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Developmental Biology

परिभाषित किया है और मानव स्टेम कोशिकाओं से Hepatocyte कोशिकाओं की तरह की स्केलेबल जनरेशन

Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/55355
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

Summary

यहाँ प्रस्तुत विधि एक स्केलेबल और अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) -ready भेदभाव प्रणाली का वर्णन स्टेम कोशिकाओं से मानव hepatocyte तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। यह बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए मानव यकृत मानव hepatocyte तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक लागत प्रभावी और मानकीकृत प्रणाली के रूप में कार्य करता है।

Abstract

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए महान मूल्य के पास है। hPSCs पहुंचा और सभी प्रकार की कोशिकाओं से मानव शरीर में पाए जाने वाले के लिए भेदभाव किया जा सकता है। मानव hepatocyte कोशिकाओं की तरह (HLCS) को hPSCs के भेदभाव को बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और कुशल भेदभाव प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, और छोटे अणुओं सहित जैविक उत्तेजनाओं, का संयोजन यह संभव HLCS कि प्राथमिक मानव hepatocytes सदृश उत्पन्न करने के लिए बनाया है। हालांकि, प्रक्रियाओं का बहुमत अभी भी अपरिभाषित घटकों को रोजगार, बैच को बैच बदलाव को जन्म दे रही है। इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में कार्य करता है। इस मुद्दे से निपटने के लिए, हम एक सीरम मुक्त भेदभाव प्रक्रिया के साथ संयोजन में कोशिकी matrices के रूप में मानव पुनः संयोजक laminins का उपयोग कर hepatocyte भेदभाव के लिए एक परिभाषित प्रणाली विकसित की है। अत्यधिक कुशल hepatocyte विनिर्देश डी के साथ हासिल की थी,दोनों एचएलसी समारोह और phenotype में सुधार monstrated। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के अनुसंधान और जीएमपी ग्रेड hPSC लाइनों सेल आधारित मॉडलिंग और उपचारों में होनहार अग्रिमों का उपयोग कर पैमाने पर करने के लिए आसान है।

Introduction

प्राथमिक मानव ऊतक और व्युत्पन्न सेल प्रकार नियमित रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, दोनों सेल आधारित स्क्रीनिंग के लिए और क्लिनिक में। हालांकि, इन कोशिकाओं के लिए उपयोग गंभीर रूप से अपर्याप्त अंग दान और सेल phenotypes के बाद अलगाव 1 की कमी के कारण सीमित है। hPSCs प्राथमिक ऊतक के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं और आनुवंशिक रूप से परिभाषित किया है और अक्षय मानव दैहिक कोशिकाओं की पीढ़ी की सुविधा। Hepatocyte कोशिकाओं की तरह (HLCS) hPSCs से निकाली गई पहले से ही इस क्षेत्र में वादा दिखाया है। HLCS विभिन्न पहलुओं के बारे में प्राथमिक मानव hepatocytes, सेल आकृति विज्ञान, hepatocyte जीन अभिव्यक्ति, चयापचय समारोह, और संवेदनशीलता दवाओं और वायरस 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 सहित जैसे लगते हैं। इसके अलावा, असीमित प्रसार औरदोनों शोध और जीएमपी ग्रेड hPSCs की आत्म नवीकरण क्षमता उनके आवेदन 9, 10 की सुविधा।

अनुसंधान के एक दशक के दौरान कुशल hepatocyte भेदभाव प्रक्रियाओं 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 के एक नंबर का उत्पादन किया गया। हालांकि, इन प्रणालियों के सबसे अपरिभाषित घटकों और / या वायरल पारगमन का उपयोग हेपैटोसेलुलर विनिर्देश ड्राइव करने के लिए। बड़े पैमाने पर प्रौद्योगिकी की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यह एक मजबूत hepatocyte भेदभाव को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रणाली है कि वास्तव में परिभाषित किया, Xeno मुक्त, और जीएमपी-संगत।

Laminins (LNS) महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन है कि कोशिका आसंजन, प्रसार, प्रवास, और भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं। Laminins heterotrimeric एक α, एक β, और एक γ श्रृंखला से बना ग्लाइकोप्रोटीन हैं। हाल ही में, पुनः संयोजक मानव laminins उत्पादन किया है और कोशिका जीव विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है। LN-511, hPSCs 21 के रखरखाव का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है, जबकि LN-521 और ई cadherin का एक मिश्रण प्रतिरूप व्युत्पत्ति और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 22 के विस्तार की अनुमति देता है। LN-111, दूसरे हाथ पर, hPSCs 23 से निकाली गई hepatoblast कोशिकाओं की तरह के रखरखाव का समर्थन करता है। हालांकि, हमारी रिपोर्ट से पहले, 521 और 111 laminins hPSCs 10 से परिपक्व विशेषताओं के साथ HLCS उत्पन्न करने के लिए उपयोग नहीं किया गया था।

यहाँ, हम विस्तार LN-521 पर hPSCs संवर्धन के लिए प्रक्रियाओंऔर उन पर फर्क तो LN-521 या LN-521 और LN-111 (एल.एन.-521 / LN-111) का एक मिश्रण। हम एकल कोशिका बोने का उपयोग कर कई स्वरूपों में 14 HLCS की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और समरूप monolayer उत्पन्न करने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल अनुकूलित। हम मानते हैं कि हमारे परिभाषित भेदभाव प्रणाली के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करने, आवेदन के लिए सक्रिय HLCS निर्माण करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका का प्रतिनिधित्व करता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों के लिए वेंडर जानकारी तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है। जब कोशिकाओं को उन लोगों के साथ सीधे संपर्क किया है के लिए कर रहे सभी मीडिया / प्लेटें बाँझ और कम से कम कमरे के तापमान पर होना चाहिए।

1. Passaging मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) Laminin 521 पर

नोट: सेल passaging प्रक्रिया नीचे वर्णित एकल कक्षों पर आधारित है और hPSCs से hepatocyte कोशिकाओं की तरह का एक समरूप जनसंख्या की व्युत्पत्ति के लिए आदर्श है। कॉलोनी चढ़ाना भी लागू है और पहले 24 में वर्णित किया गया है।

  1. जरूरत के रूप में laminin लेपित प्लेटों की तैयारी।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर पुनः संयोजक laminin 521 (एल.एन.-521) के 100 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर गला लें।
    2. ठंडा 1x DPBS में thawed LN-521 पतला (सीए 2 के साथ / 2 मिलीग्राम +) एक 5 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए।
    3. 5 माइक्रोग्राम के 1 एमएल जोड़ें / एमएल LN-521 कोट करने के लिए समाधान के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह सेऔर रॉक यह समान रूप से अच्छी तरह से फैल गया।
    4. तत्काल उपयोग के लिए या रात एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 4 घंटे के लिए - 2 के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 के सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं।
    5. एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टोर laminin लेपित प्लेटों के रूप में की आवश्यकता है। एक सपाट सतह पर प्लेटों रखें और उन्हें सील वाष्पीकरण और प्रदूषण से बचने के लिए।
      नोट: ऐसा कभी नहीं लेपित कुओं बाहर सूखी; उन्हें शीर्ष अतिरिक्त 1x DPBS यदि आवश्यक (सीए 2/2 मिलीग्राम +) के साथ के साथ। 2 सप्ताह के भीतर प्लेटों का प्रयोग करें।
  2. 1 घंटे - पूर्व में लिपटे प्लेटों के लिए आवश्यक संख्या 0.5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान तक पहुंचने या प्लेटों सेते दें।
  3. ध्यान से लेपित सतह को नुकसान पहुँचाए बिना कोटिंग LN-521 समाधान aspirate। नोट: यह इस पर कोशिकाओं बोने से पहले लेपित सतह को नुकसान नहीं महत्वपूर्ण है।
  4. इसके तत्काल बाद पूर्व गर्म-mTeSR1 मध्यम 10 माइक्रोन रो-जुड़े काइनेज (रॉक) अवरोध Y2 के साथ पूरक के 1 एमएल जोड़ने7632 से एक 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से करने के लिए। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में थाली छोड़ दो कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए।
    नोट: laminin लेपित कुओं शुष्क करने की अनुमति कभी नहीं।
  5. के बारे में 75% से 85% confluency पर अच्छी तरह से बनाए hPSCs से मध्यम aspirate। कमरे के तापमान 1x DPBS के 1 एमएल (कोई सीए 2/2 मिलीग्राम +) के साथ एक बार एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को धो लें।
  6. 1x Accutase के 0.5 एमएल कोशिकाओं को जोड़ने और 6 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - 8 मिनट कोशिकाओं को अलग कर देना।
    नोट: चाहे पाचन काफी लंबे समय से है या नहीं की जाँच करने के लिए, धीरे थाली नल और जाँच कोशिकाओं को आसानी से अलग कर सकते हैं। यदि हाँ, तो यह enzymatic प्रतिक्रिया को रोकने के लिए समय है; 2 मिनट - नहीं तो, एक अतिरिक्त 1 के लिए पाचन का विस्तार।
  7. ताजा mTeSR1 के माध्यम से 2 एमएल 10 माइक्रोन कोशिकाओं को Y27632 के साथ पूरक जोड़कर हदबंदी बर्खास्त। पिपेट और एक P1000 टिप कई बार एक एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए उपयोग कर नीचे।
  8. एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।मृत कोशिकाओं को 14 दाग को Trypan नीले रंग का उपयोग और बाहर
  9. जरूरत कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना। दिनचर्या hPSC passaging के लिए, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 4 x 10 5 5 5 x 10 कोशिकाओं के बीज (यानी, 4.21 x 10 4 5.26 x 10 4 2 सेमी प्रति के लिए)। Hepatocyte भेदभाव के लिए hPSCs passaging के लिए, 6.5 x 10 5 को 7.5 x 10 5 (यानी, 6.84 x 10 x 7.89 10 4 2 सेमी प्रति 4) 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं बीज।
    नोट: प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए बोने घनत्व यहाँ यकृत भेदभाव के लिए दिए गए अनुभवजन्य घनत्व के आधार पर मामूली अनुकूलन की जरूरत हो सकती है।
  10. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 115 XG पर एक बाँझ 15 एमएल या 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में जरूरत सेल निलंबन स्थानांतरण।
  11. सतह पर तैरनेवाला धीरे धीरे Aspirate और फिर ताजा, गर्म mTeSR1 माध्यम के साथ 10 माइक्रोन रो-जुड़े काइनेज (रॉक) inhibito पूरक में सेल गोली resuspendआर Y27632, वांछित सेल घनत्व बनाने के लिए पर्याप्त माध्यम का उपयोग कर।
    नोट: रॉक अवरोध का उपयोग अत्यधिक क्रम में सेल लगाव और जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए सिफारिश की है।
  12. तैयार प्लेटों के लिए कोशिकाओं बीज और उन्हें आगे और पीछे और साइड रॉक समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए पक्ष की।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं कुओं में समान रूप से वितरित कर रहे हैं कि क्या प्लेट दिनचर्या सेल संस्कृति या hepatocyte भेदभाव प्रयोग के लिए है महत्वपूर्ण है।
  13. सेल इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस और उन्हें देते हैं और ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने।
  14. कोशिकाओं अगले दिन की जांच करने और रॉक अवरोध को वापस लेने, तो सेल सेल से संपर्क स्थापित किया गया है। या नियमित संस्कृति के लिए mTeSR1 माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने की जरूरत के रूप भेदभाव माध्यम के लिए स्विच।
    नोट: कोशिकाओं उल्लेख घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त थे, तो confluency नियमित रखरखाव या hepatocyte differentiatio के लिए आदर्श होना चाहिएएन।

2. संयोजक Laminins पर Hepatocyte कोशिकाओं की तरह करने के लिए hPSCs फर्क

  1. भेदभाव माध्यम से तैयार करें।
    1. मानव Activin एक शेयर समाधान करें: मानव Activin एक पाउडर बाँझ 0.2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) / DPBS में 100 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए भंग। छोटे aliquots बनाओ और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 1 पर प्रयोग करें: 1,000।
    2. माउस Wnt 3 ए शेयर समाधान करें: बाँझ 0.2% बीएसए / DPBS में एक 10 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान करने के लिए माउस Wnt 3 ए पाउडर भंग। छोटे aliquots बनाओ और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 1 पर प्रयोग करें: 200।
    3. मानव hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) स्टॉक समाधान करें: बाँझ 0.2% बीएसए / DPBS में एक 10 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए मानव HGF पाउडर भंग। छोटे aliquots बनाओ और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 1 पर प्रयोग करें: 1,000।
    4. Oncostatin एम (OSM) शेयर समाधान करें: बाँझ 0.2% बीएसए / DPBS में एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए भंग Oncostatin एम (OSM) पाउडर। छोटे aliquots और एस बनाओउन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर फाड़ दिया है। 1 पर प्रयोग करें: 1,000।
    5. एण्डोडर्म भड़काना शेयर माध्यम की 500 एमएल बनाओ: 2% B27 पूरक (50x, शून्य से विटामिन ए) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 आइयू / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल क्रमश अंतिम सांद्रता); 500 रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 (RPMI 1640) बेसल माध्यम का उपयोग कर एमएल के लिए ऊपर। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान और दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें। स्टॉक से विभाज्य मध्यम और प्रत्येक मध्यम परिवर्तन पर (100 एनजी / एमएल और 50 एनजी / एमएल क्रमश अंतिम सांद्रता) ताजा Activin ए और Wnt 3 ए जोड़ें।
    6. 80% नॉकआउट DMEM (KO-DMEM), 20% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (एस आर), 0.5% GlutaMAX, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 0.1 मिमी बीटा-mercaptoethanol: एस आर / DMSO भेदभाव माध्यम के 500 मिलीलीटर 1% DMSO, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 आइयू / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल क्रमश अंतिम सांद्रता)। वैक्यूम के अंतर्गत फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
    7. 1% जीएल: HepatoZYME परिपक्वता माध्यम की 500 एमएल बनाओutaMAX, 10 माइक्रोन के hydrocortisone 21-hemisuccinate सोडियम नमक (एचसीसी), और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 आइयू / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल क्रमश अंतिम सांद्रता); 500 HepatoZYME बेसल माध्यम का उपयोग कर एमएल के लिए ऊपर। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान और दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें। स्टॉक से विभाज्य मध्यम और मध्यम प्रत्येक बदलाव के लिए (10 एनजी / एमएल और 20 एनजी / एमएल क्रमश अंतिम सांद्रता) ताजा HGF और OSM जोड़ें।
  2. LN-521 पर hepatocyte भेदभाव के लिए बीज hPSCs, खंड 1 में वर्णित के रूप में तो LN-521 / LN-111 सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है, कोट LN-521 और एलएन-111 के साथ प्लेट: (1 3 के अनुपात) 5 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम laminin एकाग्रता; बाकी उपचार शुद्ध LN-521-लेपित प्लेटों के रूप में ही होना चाहिए।
    नोट: LN-521 / LN-111 hPSCs की दिनचर्या संस्कृति के लिए आदर्श नहीं है; यह केवल भेदभाव प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है।
  3. बोने के बाद सेल confluency 24 घंटे की जाँच करें। सेलुलर भेदभाव आरंभ एक बार सेल confluency के बारे में 40% तक पहुँचता है। आरबिताए mTeSR1 मध्यम निकालें और ताजा एण्डोडर्म भड़काना मध्यम 100 एनजी / एमएल Activin ए और 50 एनजी / एमएल Wnt 3 ए के साथ पूरक जोड़ें। इस भेदभाव दिन 1 बुलाओ।
    नोट: यह अत्यधिक कोशिकाओं बोने के बाद दिन भेदभाव आरंभ करने के लिए सिफारिश की है।
  4. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए 3 दिन (hESCs) के लिए एण्डोडर्म भड़काना मध्यम हर 24 घंटे के लिए परिवर्तित करें। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) का सवाल है, इस चरण 2 अधिक दिनों के लिए प्रधानमंत्री के लिए कोशिकाओं निश्चित एण्डोडर्म कोशिकाओं की तरह करने के लिए विस्तार, लेकिन एण्डोडर्म भड़काना मध्यम 100 एनजी के साथ ही पूरक का उपयोग करें / एमएल Activin एक इन दो दिनों के लिए 12 ।
    नोट: सफल एण्डोडर्म विनिर्देश सुनिश्चित करने के लिए ऐसे ही एक FOXA2 और SOX17 रूप endodermal मार्कर, की अभिव्यक्ति की जांच कर सकते हैं। immunofluorescence धुंधला के अनुसार, ली गई कोशिकाओं के 80% से अधिक हमारी प्रयोगशाला में दोनों मार्करों के लिए सकारात्मक रहे हैं।
  5. (HESCs के लिए) दिन 4 पर एस आर / DMSO भेदभाव माध्यम / (hiPSCs के लिए) 6 दिन के लिए स्विच करें। बदले मध्यम घपहले 3 दिनों के लिए और फिर इस भेदभाव चरण के पांचवें दिन aily।
    नोट: कोई खिला इस भेदभाव चरण के चौथे दिन पर की जरूरत है। अगर वहाँ कई मृत कोशिकाओं रहे हैं कोशिकाओं एक बार मध्यम परिवर्तन से पहले धोने के लिए unsupplemented KO-DMEM का प्रयोग करें। इस चरण के लिए भेदभाव सफल हुआ है कि क्या जाँच करें या नहीं करने के लिए, एक ऐसी एएफपी, CK19, और HNF4A के रूप में यकृत पूर्वज सेल मार्कर की अभिव्यक्ति का परीक्षण कर सकते हैं। कोशिकाओं के लगभग 90% ये हमारे अनुभव के आधार पर मार्कर के लिए सकारात्मक हो जाएगा।
  6. एस आर / DMSO भेदभाव चरण के 5 दिनों के बाद, HepatoZYME परिपक्वता चरण के लिए स्विच। एस आर / DMSO मध्यम हटाने के बाद सादे HepatoZYME बेसल मध्यम के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। HepatoZYME परिपक्वता मध्यम 10 एनजी / एमएल HGF और 20 एनजी / एमएल OSM के साथ पूरक जोड़ें।
  7. 10 दिन, पर जो बात कोशिकाओं मानक लक्षण वर्णन या आगे उपयोग के लिए तैयार हैं - 7 के लिए मध्यम हर 48 घंटे बदलें।
    नोट: Hepatocyte मार्कर अभिव्यक्ति परीक्षाओं, चयापचयसमारोह परीक्षण, यूरिया और एल्बुमिन स्राव परीक्षण, ग्लाइकोजन भंडारण परीक्षण, और Indocyanine ग्रीन (आईसीजी) तेज परीक्षण (जैसे साइटोक्रोम P450 गतिविधि के रूप में) विशिष्ट लक्षण वर्णन तरीके हैं।
    नोट: भेदभाव प्रोटोकॉल का समय चित्रा 5 में दिखाया गया है। हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से निकाली गई HLCS 'hepatocyte विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति के स्तर, एल्बुमिन स्राव, और साइटोक्रोम P450 (CYP) 3 ए और 1A2 गतिविधि की जाँच करें।

Representative Results

hPSCs से हेपैटोसेलुलर भेदभाव

एक मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन, H9, और एक मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल लाइन, 33D6, hepatocyte भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया गया। आंकड़े 1-3 में परिणाम, H9 कोशिकाओं से कर रहे हैं, जबकि चित्रा 4 में उन 33D6 कोशिकाओं से कर रहे हैं। एकल laminins पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं 24 घंटे के बाद सेल सेल से संपर्क स्थापित किया। कोशिकाओं को 40% confluency आसपास पहुंच जाने के बाद, भेदभाव की प्रक्रिया शुरू की गई थी (चित्रा 1 ए और चित्रा 4 क)। Laminins पर (दोनों LN-521 और एलएन-521 / LN-111), इन कोशिकाओं को अनुक्रमिक रूपात्मक परिवर्तन के माध्यम से चला गया और ध्रुवीकृत HLCS (चित्रा 1 और चित्रा -4 ए) को जन्म दिया।

Hepatocyte-तरह सेल विशेषता

दाy 18 HLCS एकत्र की है और प्रतिनिधि hepatocyte मार्कर, HNF4A और ALB (2A चित्रा) की अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया गया। दिन के 18 HLCS की Immunostaining से पता चला है कि कोशिकाओं का लगभग 90% HNF4α (चित्रा 2 बी) को व्यक्त किया। के रूप में ई-cadherin और एफ actin अभिव्यक्ति (चित्रा 2 बी) द्वारा चिह्नित इन कोशिकाओं, laminins पर ध्रुवीकृत और एक बहुभुज उपस्थिति का प्रदर्शन किया।

साइटोक्रोम P450 (CYP) गतिविधि भी मूल्यांकन किया गया था। CYP450s hepatocytes का एक महत्वपूर्ण चयापचय समारोह का आयोजन करेगा। ऐसे Matrigel, एल.एन.-521, या LN-521 / LN-111, के रूप में 18 दिन HLCS एक पतला प्रोटीन मिश्रण पर निकाली गई, CYP3A गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया। HLCS Matrigel पर से laminin substrates (चित्रा 3) पर काफी अधिक CYP3A गतिविधि का प्रदर्शन किया। महत्वपूर्ण बात है, जब यह वाणिज्यिक मानव प्राथमिक hepatocytes की तुलना में (HU1339) इन substrates पर पुन चढ़ाया, HLCS लगभग 10 गुना अधिक स्तर हैCYP3A गतिविधि में 10।

hiPSCs के भेदभाव hESCs के समान था। कोशिकाओं उपस्थिति (चित्रा 4 ए) में अनुक्रमिक परिवर्तन का प्रदर्शन किया। व्युत्पन्न HLCS एक महत्वपूर्ण hepatocyte प्रतिलेखन कारक, HNF4α (चित्रा 4 बी) व्यक्त की, और CYP3A गतिविधि और स्रावित एल्बुमिन (चित्रा 4C और डी) के पास थी। विशेष रूप से, 33D6 से निकाली गई HLCS निकाली गई HLCS (चित्रा 3) H9 कोशिकाओं की तुलना में कम हो CYP3A प्रदर्शित, लेकिन यह अभी भी मानव प्राथमिक hepatocytes 10 के बराबर था। हालांकि, इन HLCS की एल्बुमिन स्राव प्राथमिक hepatocytes 10 की तुलना में बहुत कम थी।

आकृति 1
चित्रा 1: यकृत भेदभाव के दौरान अनुक्रमिक morphological परिवर्तन। </ strong> (ए) undifferentiated hESCs वरीयता प्राप्त एकल कक्षों के रूप में 40% confluency के आसपास 24 घंटे बोने के बाद पहुंच गया। (बी) भड़काना के बाद, कोशिकाओं hepatoblast की तरह मंच तक पहुँचने पर 4. (सी) के दिन पर ठेठ endodermal आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया है, वे दिन 9. (डी) पर एक स्पष्ट polygonal आकार से पता चला परिपक्वता चरण के बाद, ध्रुवीकृत HLCS के लिए तैयार थे आगे लक्षण वर्णन दिन 18. स्केल बार = 200 माइक्रोन पर यहाँ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: HLCS की विशेषता। (ए) hepatocyte-विशिष्ट मार्करों के जीन की अभिव्यक्ति, HNF4A (बाएं) और ALB (दाएं)। अभिव्यक्ति के स्तर दिन 18 HLCS निकाली गई का उपयोग कर विश्लेषण किया गया थादोनों LN-521 और एलएन-521 / LN-111 पर hESCs से, और यह गृह व्यवस्था जीन GAPDH के लिए सामान्यीकृत था और hESCs के सापेक्ष व्यक्त किया। परिणाम तीन जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी <0.05, ** पी <0.01; unpaired टी परीक्षण। एक महत्वपूर्ण यकृत मार्कर, HNF4α, और ध्रुवीकरण मार्कर, ई cadherin और एफ actin (बी) प्रोटीन अभिव्यक्ति। 18 दिन LN-521 और एलएन-521 / LN-111 के ऊपर मार्करों के लिए दाग और Hoechst 33342. एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ counterstained पर HLCS इसी immunoglobulin जी (आईजीजी) के साथ प्रदर्शन किया गया था। HNF4α पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत और एसडी दिखाया गया है। यह दृश्य के चार यादृच्छिक क्षेत्रों से गणना की गई। छवियाँ 20X बढ़ाई पर ले जाया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: HLCS की चयापचय समारोह विशेषता। Matrigel (एमजी), एल.एन.-521, या LN-521 / LN-111 पर संवर्धित कोशिकाओं के CYP3A की साइटोक्रोम P450 गतिविधि परीक्षण किया गया था। डेटा तीन जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं SD। ** पी <0.01; एक तरह से एनोवा Tukey के बाद अस्थायी परीक्षण के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: HLCS के मानक विशेषता। LN-521 पर संवर्धित hiPSCs HLCS में भेदभाव कर रहे थे। स्टैंडर्ड लक्षण वर्णन परीक्षण 17 दिन HLCS पर प्रदर्शन किया गया। (ए) यकृत भेदभाव के दौरान कोशिकाओं के अनुक्रमिक आकृति विज्ञान; समय अंक दिखाए r दिन 1, 4, 9 पर epresent कोशिकाओं, और 17 (बी) HNF4α अभिव्यक्ति की Immunostaining। सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत और एसडी देखने के चार यादृच्छिक क्षेत्रों के आधार पर दिखाया गया है। छवियाँ 20X बढ़ाई पर ले जाया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी) 17 दिन HLCS पर CYP3A गतिविधि। डेटा छह जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि बार एसडी प्रतिनिधित्व करता है। संस्कृति में 24 घंटे से अधिक ली गई HLCS (डी) Albumin स्राव। डेटा चार जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि बार प्रतिनिधित्व एसडी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: भेदभाव प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध समय।टी = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

मानव स्टेम सेल अनुसंधान और ट्रांसलेशनल मेडिसीन Xeno मुक्त प्रणाली है कि वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास के दिशा-निर्देशों के लिए आवश्यक हैं के साथ पालन करने के लिए अग्रिम। किसी भी भेदभाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है। ईसीएम न केवल सेल लगाव का समर्थन करता है, लेकिन यह भी, कुंजी सिगनल कारकों तक पहुँच प्रदान करता सेल दृढ़ संकल्प और phenotype 25, 26 प्रभावित।

Laminins विवो में multifunctional बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन होते हैं। जिगर में, laminin स्राव एक आंशिक hepatectomy 27 के बाद जिगर के उत्थान के लिए महत्वपूर्ण है और यकृत पूर्वज सेल रखरखाव 28 के लिए आवश्यक है। जिगर के रखरखाव और उत्थान में laminins के महत्व को हमारे hepatocyte भेदभाव प्रणाली में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक मानव laminins के परीक्षण के लिए आधार था।

सुपीरियर वहpatocyte भेदभाव LN-521 और एलएन-521 / LN-111 substrates पर हासिल की थी जब Matrigel की तुलना में। व्युत्पन्न HLCS स्पष्ट रूप से ध्रुवीकरण कर रहे थे और डिश में आयोजन किया है, और जब उनके पतला प्रोटीन मिश्रण समकक्षों की तुलना में उनके सेलुलर समारोह में काफी सुधार हुआ है। इन सुधारों के अंतर्निहित, colon- contaminating के डाउनरेगुलेशन था fibroblast- और laminins पर सेल जुड़े जीन, साथ ही सेल प्रसार और प्रवास से जुड़े जीन अभिव्यक्ति 10 में कमी स्टेम।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल hepatocyte कोशिकाओं की तरह है कि वयस्क मानव hepatocytes करने के लिए प्रकृति में करीब हैं उत्पन्न करता है। प्रक्रिया, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्वचालन के लिए उत्तरदायी है, और लागत प्रभावी ढंग से आवेदन के लिए बढ़ाया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, बैच को बैच के परिवर्तन में महत्वपूर्ण तकनीक है कि Matrigel उपयोग करते हैं, इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक बेहतर भेदभाव प्रणाली में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में कम हो गया है।

Disclosures

डॉ डेविड सी घास का एक सह-संस्थापक और Stemnovate लिमिटेड के निदेशक है।

Acknowledgments

इस काम के लिए ब्रिटेन पुनर्योजी चिकित्सा मंच से पुरस्कार (एमआरसी एमआर / L022974 / 1 और एमआर / K026666 / 1) और एक चीन छात्रवृत्ति के साथ समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Human Recombinant Laminin 111 BioLamina LN111-02
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632  Sigma-Aldrich Y0503-1MG
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
DMSO Sigma-Aldrich D5879
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 05850
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Knockout DMEM Life Technologies 10829
HepatoZYME Life Technologies 17705
B27 supplement Life Technologies 12587-010
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
GlutaMax Life Technologies 35050
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
2-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Accutase Millipore SCR005
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133

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विकास जीवविज्ञान अंक 121 hepatocyte कोशिकाओं की तरह पुनः संयोजक laminins मानव स्टेम कोशिकाओं जीएमपी के लिए तैयार प्रणाली बड़े पैमाने अप दवा स्क्रीनिंग सेल थेरेपी
परिभाषित किया है और मानव स्टेम कोशिकाओं से Hepatocyte कोशिकाओं की तरह की स्केलेबल जनरेशन
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Wang, Y., Alhaque, S., Cameron, K., Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Hay, D. C. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (121), e55355, doi:10.3791/55355 (2017).

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