顕微鏡検査。スケールバーは100μmで示しています。 大きい方がまし表示するには、こちらをクリックしてください。この図のrsion。
図2： 感染性旋毛虫幼虫の形態は、幼虫（A）の直腸、Stichosomeと食道を表示しています。 （B）きつく巻かれ、軽く幼虫と（C）の移動コイル状を示す消化後の筋肉の幼虫の可能な形状は、幼虫を解か。スケールバーは100μmで示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： マグネティックスターラー法による筋サンプルの消化後の偶発病変の例。 （A）の毛のような毛イノシシで見つかったミミズ。 （B）イノシシからAlariaアラタ 。 （C）イノシシから筋線維。 （D） ブタ肺虫属のsp。イノシシから。イノシシ（F）に見られる（E）植物繊維： 回虫属 。イノシシから幼虫。スケールバーは100μmで示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
磁気撹拌法を容易に行うことができますが、厳密に技術的な詳細に付着していないと、このように消費者の健康を危険にさらす、感度不足につながります。重要管理点は、上記のテキストで強調表示されています。また、適切な機器の使用は、テストの成功した結果のために重要です。すべての血管が表面に幼虫の付着を低減するために、シリコンでコーティングされたガラスピペットの先端で作られるべきです。
消化法の感度は、筋肉の幼虫密度とテストした筋肉試料の量に依存します。 3の幼虫密度について-筋肉組織の5 LPG、100％の感度が報告されたが、1 LPGの下の感度は40％13に低下しました。試験された宿主動物種に応じて、試験の感度は、使用されるサンプルの量を増加させることによって改善することができます。私野生生物におけるnfection負担は、したがって、より大きなサンプルサイズが14を使用している、通常低いです。好発部位はまた、宿主動物によって異なります。ここでは、そのような舌のようないくつかの筋肉組織の下部消化は、より大きなサンプルサイズ15をもたらすことができ、考慮される必要があります。
また、磁気撹拌法は、内部統制が含まれていないことを理解することが重要です。したがって、ドキュメントへのサンプリングから、品質保証管理が正確かつ正確な結果を得ることが不可欠です。筋肉試料中の旋毛虫の幼虫を検出するための実験室での性能の品質は、習熟度テストで各アナリストの定期的な参加によって監視されるべきです。
方法のさらなる制限は、顕微鏡による筋肉の幼虫の最終識別ステージは非常に主観的とょんであること、調べアナリストによる幼虫の形態の知識にvily依存。
この問題を回避するための興味深い代替法は、ラテックス凝集試験によって幼虫検出したフィルタの分離に磁気攪拌方法/です。しかし、EUの法律に従って、この方法は、そのようなイノシシ4として、国内の豚のではなく、感染のリスクが高い動物用食肉のテストのために同等とみなされています。モノクローナル抗体を用いた幼虫抗原の同定は、試験より客観的になりますが、研究室に肉16グラム当たり幼虫の数を決定する可能性を否定しています。
磁気攪拌方法のさらなるバリエーションは、機械的補助プールされた試料分解法/沈降技術、機械的補助プールしたサンプルの発掘を含みますフィルタ分離技術、および最大35グラムの技術のプールされたサンプルの自動消化法上のestion法/。これらの技術は、すべての肉や旋毛虫の幼虫の視覚化および計数の人工消化に基づいていますが、濾過および沈殿の工程に使用される装置が異なるされています。
孤立した幼虫は、さらに分子検査（ 例えば 、マルチプレックスPCR）17によって種レベルで同定することができます。 EU法によると、全ての陽性サンプルは、 旋毛虫種の決意のための国家リファレンス研究施設やEURLPに転送する必要があります。
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは親切に優れた技術支援やサポートのためのザビーネReckingerに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knife, Scissors, Tweezers | Cutting samples and removing non-digestible tissue | ||
| Blender | With a sharp chopping blade | ||
| Magnetic stirrer | With thermostatically controlled heating plate | ||
| Stirring Rod | Teflon-coated, approximately 5 cm long | ||
| Conical glass separation funnel | Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation. | ||
| Stands, rings and clamps | |||
| Sieve | Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh | ||
| Funnel | Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves | ||
| Glass beaker | Capacity 3 L | ||
| Glass measuring cylinder | Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube | ||
| Stereo-microscope | With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table | ||
| Petri dishes | 9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope | ||
| Aluminium foil | Alternatively a lid to cover the beakers | ||
| 25% hydrochloric acid | |||
| Pepsin | Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL | ||
| Ethanol | 70-90% ethyl alcohol | ||
| Tap water | Heated to 46-48 °C before use | ||
| Balance | Accurate to at least 0.1 g | ||
| Metal tray | Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice | ||
| Pipettes and pipette holder | Different sizes (1, 10 and 25 mL) | ||
| Thermometer | Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C | ||
| Siphon | For tap water |
References
- Gottstein, B., Pozio, E., Nöckler, K. Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis. Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).
- Pozio, E., Murrell, D. K. Systematics and epidemiology of Trichinella. Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).
- OIE World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. OIE Terrestrial Manual. , Available from: http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf 1-16 (2013).
- European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2015/1375 of 10 August 2015 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat. Off. J. EU. 212, Available from: http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375 7-34 (2015).
- United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. 9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf (2012).
- Gamble, H. R., et al. International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).
- Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis. Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).
- ISO. Microbiology of the food chain -- Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method 18743. ISO. , Available from: http://www.iso.org/ (2015).
- Nöckler, K., Kapel, C. M. O. Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation. FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. , World Organization for Animal Health (OIE). Paris. 69-98 (2007).
- Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. Veterinärmedizinische Parasitologie. , Parey Verlag. Stuttgart. 6. Aufl (2006).
- Despommier, D. D., Müller, M. The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis. J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).
- Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion. Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).
- Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat. J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).
- Malakauskas, A., et al. Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia. Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).
- Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife. Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).
- Interisano, M., et al. Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs. Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).
- Pozio, E., La Rosa,, G, PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples. Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).
