Summary
השיטה המוצגת כאן מתארת בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) להחזיק ערך רב למחקר ביו. hPSCs וניתן לשנותם בדיל לכל סוגי התאים נמצאים בגוף האדם. הבידול של hPSCs לתאי hepatocyte דמוי אדם (HLCs) נחקר בהרחבה, ופרוטוקולי בידול יעילים הוקמו. השילוב של תאי מטריקס וגירויים ביולוגיים, כוללים גורמי גדילה, ציטוקינים, ומולקולות קטנות, הפך אותו ניתן להפיק HLCs דומה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה. עם זאת, הרוב המכריע של הליכים עדיין להעסיק רכיבים בלתי מוגדרים, והוליד יצווה אל תצווה וריאציה. זה משמש כמחסום משמעותי ליישום של הטכנולוגיה. כדי להתמודד עם בעיה זו, פיתחנו מערכת מוגדרת לבידול hepatocyte באמצעות laminins רקומביננטי אנושי כמו מטריצות תאיים בשילוב עם תהליך התמיינות סרום ללא. מאוד מפרט hepatocyte ביותר הושג, עם דהmonstrated שיפור בתפקודי לבין פנוטיפ היא HLC. חשוב לציין, מערכת זו היא קלה בהיקף של עד באמצעות קווי hPSC מחקר GMP כיתה מקדמות מבטיח בדוגמנות מבוססת תאים וטיפולים.
Introduction
רקמה אנושית ראשונית ואת סוגי תאי נגזרים משמשים באופן קבוע, הוא להקרנה מבוססת תאים ו במרפאת. עם זאת, גישת התאים אלה מוגבלים קשה בשל תרומת איברים מספיק ואובדן פנוטיפים תא פוסט-בידוד 1. hPSCs מייצג אלטרנטיבה מבטיחה לרקמות ראשוניות להקל על הדור של תאי סומטיים אדם גנטי מוגדרים ומתחדשים. תאי Hepatocyte דמוי (HLCs) נגזרים hPSCs כבר הראו הבטחה בתחום זה. HLCs להידמות hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה בהיבטים שונים, כולל מורפולוגיה התא, ביטוי גנים hepatocyte, התפקוד המטבולי, ורגישות לתרופות ווירוסים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. בנוסף, ריבוי ללא הגבלהקיבולת התחדשות עצמית של שני hPSCs שחוקר ו- GMP הכיתה הופכת לפשוט בקש 9, 10.
יותר מעשור של מחקר פיק מספר נהלי בידול hepatocyte היעיל 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. עם זאת, רוב המערכות הללו להשתמש ברכיבים מוגדרים ו / או תמרה ויראלית לנהוג מפרט hepatocellular. כדי לשפר את האמינות של הטכנולוגיה בקנה המידה, חשוב לפתח בידול hepatocyte חזקמערכת מוגדרת באמת ונטול קסנו, ו- GMP תואם.
Laminins (LNs) הם חלבוני מטריצה חשובים תאיים שיכול להשפיע הידבקות תא, התפשטות, הגירה, והבחנה. Laminins הם גליקופרוטאינים heterotrimeric מורכב α אחד, β אחד, ושרשרת γ אחד. לאחרונה, laminins אנושי רקומביננטי הופקו ומשמש בביולוגיה של התא. LN-511 הוכחו לתמוך התחזוקה של hPSCs 21, תוך תערובת של LN-521 ו- E-cadherin מאפשרת גזירה משובטת והרחבה בתאי גזע עובריים אנושיים 22. LN-111, מצד שני, תומך בשמירה על תאי hepatoblast דמוי נגזר hPSCs 23. עם זאת, לפני הדו"ח שלנו, laminins 521 ו -111 לא נוצלו כדי ליצור HLCs עם מאפיינים בוגרים מ hPSCs 10.
כאן, אנו הליכים פרט עבור culturing hPSCs על LN-521ומבדל אותם משני LN-521 או תערובת של LN-521 לבין LN-111 (LN-521 / LN-111). אנחנו מותאמים פרוטוקול הבידול באמצעות זריעה מתחיל מתא בודד ליצור בשכבה לשחזור הומוגנית מאוד של HLCs בפורמטים רבים 14. אנו מאמינים כי מערכת הבידול המוגדרת שלנו מייצגת שיטה פשוטה וחסכונית לייצר HLCs הפעיל עבור יישום, מייצג צעד משמעותי קדימה בתחום.
Protocol
הערה: המידע על הספקים עבור כל חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1. כל כלי התקשורת / הצלחות צריכות להיות סטרילי לפחות בטמפרטורת חדר כשתא לבוא במגע ישיר איתם.
1. תאי גזע פלוריפוטנטיים Passaging האדם (hPSCs) על Laminin 521
הערה: ההליך passaging תא כמתואר להלן מבוסס על תאים בודדים והוא אידיאלי עבור הגזירה של אוכלוסייה הומוגנית של תאים דמויי hepatocyte מ hPSCs. ציפוי קולוני הוא גם החלים תואר בעבר 24.
- כן צלחות מצופה laminin לפי צורך.
- להפשיר את המניה 100 מיקרוגרם / מ"ל של laminin רקומביננטי 521 (LN-521) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לדלל את LN-521 מופשר ב DPBS 1x קר כקרח (עם Ca 2 + / Mg 2+) לבצע פתרון 5 מיקרוגרם / מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של 5 מיקרוגרם / מ"ל LN-521 הפתרון מעיל אחד טוב של צלחת 6-היטבורוק להפיץ אותו באופן שווה בתוך הבאר.
- דגירה הצלחות באינקובטור תרבות 37 ° C / 5% CO 2 תאים עבור 2 - 4 h לשימוש דחוף או במקרר 4 ° C. לילה.
- אחסן את צלחות מצופה laminin במקרר 4 ° C כנדרש. שמור את הצלחות על משטח שטוח לאטום אותם כדי למנוע אידוי וזיהום.
הערה: לעולם אל תניח הבארות המצופות להתייבש; הדף אותם עם תוספת 1x DPBS (עם Ca 2 + / Mg 2+) במידת הצורך. השתמש הצלחות בתוך 2 שבועות.
- אפשר את המספר הדרוש של צלחות מראש מצופה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש או דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס 0.5 - 1 ח.
- בזהירות לשאוב את פתרון LN-521 ציפוי מבלי לפגוע המשטח המצופה. הערה: זה קריטי לא לפגוע משטח המצופה לפני זריעת תאים על זה.
- מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום מראש חימם-mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר Rho הקשורים קינאז (ROCK) מעכב Y27632 לאחד גם צלחת 6 היטב. השאר את הצלחת בחממת תרבית תאים לקבל תאים.
הערה: לעולם אל תאפשר הבארות מצופות laminin להתייבש. - לשאוב את המדיום hPSCs מתוחזק היטב ב -75% עד 85% confluency על. שוטפים את התאים מן אחד טוב של צלחת 6-גם פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS 1x-בטמפרטורת החדר (לא Ca 2 + / Mg 2+).
- הוסף 0.5 מ"ל של 1x Accutase אל התאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 - 8 דקות כדי לנתק את התאים.
הערה: כדי לבדוק אם מערכת העיכול הוא מספיק זמן או לא, לטפוח בעדינות את הצלחת לבדוק אם התאים יכולים לנתק בקלות. אם כן, אז זה הזמן לעצור את התגובה האנזימטית; אם לא, להאריך את העיכול עבור 1 נוספת - 2 דקות. - לסיים את ניתוק על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום חדש mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר Y27632 אל התאים. עד פיפטה ומטה בעזרת טיפ P1000 מספר פעמים כדי לעשות השעית תא בודד.
- ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer.השתמש Trypan כחול כתם או לא לכלול תאים מתים 14
- חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים. לקבלת passaging hPSC שגרתית, זרע 4 x 10 5 5 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6-היטב (כלומר, 4.21 x 10 4 כדי 5.26 x 10 4 לס"מ 2). לקבלת passaging hPSCs לבידול hepatocyte, זרע 6.5 x 10 5 כדי 7.5 x 10 5 (כלומר, 6.84 x 10 4 כדי 7.89 x 10 4 לס"מ 2) תאים לכל גם צלחת 6 באר.
הערה: צפיפות הזריעה עבור כל קו תא עשויה להזדקק מבוססת אופטימיזציה קטין על הצפיפות האמפירית הניתנת כאן לבידול בכבד. - מעבירים את ההשעיה תא הדרוש לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל או 50 מ"ל סטרילי ו צנטריפוגות ב 115 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב supernatant לאט ולאחר מכן resuspend גלולה תא בינוני טרי, חם mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר קינאז Rho-משויך (ROCK) inhibitor Y27632, באמצעות מדיום נאות על מנת להפוך את צפיפות תאים הרצויה.
הערה: השימוש מעכב ROCK מומלץ מאוד כדי לשפר מצורף תא שיעור הישרדות. - זרעי התאים על הצלחות המוכנות ולנענע אותם הלוך ושוב לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה.
הערה: זה קריטי על מנת להבטיח כי תאים מופצים בצורה אחידה בתוך הבארות אם הצלחת היא לניסויי בידול תרבות או hepatocyte תא שיגרתי. - מניחים את הצלחות בחממה התא לשמור על התאים ב 37 ° C / 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף ולשחזר.
- בדוק את התאים למחרת ולסגת מעכב ROCK אם קשר תאי תאים כבר נקבע. לשמור על התאים במדיום mTeSR1 לתרבות שגרתית או לעבור בינוני בידול לפי הצורך.
הערה: אם התאים היו זורעים עם צפיפות כאמור, confluency צריך להיות אידיאלי עבור תחזוקה שוטפת או hepatocyte differentiation.
2. ההתמיינות hPSCs לתאים דמויי Hepatocyte על רקומביננטי Laminins
- כן בינוני בידול.
- הפוך פתרון המניות Activin בן אנוש: להמיס האדם Activin אבקת לבצע פתרון המניות 100 מיקרוגרם / מ"ל ב אלבומין סטרילי 0.2% שור (BSA) / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000.
- הפוך פתרון המניות 3a העכבר Wnt: לפזר אבקת 3a העכבר Wnt לעשות פתרון המניה 10 מיקרוגרם / מ"ל BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 200.
- הפוך גורם הגדילה hepatocyte האנושי פתרון המניות (HGF): לפזר אבקת HGF האדם לעשות פתרון המניה 10 מיקרוגרם / מ"ל BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן ולאחסן אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000.
- הפוך Oncostatin M (OSM) פתרון המניות: להמיס Oncostatin M (OSM) אבקת לבצע פתרון המניה 20 מיקרוגרם / מ"ל BSA 0.2% סטרילי / DPBS. הפוך aliquots קטן שלקרע אותם ב -20 ° C. השתמש ב 1: 1,000.
- הפוך 500 מ"ל של מדיום המניות שאיבה endoderm: 2% תוספת B27 (50x, מינוס ויטמין A) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה); הדף עד 500 מ"ל באמצעות רוזוול פארק הזיכרון מכון 1640 (RPMI 1640) בינוני הבסיס. הערה: אחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בינוני Aliquot הממלא ולהוסיף 3a Activin A ו- Wnt טרי (ריכוזים סופיים ב 100 ng / mL ו -50 ng / mL, בהתאמה) בכל שינוי בינוני.
- הפוך 500 מ"ל של מדיום בידול KSR / DMSO: 80% בנוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% נוקאאוט החלפת בסרום (KSR), 0.5% Glutamax, 1% חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA), 0.1 מ"מ בטא mercaptoethanol, 1% DMSO, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה). סנן תחת ואקום. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים.
- הפוך 500 מ"ל של מדיום התבגרות HepatoZYME: 1% GlutaMAX, 10 הידרוקורטיזון מיקרומטר מלח נתרן 21-hemisuccinate (HCC), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה); דף עד 500 מיליליטר באמצעות מדיום בסיס HepatoZYME. הערה: אחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בינוני Aliquot הממלא ולהוסיף HGF ו OSM הטריים (ריכוזים סופיים ב -10 ננוגרם / מיליליטר ו 20 ng / mL, בהתאמה) עבור כל שינוי בינוני.
- hPSCs זרע לבידול hepatocyte על LN-521, כמתואר בסעיף 1. אם LN-521 / LN-111 היא לשמש המצע, מעיל צלחות עם LN-521 לבין LN-111 (1: 3 יחס) ב ריכוז laminin הסופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל; טיפול היתר צריך להיות זהה צלחות מצופות LN 521 טהורות.
הערה: LN-521 / LN-111 אינו אידיאלי עבור תרבות שגרתית של hPSCs; זה משמש רק לצורך ניסויים בידול. - בדקו את התא confluency 24 שעות לאחר זריעה. ליזום התמיינות פעם confluency התא מגיע לכ -40%. Rסר המדיום mTeSR1 בילה ולהוסיף בינוני טרי שאיבה endoderm בתוספת 100 ng / mL Activin A ו- 50 ng / 3a Wnt מ"ל. קוראים הבחנה זו יום 1.
הערה: מומלץ מאוד ליזום את הבידול מחרתיים זריעת התאים. - שינוי המדיום יחול-endoderm כל 24 שעות במשך 3 ימים לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). באשר תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs), להאריך בשלב זה עבור 2 ימים נוספים כדי להתניע את התאים לתאי endoderm דמוי בבירור, אבל להשתמש במדיום שאיבה endoderm שיושלם רק עם 100 ננוגרם / מ"ל Activin A עבור יומיים אלה 12 .
הערה: כדי להבטיח מפרט endoderm מוצלח, אפשר לבחון את הביטוי של סמנים endodermal, כגון FOXA2 ו SOX17. לדברי מכתים immunofluorescence, מעל 80% של התאים שמקורם הם חיוביים הם סמנים במעבדה שלנו. - החלף ל בינוני בידול KSR / DMSO ביום 4 (עבור hESCs) / יום 6 (עבור hiPSCs). שינוי ד הבינוניaily במשך 3 הימים הראשונים ולאחר מכן ביום החמישי של שלב הבחנה זו.
הערה: אין האכלה נדרשת ביום הרביעי של שלב הבחנה זו. השתמש KO-DMEM unsupplemented כדי לשטוף את התאים פעם אחת לפני השינוי בינוני אם יש תאים מתים רבים. כדי לבדוק אם הבחנתי בשלב זה הוא מוצלח או לא, אפשר לבדוק את הביטוי של סמני תא אב בכבד, כגון סוכנות ידיעות צרפתית, CK19, ו HNF4A. קרוב ל -90% מכלל התאים יהיו חיוביים עבור סמנים אלה בהתבסס על הניסיון שלנו. - לאחר 5 ימים של שלב התמיינות KSR / DMSO, לעבור לשלב הבשל HepatoZYME. שוטף את התאים פעם עם מדיום בסיס רגיל HepatoZYME לאחר הסרת בינוני KSR / DMSO. להוסיף התבגרות HepatoZYME בתוספת בינוני עם 10 ng / mL HGF ו -20 ng / mL OSM.
- שנה את בינונית כל 48 שעות במשך 7 - 10 ימים, בשלב שבו התאים מוכנים לאפיון רגיל או לשימוש נוסף.
הערה: בדיקות ביטוי סמן Hepatocyte, מטבוליתבדיקות תפקודיות (כגון פעילות ציטוכרום P450), אוריאת בדיקות הפרשת אלבומין, בדיקות וחוות אחסון גליקוגן, וירוק Indocyanine בדיקות ספיגות (ICG) שיטות אפיון טיפוסיות.
הערה: ציר הזמן של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 5. במעבדה שלנו, אנו שגרתי לבדוק את רמות ביטוי סמן 'hepatocyte ספציפי HLCs נגזר, הפרשת אלבומין, ו ציטוכרום P450 (CYP) 3A ופעילות 1A2.
Representative Results
בידול hepatocellular מ hPSCs
שורת תאים עובריים אנושיים גזע אחת, H9, וקו תא גזע מושרים אדם אחד, 33D6, שימשו בידול hepatocyte. התוצאות במספרים 1-3 הם מתאי H9, בעוד אלה באיור 4 הם מתאי 33D6. תאים בודדים זורעים על laminins יצרו קשר תאי תאים לאחר 24 שעות. אחרי התאים הגיעו כ -40% confluency, את תהליך הבידול יזמה (איור 1A ו איור 4 א). ביום laminins (הן LN-521 לבין LN-521 / LN-111), תאים אלה עברו שינויים מורפולוגיים רציפים הולידו HLCs המקוטב (איור 1 והאיור 4A).
Hepatocyte דמוי אפיון נייד
Day 18 HLCs נאספו שלהם ונבחנת לגביהם ביטוי של סמנים hepatocyte נציג, HNF4A ו ALB (איור 2 א). Immunostaining של יום 18 HLCs הראה כי קרוב ל -90% מכלל התאים הביע HNF4α (איור 2 ב). תאים אלה מקוטבים על laminins והציגו מראה מצולעים, כמסומן על ידי E-cadherin וביטוי F- יקטין (איור 2 ב).
ציטוכרום P450 (CYP) פעילות הוערכה גם. CYP450s לערוך התפקוד המטבולי החשוב של hepatocytes. יום 18 HLCs נגזר על תערובת חלבון דביקה, כגון Matrigel, LN-521, או LN-521 / LN-111, נבדק לפעילות CYP3A. HLCs הפגין באופן משמעותי פעילות CYP3A גבוהה על מצעי laminin מאשר על matrigel (איור 3). חשוב לציין, בהשוואה hepatocytes העיקרי האדם מסחרי (HU1339) מחדש מצופה על מצעים אלה, יש HLCs כמעט 10 גבוה פי רמותשל CYP3A פעילות 10.
ההבחנה בין hiPSCs היה דומה לזה של hESCs. התאים מתגלים שינויים רציפים במראה (איור 4 א). HLCs נגזר הביעו גורם שעתוק hepatocyte מפתח, HNF4α (איור 4B), ובעל פעילות CYP3A ואלבומין מופרשים (איור 4C ו- D). יש לציין, HLCs נגזר 33D6 מוצג מופחת CYP3A בהשוואה לתאים H9 נגזר HLCs (איור 3), אבל זה עדיין היה דומה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה 10. עם זאת, הפרשת אלבומין של HLCs אלה היה נמוך בהרבה מאשר hepatocytes העיקרי 10.
איור 1: שינויי מורפולוגיים סדרתית במהלך ההתמיינות כבדיה. </ strong> (א) hESCs המובחן זורע כמו תאים בודדים הגיעו כ -40% confluency 24 שעות לאחר זריעה. (ב) לאחר תחול, תאים הציגו את מורפולוגיה endodermal הטיפוסית ביום 4. (ג) כשמגיעים לשלב כמו-hepatoblast, הם הראו צורה מצולעים ברורה ביום 9. (ד) לאחר שלב ההתבגרות, HLCs המקוטב היו מוכן אפיון נוסף שמוצג כאן ביום 18. בר סולם = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אפיון של HLCs. (א) התבטאות גנים של סמנים ספציפיים hepatocyte, HNF4A (משמאל) ALB (מימין). רמת הביטוי נותחה באמצעות יום 18 HLCs נגזר מ hESCs משני LN-521 לבין LN-521 / LN-111, וזה היה מנורמל GAPDH גן משק והביע ביחס hESCs. התוצאות ייצג שלושה משכפל ביולוגי, ואת ברי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). * P <0.05, ** p <0.01; מבחן t מזווג. (ב) ביטוי חלבון של סמן כבד מפתח, HNF4α, וסמני קיטוב, E-cadherin ו- F יקטין. HLCs יום 18 על LN-521 לבין LN-521 / LN-111 היו מוכתמים עבור הסמנים לעיל counterstained עם Hoechst 33342. כביקורת שלילית בוצע עם אימונוגלובולינים המקבילים G (IgG). אחוז התאים HNF4α החיוביים ואת SD מוצג. זה חושב מתוך ארבעה שדות אקראיים. תמונות צולמו בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.within-page = "1"> 
איור 3: אפיון התפקוד המטבולי של HLCs. פעילות ציטוכרום P450 של CYP3A של תאים בתרבית על Matrigel (MG), LN-521, או LN-521 / LN-111 נבדק. הנתונים מייצגים שלושה משכפל ביולוגי, ואת ברי השגיאה מייצגים SD. ** P <0.01; חד סטרי ANOVA עם מבחן פוסט הוק של Tukey. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון תקן של HLCs. hiPSCs בתרבית על LN-521 הובדלו לתוך HLCs. בדיקות אפיון תקן בוצעו ביום 17 HLCs. (א) המורפולוגיה הרציפה של התאים במהלך בידול כבד; נקודות הזמן שמוצג r תאי epresent בימים 1, 4, 9, ו -17 (ב) Immunostaining ביטוי HNF4α. אחוז התאים החיוביים ואת SD מוצג מבוססים על ארבעה שדות אקראיים. תמונות צולמו בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) פעילות CYP3A ביום 17 HLCs. הנתונים מייצגים שש ביולוגי משכפלים, ובר השגיאה מייצג את SD. (ד) הפרשת אלבומין של HLCs נגזר על 24 שעות בתרבות. הנתונים מייצגים ארבעה ביולוגי משכפלים, ובר השגיאה מייצג SD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: ציר זמן סכמטי של פרוטוקול הבידול.t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כדי לקדם את המחקר בתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם ורפואת translational, מערכות ללא קסנו אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות ייצור נאותות נוכחיות נדרשות. המפתח לכל תהליך הבידול הוא תאי מטריקס (ECM). ה ECM לא רק תומך מצורף תא, אלא גם מספק גישה לגורמי איתות מפתח, המשפיע תא נחישות פנוטיפ 25, 26.
Laminins הם חלבוני מטריצה רבים תכליתיים תאיים in vivo. בכבד, הפרשת laminin היא קריטית עבור התחדשות כבדה לאחר כריתה חלקית 27 והוא נחוץ לצורך תחזוקת תאים ובתאים בכבדים 28. חשיבותה של laminins בתחזוקה כבדה והתחדשות הייתה הבסיס לבדיקה זמין מסחרי laminins האנושי רקומביננטי במערכת בידול hepatocyte שלנו.
Superior הואבידול patocyte הושג על LN-521 לבין LN-521 / LN-111 מצעים בהשוואת Matrigel. HLCs נגזר היו מקוטב ברורים ומאורגן בצלחת, ותפקוד הסלולר שלהם השתפר באופן משמעותי בהשוואה לעמיתיהם תערובת חלבונים הדביקים שלהם. ביסוד שיפורים אלו היה downregulation של זיהום colon-, fibroblast- גזע גנים הקשורים התא על laminins, כמו גם ירידה התפשטות תאים ו -10 ביטוי גנים הקשורים הגירה.
לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מייצר תאים דמויי hepatocyte שקרובות יותר באופיים hepatocytes אדם בוגרים. התהליך ניתן לשחזור, מקובל האוטומציה, והוא יכול להיות חסכוני מדורג עבור יישום. חשוב לציין, יצווה אל תצווה וריאציה כבר ירדה באופן משמעותי בהשוואה לטכניקות משתמשות Matrigel, וכתוצאה מכך מערכת בידול משופרת עבור חוקרים בתחום זה.
Disclosures
ד"ר David C. Hay הוא מייסד שותף ומנהל Stemnovate מוגבל.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה עם פרסים מהפלטפורמה רפואה רגנרטיבית בבריטניה (MRC MR / L022974 / 1 ו MR / K026666 / 1) וכן מלגה סין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| HepatoZYME | Life Technologies | 17705 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |
References
- Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
- Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
- Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
- Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).
- Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
- Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).
- Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969 (2011).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).
- Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).
- Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).
- Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59 (5), 645-654 (2010).
