Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.
Abstract
Het Golgi-Cox methode neuron kleuring is gebruikt voor meer dan tweehonderd jaar aan ons begrip van neuron morfologie te bevorderen binnen histologische hersenen monsters. Hoewel het de voorkeur verdient vanuit praktisch oogpunt hersenen secties de grootste dikte materialen te bereiden, teneinde de waarschijnlijkheid van het identificeren bevlekt neuronen die volledig zijn vervat binnen enkele secties verhogen, deze benadering beperkt technisch oogpunt de werkafstand van high -Vergroting microscoop doelstellingen. Wij rapporteren hier een protocol om neuronen te kleuren volgens de methode Golgi-Cox in muizenhersenen secties 500 pm dikte gesneden, en neuronen te visualiseren over de hoogte van die gebieden af met een rechtopstaande microscoop uitgerust met een hoge-resolutie 30X 1,05 NA siliconen olie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Wij rapporteren ook twee nuttige varianten van dit protocol dat kan worden gebruikt om het oppervlak van tegenkleuringgemonteerde hersensecties met cresyl violet Nissl vlek of gehele hersenen voor langdurige opslag bevriezen voorafgaand aan snijden en eindverwerking. De belangrijkste protocol en de twee varianten produceren lood dikke hersencoupes, gedurende welke volledige neuron dendritische bomen en dendriet stekels betrouwbaar kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd.
Introduction
De visualisatie van de individuele neuronen in weefselmonsters maakt het mogelijk om in situ analyse van neuron morfologische kenmerken, die aanzienlijk heeft geavanceerde ons begrip van de hersenen en hoe het kan worden beïnvloed door endogene ziekte of exogene omgevingsfactoren. Het Golgi-Cox kleuringsmethode een kosteneffectief, relatief eenvoudig middels kleuren van een steekproef van neuronen in de hersenen. Eerst ontwikkeld door Golgi 1 en gewijzigd door Cox 2 in de jaren 1800, hebben de onderzoekers verder verfijnd deze techniek door de jaren heen aan duidelijke, goed gekleurde neuronen die kunnen worden gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren zowel dendritische boom morfologie en de wervelkolom dichtheid 3, 4 te produceren, 5, 6, 7, 8, 9.
Een belangrijke technische overweging voor de visualisatie van gekleurde neuronen in hersenen secties de maximale plakdikte, die wordt begrensd door de werkafstand beschikbare sterke vergroting / microscoopobjectieven hoge resolutie. Gemeenschappelijke doelstellingen olie-immersie in de jaren 60 - 100X bereik te bieden uitstekende resolutie, maar worden beperkt door hun werkafstanden die zijn meestal niet groter dan 200 urn. Hersenplakjes gesneden op 200 um bereik kan voldoende zijn om bepaalde types neuron welke op deze plakdikte bijvoorbeeld piramidale neuronen in ondiepe lagen van de hersenschors 10, 11, 12, piramidale neuronen in het CA1-gebied van het visualiseren hippocampus 13, 14 en granule cellen in de dentate gyrus van de hippocampus 15. Neuronen met relatief langeredendritische bomen, zoals piramidale neuronen in diepe lagen van de hersenschors die voor muizen kan meer dan 800 urn uitstrekken vanaf het cellichaam 16, verschaffen een grotere uitdaging omdat hersenen zou moeten worden doorgesneden op een perfecte hoek met de gehele dendriet structuur bevatten minder dan 200 urn plakjes. Dit kan zelfs onmogelijk zijn als een dendriet of een van de vertakkingen zich uitstrekken in de rostrale en caudale richting. Hoewel het mogelijk is om deze beperking aan te pakken door het traceren van een neuron over meerdere aangrenzende hersenen secties, deze aanpak introduceert een belangrijke technische uitdaging bij de aanpassing van de delen nauwkeurig voor het traceren van 17. Een meer praktische benadering zou zijn gehele neuronen opgenomen in hersensecties die een grotere dikte worden gesneden visualiseren.
Wij rapporteren hier een techniek om neuronen in 400 vlekken - 500 urn dikke hersenen secties van muizen met behulp van de Golgi-Cox methode, en hun mo visualiserenrphology behulp van een hoge-resolutie siliconenolie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Het Golgi-Cox impregneren en verwerkingsprotocol we beschrijven is gemodificeerd van een van de meest geciteerde moderne protocollen in de literatuur 6. Onze aanpak dikke hersencoupes verschaft het voordeel van het verhogen van de waarschijnlijkheid van het identificeren neuronen van elke soort die volledig zijn vervat binnen de sectie. Naast de belangrijkste protocol, we ook twee varianten die unieke voordelen verschaffen: (1) Golgi-Cox kleuring met cresyl violet tegenkleuring op het oppervlak gemonteerde secties, teneinde grenzen van hersengebieden te definiëren en lagen van de identiteit cerebrale cortex, en (2) Golgi-Cox kleuring met een tussenproduct bevriezingsstap voor langetermijnopslag geïmpregneerd gehele hersenen vóór snijden en eindverwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen vrouwelijke CD1-stam muizen werden gebruikt in deze studie. Vergelijkbare kleuring kan worden bereikt met behulp van beide geslachten op verschillende leeftijden. Proefdieren werden verzorgd volgens de principes en richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care, en de experimentele protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Guelph Animal Care Committee.
1. Golgi-Cox kleuring
- Golgi-Cox Impregneren van Brains
- Maak het Golgi-Cox oplossing van 1% (w / v) kaliumdichromaat, 0,8% (w / v) kalium- chromaat en 1% (w / v) kwikchloride door oplossing van kaliumdichromaat en kalium- chromaat in hoogwaardige water afzonderlijk . Meng de oplossingen, voeg het kwikchloride en filtreer de eindoplossing behulp graad 1 filtreerpapier. Bewaar de oplossing in het donker voor maximaal een maand.
- Verdoven van de muis met behulp van 5% isofluraan.
- Euthanaseren de muis door onthoofding en snel de hersenen te verwijderen.
- Plaats de hersenen in een 20 ml glazen scintillatieflesje met 17 ml Golgi-Cox-oplossing en incubeer in het donker bij kamertemperatuur 25 d.
- Cryoprotect de hersenen door deze in een 50 ml conische buis met 40 ml sucrose cryoprotectant (30% (w / v) sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4) in het donker bij 4 ° C gedurende 24 uur.
OPMERKING: De volgende optionele drie stappen kunnen worden toegepast als alternatief voor de belangrijkste protocol om de hersenenvorst in dit stadium voor langetermijnopslag. - Bevries de volledige hersenen door onderdompeling in isopentaan 200 ml die is voorgekoeld op droogijs.
- De bevroren hersenen in een 50 ml conische buis en bewaar in het donker bij -80 ° C.
- Wanneer zover om ontdooien de hersenen door deze in een 50 ml conische buis met 40 ml sucrose koude beschermend middel in het donker bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Brain-Sectie
- Verwijder het brein van sucrose en block het voor snijden door het afsnijden van het cerebellum met behulp van een scheermesje en laten een vlakke rand op het resterende caudale einde van de hersenen.
- Warmte agar (3% (w / v) in water) totdat het gesmolten is en laat afkoelen tot het iets boven het smeltpunt.
- Plaats de hersenen in een kleine wegwerp weeg schaal met staarteinde face-down en voeg een voldoende hoeveelheid gesmolten agar naar de hersenen te dekken.
- Zodra de agar gestold trimmen overtollige agar laat ongeveer 2-4 mm rond de hersenen en lijm de hersenen om het stadium van een vibratome met zijn staarteinde verdekt met een kleine hoeveelheid ethyl cyanoacrylaat lijm.
- Vul het podium van de vibratome met een voldoende hoeveelheid sucrose cryoprotectant naar de hersenen en deel de hersenen bedekken met een plakdikte van 400-500 urn (afhankelijk van de hersenen te onderzoeken gebied) met een trillingsfrequentie van 86 Hz en een blad voortbewegingssnelheid van 0,125 mm / s.
- Met behulp van een kleine kwast, Plaats hersensecties in een putje van een 6-well weefselkweekplaat met commercieel verkrijgbare mesh-inserts en onder vooraf gevuld met 10 ml 6% (w / v) sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4.
- Incuberen van plakjes in het donker bij 4 ° CO / N.
- Ontwikkelende hersenen Secties
- Met de mesh-inserts bodem, transfer hersensecties in een nieuw putje dat 5 ml 2% (w / v) paraformaldehyde (PBD) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. Incubeer op een rocker beweegt met lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was op een rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Overdracht delen in een nieuwe put met 5 ml 2,7% (v / v) ammoniumhydroxide. Incubeer op een rocker beweegt met een lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was ona rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Overdracht secties in een nieuw putje dat 5 ml Fixatief A (zie tabel Materials) dat in water 10x verdund is van de oorspronkelijke concentratie gekocht. Incubeer op een rocker beweegt met een lage snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
- Wassen secties tweemaal door ze naar nieuwe putjes met 5 ml water. Was op een rocker beweegt met een gematigde snelheid in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Montage Brain secties
- Met behulp van een kleine kwast, zet de secties op microscoopglaasjes. Overtollig water en agar met een pincet en een kleine weefsel. Zorg ervoor dat alle agar alvorens verder te gaan met uitdroging wordt verwijderd.
- Toestaan secties aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 45 minuten (400 urn secties) of 90 min (500 um secties).
OPMERKING: De timing en de juiste droogniveau is kritisch en moet worden bepaald in elklaboratorium afhankelijk van de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid. Een te korte droogtijd leidt tot secties vallen van dia's tijdens de daaropvolgende dehydratatie stappen, en te lange droogtijd leidt tot secties kraken. Secties zullen nog steeds weergegeven glanzend te zijn op het juiste niveau van droogte. - Vlek secties met cresyl violet door het plaatsen van dia's in Coplin kleurbakjes zoals aangegeven.
OPMERKING: Deze optionele stap kan worden gebruikt voor de delen die nog nooit was bevroren, met het oog op neuronale kernen met cresyl violet vlekken. We hebben ontdekt dat clearing en rehydrating delen voordat incubatie in cresylviolet leidt tot nog vlekken en lage achtergrond overkant secties.- Plaatsen klaringsmiddel gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer.
- Plaats in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer.
- Plaats in 95% ethanol in water, daarna 75% ethanol in water en daarna 50% ethanol in water gedurende 2 min elk.
- Leg ze in water gedurende 5 minuten.
- Plaatsen 0,5% (w / v) CREsyl violet in water gedurende 7 minuten.
- Plaats in water gedurende 2 min. Herhaal dit een keer.
- Uitdrogen delen door het plaatsen van dia's in Coplin kleurbakjes zoals aangegeven.
- Plaats in 50% ethanol in water, daarna 75% ethanol in water en daarna 95% ethanol in water gedurende 2 min elk.
- Plaats in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer.
- Plaatsen klaringsmiddel gedurende 5 minuten. Herhaal dit een keer.
LET OP: Deze uitdroging en clearing tijden voldoende zijn om muizenhersenen te verwerken zoals beschreven in dit manuscript. We hebben echter ook bij andere species met inbegrip van ratten en cowbird, dat de laatste stap clearing moet mogelijk worden verlengd tot 15 minuten totaal.
- Dekglaasje gebieden af met watervrij fixeermiddel.
- Toestaan slides horizontaal drogen in het donker bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 d.
2. Imaging Stained neuronen in Dik Brain secties
- Het vastleggen van Afbeeldingenstapels
- Schakel de microscoop lamp, camera, en het podium controller.
- Open de microscoop software (bijv Neurolucida).
- Plaats een dia op de microscoop podium.
- Leg een 2D-beeld van de hersenpreparaat grote kijkhoek met een lage objectiefvergroting zoals 1,25x 0,4 NA PlanApo of 4X 0,16 NA
- Focus beeld en instellingen, inclusief de belichtingstijd en de witbalans.
- Maak een referentiepunt door met de linkermuisknop te klikken ergens op de afdeling
- Leg het beeld door te kiezen voor "enkel beeld te verwerven" in het venster beeldacquisitie.
- Leg afbeeldingsstapels van het gebied met de neuronen (s) plaats halverwege resolutie met behulp van een 10x NA 0,3 uPlan FL N doelstelling.
- Focus het beeld en de camera-instellingen zoals de belichting en witbalans aan te passen.
- Stel de boven- en ondergrenzen voor de afbeeldingsstapel door zich tot de bovenkant van de sectie eennd u "set" naast "boven stapelen" in de beeldacquisitie venster en gericht naar de bodem van de sectie en de "set" naast "onderaan stack" binnen het venster beeldacquisitie selecteren.
- Stel de stapafstand tot 5 urn door "5 micrometer" naast "afstand tussen beelden" in het venster beeldacquisitie.
- Leg het beeld stack door "image acquire stack" in het venster beeldacquisitie.
- Herhaal de bovenstaande stappen om het gehele gebied van belang te vangen, om ervoor te zorgen dat alle afbeeldingsstapels breedte van ten minste 10% in de X- en Y-assen.
- Leg afbeeldingsstapels van het gebied met het neuron plaats hoge resolutie, onder toepassing van een 30X 1,05 NA siliconenolie-immersie objectief.
- Toepassing 3-4 druppels silicone immersieolie de slede en plaats het objectief op de slede, zodat het contact tussen het objectief en oi makenl.
- Focus het beeld en de camera-instellingen zoals de belichting en witbalans aan te passen.
- Stel de boven- en ondergrenzen voor de afbeeldingsstapel door zich tot de bovenkant van de sectie en de "set" selecteren naast "bovenste stapel" in het venster beeldacquisitie en vervolgens gericht naar de bodem van de sectie en het selecteren van "set" naast de "onderkant van de stapel" in het venster beeldacquisitie.
- Stel de stapafstand tot 1 urn door "1 micrometer" naast "afstand tussen beelden" in het venster beeldacquisitie.
- Leg het beeld stack door "image acquire stack" in het venster beeldacquisitie.
- Herhaal de bovenstaande stappen om het gehele gebied van belang te vangen, om ervoor te zorgen dat alle afbeeldingsstapels breedte van ten minste 10% in de X- en Y-assen.
- Sla het bestand en bewaar alle beeldbestanden in TIFF-formaat voor externe verwerking.
- Maak Z-projectie beelden in ImageJ
- Open ImageJ software die de Bio-Formats plugin heeft geïnstalleerd.
- Selecteer "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer".
- Selecteer het beeld stack-bestand te openen.
- Zodra het bestand wordt geopend, verander het formaat in RGB door "Beeld" -> "Type" -> "RGB kleur".
- Maak de Z-projectie door "Beeld" te selecteren -> "Stacks" -> "Z Project ...".
- Sla tweedimensionaal beeld Z-projectie als een TIFF-bestand.
- Maak een tweedimensionaal beeld montage van het gehele gebied van belang.
- Open de software (bijvoorbeeld Adobe Photoshop).
- Selecteer "File" -> "Automatiseren" -> "Photomerge".
- Selecteer "Bladeren" en voeg dan alle images bestanden die moeten worden samengevoegd.
- Zorg dat "Blend Images Together" is geselecteerd en selecteer vervolgens "OK".
- Sla de resulterende montage beeld van het gehele gebied van belang als een TIFF-bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit Golgi-Cox kleuringsprotocol en twee optionele beschreven varianten kunnen worden toegepast om individuele neuronen te visualiseren binnen 400-500 urn dikke hersencoupes. Representatief beeld montages tweedimensionale Z-uitsteeksels opgenomen met een 10X objectief en 5 urn stappen in de Z-as zijn weergegeven in Figuur 1: A1 - C1 voor een groot gebied van coronale hersenplakjes de anterior cingulate cortex gebied 1 en het omvat secundaire motorische cortex 18. Secties werden 500 urn gesneden. Merk op dat het protocol variant cresyl violet kleuring omvat maakt de identificatie van corticale cellagen, bijvoorbeeld zoals gezien corticale Laag 1 langs het pial oppervlak van de secties in Figuur 1B1. Merk ook hetzelfde uitzien als gekleurde coupes bij gebruik van de belangrijkste protocol gebruik van volledig vers weefsel (figuur 1A1) en het protocol variant waarinhersenen bevroren halverwege voor langdurige opslag (Figuur 1C1).
Het gebruik van een hoge-resolutie 30X 1,05 NA siliconenolie-immersie objectief maakt het vangen van afbeeldingsstapels zoekt die de X en Y-as zijn dan die gemaakt met een hogere vergrotend objectief, waardoor minder totale stapels beeld gegeven ter gebied van intresse. De bepaalde toegepaste doel heeft een 800 pm werkafstand, dat is meer dan voldoende om het dikke hersencoupes. Afbeelding montages tweedimensionale Z-uitsteeksels vastgelegd met behulp van deze doelstelling en 1 urn stappen in de Z-as zijn weergegeven in figuur 1 (A2-C2) in de anterior cingulate cortex gebied 1 en tweedimensionale Z-projecties van traceringen voor het aangegeven neuronen worden getoond in Figuur 1: A3 - C3. Let op de hoge resolutie beelden die het mogelijk maken voor de visualisatie van neuronen en hun dendrieten door dediepte van elke afbeeldingsstapel. Het protocol variant gebruikt cresyl violet voegt Nissl paarse vlekken in het segment, maar met de gebruikte parameters deze cellulaire kleuring alleen waargenomen bij de top van het segment. Het protocol variant die de eventuele bevriezing omvat het neuron produceert kleuring die vergelijkbaar is met de belangrijkste protocol, maar het introduceert ook een diffuse achtergrondkleuring die het uiterlijk van nevel door verstrooiende licht onder het oppervlak van de schijf ontstaat. Deze waas is het duidelijkst wanneer afbeelden dieper in het segment en blijkt beeld Z-projectie in figuur 1C2. Beelden gemaakt met een 30X objectief kan ook worden gebruikt voor het visualiseren en kwantificeren fijne neuronale structuren zoals dendritische. Enkelvlaks beelden worden getoond in figuur 2 te dendrieten gekleurd met de belangrijkste protocol en de twee varianten, met een beeld genomen bij de top van de sectie en een beeld dat nabij de bodem van de sectie. Let op de purple cresyl violet kleuring van Nissl stof in afzonderlijke neuronale kernen nabij de bovenzijde van de sectie in Figuur 2B1, die wordt gezien als diffuse paarse achtergrond / verstrooid licht nabij de bodem van de sectie in Figuur 2B2. Merk ook op dat hoewel dendrieten en hun stekels zijn goed gekleurd met behulp van het protocol met het invriezen, de eerdergenoemde achtergrond waas die duidelijk nabij de bodem van het deel in figuur 2C2 bemoeilijkt stekels zichtbaar door het beperken van het contrast tussen hen en de aangrenzende achtergrond. Hogere vergroting doelen kunnen ook worden gebruikt voor het karakteriseren van dendritische spine morfologie, zoals getoond in Figuur 2: A3 - C3 waarbij stekels van verschillend type zijn duidelijk zichtbaar in secties gekleurd met elk van de drie protocollen. Hier werd een 60X 1,42 NA olie-immersie objectief gebruikt. We hebben ook gebruikt dit kleuringsprotocol en zijn varianten voor neuronen vlek binnen de hippocampus secties gesneden bij 400 urn. En meer zijgebieden van de sectie (bijvoorbeeld -: zie figuur 3, kan neuron dendrieten en stekels beide aan de meer mediale gebieden van de sectie (C2 A2 bijvoorbeeld de hippocampus dentate gyrus regio in figuur 3) worden gevisualiseerd de hippocampus CA3 regio Figuur 3: A3 - C3). Er dient te worden opgemerkt dat elke kleuring staat soortgelijke resultaten, voordelen en nadelen aan die getoond in figuren 1 en 2 voor de cerebrale cortex geproduceerd.
De uiteindelijke dikte van verwerkte hersencoupes afhankelijk van het specifieke protocol variant toegepast. Zoals getoond in figuur 4A gedeelten met de cerebrale cortex en 500 urn gesneden, er een significant effect van protocol variant op de gemeten dikte verwerkt en aangebracht / dekglaasje secties (eenwegs ANOVA, p <0,0001). Hierbij is de dikte van gedeelten uitgevoerd met de belangrijkste protocol (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) en het protocol variant met cresyl violet (219,3 ± 8,5 um (n = 6)) was kleiner dan de dikte van gedeelten maakte gebruik van het protocol variant waarbij invriezen (340,6 ± 17,1 urn (n = 6)) (Bonferroni post-hoc test, elke vergelijking p ≤ 0,0006). Vergelijkbaar effect protocollaire variant werden waargenomen gedeelten met de hippocampus en bij 400 urn (figuur 4B, eenzijdige ANOVA, p <0,0001) gesneden. Hierbij is de dikte van gedeelten uitgevoerd met de belangrijkste protocol (217,6 ± 19,2 urn (n = 6)) en het protocol variant met cresyl violet (198,0 ± 14,8 urn (n = 6)) was kleiner dan de dikte van gedeelten die via de protocol variant waarbij invriezen (313,5 ± 8,4 um (n = 6)) (Bonferroni post-hoc test, elke vergelijking p ≤ 0.001).
Figuur 1. Microfoto Voorbeelden van Stained neuronen in de omgeving anterieure cingulate 1. A1 - C1, samengevoegde Z-projecties van afbeeldingsstapels verkregen onder toepassing van een 10X objectief worden getoond voor een halfrond van de cerebrale cortex, dat de voorste cingulate cortex gebied 1 en secundaire omvat motorische cortex ongeveer 1,18 mm Bregma 18. Deze secties werden 500 urn gesneden. Microfoto's getoond met de hoofdschakelaar geheel nieuwe protocol (A1), de verse protocol variant met cresyl violet kleuring (B1) en het protocol variant waarbij hersenen worden bevroren na Golgi-Cox impregnatie (C1). Schaalbalken zijn 500 urn. Hogere resolutie samengevoegd Z-projectie afbeeldingsstapels verkregen onder toepassing van een 30X siliconenolie-immersie objectief wordt in A2 - C2 voor elk door de rode vierkant gebieduare in de microfoto in A1 - C1. Schaalbalken 100 urn. 2D Z-projecties van neuron traceringen wordt in A3 - C3 van de door de rode pijl in de microfoto in het A2-neuronen - C2. De diameter van alle dendrieten werden ingesteld op 2 pm voor het gemak van illustratie. Schaalbalken 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbeelden Microfoto van Dendritische stekels voor Neuronen in lood. Microfoto's opgenomen met een 30X siliconenolie-immersie objectief wordt in een brandvlak van neuron dendrieten zich in laag 1 van de anterieure cingulate cortex stippellijn 1. Deze secties werden 500 urn gesneden. Neuronen werden gekleurd met behulp van de f resh protocol (A1, A2), het protocol variant met cresyl violet kleuring (B1, B2) en voor het protocol variant waarbij hersenen worden bevroren na Golgi-Cox impregnatie (C1, C2). Microfoto's werden genomen bij de top van het deel (A1 - C1) en nabij de bodem van het deel naast het microscoopglaasje (A2 - C2). Schaalbalken voor A1-2, B1-2 en C1-2 zijn 50 urn. Microfoto zijn weergegeven in A3, B3 en C3 van een brandpuntsvlak gebruik van hogere vergroting 60x olie-immersie objectief, teneinde verschillende soorten ruggengraat identificeren. Schaalbalken A3, B3 en C3 zijn 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
55358 / 55358fig3.jpg"/>
Figuur 3. Voorbeelden Microfoto van Stained neuronen in de hippocampus. Microfoto's opgenomen met een 4x objectief wordt in een brandvlak van neuronen gekleurd met verse protocol (A1), het protocol variant met cresyl violet kleuring (B1) en het protocol variant waarbij hersenen worden bevroren na Golgi-Cox impregnatie (C1 ). Secties werden gesneden bij 400 urn en zijn getoond bij ongeveer -2,18 mm Bregma 18. Schaalbalken zijn 500 pm A1 - C1. Hogere vergroting microfoto's werden opgenomen met een 30X siliconenolie-immersie objectief en wordt in één brandvlak van neuron dendrieten zich in de dentate gyrus gebied van de hippocampus (A2 - C2) en CA3 gebied van de hippocampus (A3 - C3). Schaalbalken 50 pm voor A2 - C2en A3 - C3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. De dikte van Gemonteerd secties. De gemeten dikte van gemonteerde secties in een voor de delen die de cerebrale cortex Bregma ongeveer 1,18 mm 18 en 500 urn dik gesneden, en B secties die de hippocampus bij ongeveer -2,18 mm Bregma 18 en 400 urn gesneden dikte. Gemeten werden gekleurd met behulp van de verse protocol, het protocol variant met cresyl violet kleuring of protocol variant waarbij hersenen worden bevroren na Golgi-Cox impregneren. Voor beide hersengebieden, was er een significant effect van verwerkingsprotocol(Eenwegs ANOVA, p <0,0001), waarbij coupes van hersenen die gedeeltelijk bevroren waren door de protocol significant dikker dan die niet werden ingevroren (Bonferroni post-hoc test, alle p <0,001). De gegevens worden getoond als gemiddelde ± SEM voor zes delen in elke groep, en data sets met verschillende letters geven significante verschillen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een Golgi-Cox kleuringsprotocol met twee nuttige varianten voor het visualiseren van neuronen in hersenen dikke secties. Zoals getoond in de representatieve resultaten, het gebruik van een hoge-resolutie doelstelling met een lange werkafstand 800 pm heeft zorgt voor een betrouwbare weergave van gehele neuronen gehele diepte van hersensecties snijden bij 500 urn. Deze studie relatief dikke hersencoupes vermindert de waarschijnlijkheid dat gekleurde neuronen van elk type volledig binnen de slice, wat vooral belangrijk piramidale neuronen met lange en ingewikkelde apicale dendriet bomen. Bijvoorbeeld, in coronale secties van muishersenen, dit zorgt voor het opnemen van neuronen die verder in rostrale en caudale uitstrekken, en verhoogt ook de kans op fouten bij het blokkeren van de hersenen vierkant op het snijden stap. Hoewel we beschrijven hersenen snijden in het frontale vlak alleen kan dit protocol worden aangepast voor het snijden van andere planen behoefte volledig bevatten gemerkte neuronen in enkele secties. Het vlak van coupes zal afhangen van de morfologische eigenschappen van de neuronenpopulatie onderzochte. Dendritische kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met dit protocol, hoewel hogere vergroting doelstellingen moeten soort ruggengraat / morfologie zoals 60X olie-immersie objectief gebruikt om de microfoto produceren Figuur 2 beoordelen: A3 - C3. Dit kan worden toegepast in dikke gedeelten, maar is beperkt tot de top van het deel binnen de werkafstand van het objektief. Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende soorten van vergelijkbare grootte hersenen, zoals we hebben gevonden dat een standaard 25-dagen impregnatie periode volledig zal vlekken neuronen gedurende de muis, rat en cowbird hersenen dat echter geen overmaat niet-specifieke kleuring of background die kunnen ontstaan bij impregnering perioden langer dan een maand. Kortere impregneren perioden kunnen volstaan om soorten met s bedragenMaller hersenen of ontleed monsters hersenen van de bovengenoemde soort, die kan worden geoptimaliseerd door de individuele onderzoeker.
Van de drie varianten gepresenteerd voor deze vlekken protocol, de belangrijkste protocol met behulp van verse hersenen monsters die niet worden tegengekleurd de beste resultaten oplevert. Microfoto Figuur 2A tonen dat deze hoofdgroep protocol levert goed gemerkte dendrieten en stekels die gemakkelijk zichtbaar zijn nabij de bovenzijde en onderzijde van gemonteerde dikke gedeelten. Toevoegen van cresyl violet tegenkleuring heeft het voordeel van het vergemakkelijken van het begrip hersengebieden en cerebrale cortex lagen, maar ook nog een diffuse paarse achtergrond bij het visualiseren diep in dikke gedeelten. Aangezien deze variant protocol alleen vlekken van het oppervlak gemonteerde dikke gedeelten met cresyl violet, dendrieten en hun uitsteeksels werden duidelijk zichtbaar onder aan secties (figuur 2 B). Dit lijkt ook produce duidelijker patroon van Nissl-kleuring nabij het oppervlak van dikke gedeelten dan het in eerder verslagen, zelfs bij gebruik van veel dunnere secties 19, 20, 21. Het protocol variant die het invriezen omvat oplevert aanvaardbare resultaten voor de analyse van dendritische structuur morfologie. Echter, de achtergrond kleuring is veel donkerder dan die in vers weefsel, die het meest merkbaar wanneer dieper beeldvorming in de slice waardoor het moeilijker wordt om te visualiseren en te kwantificeren dendriet stekels (figuur 2 C). We hebben geprobeerd de cresyl violet tegenkleuring in delen van de hersenen die bevroren waren, en dit produceerde een even donkerdere paarse achtergrond haze dat maakte het uiterst moeilijk om te visualiseren en te kwantificeren stekels in de buurt van de bodem van de sectie (gegevens niet getoond). Een andere variant mislukte protocol dat werd beoordeeld inbegrepen ijskoud muizenhersenen vóór Golgi-Cox impregnatie. Dit resulteerde in de kleuring van cellulaire voorwerpen die zijn glia kan hebben, maar kleurden niet elke vorm van neuron (gegevens niet getoond).
Er zijn twee belangrijke stappen in dit protocol die moet worden gevolgd om succesvolle resultaten te verkrijgen. (1) Het is cruciaal om de droogtijd van secties van elk laboratorium te verifiëren, omdat dit sterk afhankelijk van temperatuur en luchtvochtigheid. Als de droogtijd te kort is, zullen delen van de dia's tijdens het droogproces vallen; als de droogtijd te lang is, zal secties barsten. Het zou voordelig zijn om droogtijd controleren in een set van "test" brein net voorafgaand aan het voorvormen van een onderzoek, omdat dit kan variëren per seizoen, zelfs met hetzelfde laboratorium. (2) Alle overtollige agar moet de sectie en microscoopglaasje vóór dehydratatiestappen verwijderd. Als dit niet gebeurt, zal de agar vervormen en kan het deel af te trekken van de schuif.
Een andere belangrijke factor voor de histologischeal analyse van biologische monsters weefsel krimp. We vonden dat na verwerking, montage, drogen en afdekken hersencoupes met de hoofdschakelaar Golgi-Cox protocol dat de uiteindelijke snijdikte neemt met ongeveer de helft van de oorspronkelijke waarde snede (figuur 4). Merk ook op dat de gedeelten verwerkt met het protocol variant die de bevriezingsstap opgenomen significant dikker dan de verse secties via de belangrijkste protocol (figuur 4) werd verwerkt. Dit was zowel interessant en onverwacht omdat beide protocollen betrokken dezelfde cryoprotection en processtappen, en alleen verschilden door de feitelijke bevriezing van de hersenen. Het is daarom van groot belang om rekening te houden met eventuele verschillen in de protocollen bij de vergelijking neuron morfologie gegevens die via Golgi-Cox kleuring van verschillende onderzoeken of van verschillende laboratoria. Hoewel we waren niet in staat om gegevens voor de laatste sectie dikte in de literatuur te vinden, zou het gunstig zijnvoor onderzoekers om deze gegevens en / of juist zijn voor het weefsel krimp te melden bij de rapportage van maatregelen van neuron morfologie. Ook moet worden opgemerkt dat, hoewel de uiteindelijke dikte van> 200 urn voor secties gesneden bij 500 urn groter is dan de werkafstand van de meeste sterk vergrotende doelstellingen dit nog ruim binnen de werkafstand van de 30X objectief gebruikt in ons laboratorium. Aangezien dendrieten en stekels zijn duidelijk zichtbaar aan de onderkant van deze segmenten met de hoofdschakelaar Golgi-Cox-protocol, kan het mogelijk zijn om neuronen opgenomen in secties gesneden met een veel grotere dikte tot en met 1 mm bereik visualiseren.
Hoewel dit protocol biedt een aantal voordelen zoals de mogelijkheid om lange dendritische assen sporen binnen enkele secties, de mogelijkheid om snijden en verwerken van geïmpregneerde hersenen en de mogelijkheid tegenkleuring met cresyl violet tot hersenstructuren beter te identificeren vertragen, zijn er een aantal nadelen die moetenworden overwogen. De 25-daagse incubatieperiode kan worden beschouwd als te lang voor sommige onderzoekers. De mogelijkheid om diep in gemonteerde secties afhankelijk van de toegang tot een immersie objectief hoge resolutie met een lange werkafstand, hetgeen relatief duur. Bovendien, het vermogen om fijne structuren te visualiseren met hoge resolutie afneemt naarmate men beelden nabij de bodem van de gemonteerde segment. De uitvoering van dit protocol is dus afhankelijk van de morfologische eigenschappen van de neuronen en de hersenen regio te bestuderen, en de informatie waarover de onderzoeker apparatuur. Wij raden het gebruik van "test" monsters protocol variabelen te optimaliseren voorafgaand aan het uitvoeren van een onderzoek, zoals Golgi-Cox impregnatie tijd voor de grootte van de hersenen en de regio van belang, en het vliegtuig en de dikte van het snijden voor de dendritische prieel aan worden gevisualiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Discovery Grant CDCB van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC), een John R. Evans Leaders Fund onderzoeksinfrastructuur subsidie aan CDCB uit Canada Stichting voor Innovatie (CFI projectnummer 30381), en door een Discovery Grant NJM van NSERC. ELL werd ondersteund door een Ontario Graduate Scholarship en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph. CDS werd ondersteund door een Undergraduate Student Research assistentschap van NSERC. ALM werd ondersteund door een Alexander Graham Bell Scholarship uit NSERC en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
