Summary
Nous présentons un protocole d'utilisation de la méthode de coloration de Golgi-Cox dans des coupes de cerveau d'épaisseur, afin de visualiser les neurones avec de longs arbres dendritiques contenus dans des échantillons de tissus individuels. Deux variantes de ce protocole sont également présentées qui impliquent violet contre-coloration crésyl, et le gel des cerveaux non transformés pour le stockage à long terme.
Abstract
La méthode Golgi-Cox de coloration des neurones a été employé pendant plus de deux cents ans pour faire progresser notre compréhension de la morphologie des neurones dans les échantillons de cerveau histologiques. Bien qu'il soit préférable d'un point de vue pratique pour préparer des coupes du cerveau à la plus grande épaisseur possible, afin d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones colorés qui sont entièrement contenus dans les sections individuelles, cette approche est limitée du point de vue technique par la distance de travail de haut -magnification objectifs de microscope. Nous rapportons ici un protocole pour colorer les neurones en utilisant la méthode Golgi-Cox dans des coupes de cerveau de souris qui sont coupées à une épaisseur de 500 um, et de visualiser les neurones tout au long de la profondeur de ces sections à l'aide d'un microscope droit muni d'une haute résolution 30X de silicone 1,05 NA objectif à immersion dans l'huile qui a une distance de travail de 800 um. Nous présentons également deux variantes utiles de ce protocole qui peut être utilisé pour la surface de contre-colorermonté des coupes de cerveau avec le colorant de Nissl violet de crésyle, ou de geler les cerveaux entiers pour le stockage à long terme avant la coupe et le traitement final. Le protocole principal et ses deux variantes produisent des coupes de cerveau épais tachés, tout au long de laquelle les arbres dendritiques complet des neurones et des épines dendritiques peuvent être de manière fiable visualiser et de quantifier.
Introduction
La visualisation des neurones individuels dans des échantillons de tissus permet de l'analyse in situ des caractéristiques morphologiques des neurones, ce qui a considérablement fait progresser notre compréhension du cerveau et comment elle peut être influencée par la maladie endogène ou des facteurs environnementaux exogènes. La méthode de coloration Golgi-Cox est un rapport coût-efficacité, des moyens relativement simples de coloration d'un échantillon aléatoire de neurones dans le cerveau. D' abord développé par Golgi 1 et modifié par Cox 2 dans les années 1800, les chercheurs ont affiné cette technique au cours des années à produire des neurones clairs, bien colorés qui peuvent être utilisés pour visualiser et de quantifier à la fois la morphologie des arbres dendritique et la densité de la colonne vertébrale 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Une considération importante technique pour la visualisation des neurones colorés dans les sections du cerveau est l'épaisseur de la tranche maximale, qui est limitée par la distance de travail des objectifs disponibles de microscope à fort grossissement / haute résolution. Objectifs communs d'immersion d'huile dans les années 60 - 100X gamme offrent une excellente résolution, mais sont limités par leurs distances de travail qui ne sont généralement pas supérieure à 200 um. Les coupes de cerveau coupées à 200 um gamme peuvent être adéquates pour visualiser certains types de neurones qui peuvent être contenus à l'intérieur de cette épaisseur de tranche, par exemple des neurones pyramidaux dans les couches superficielles du cortex cérébral 10, 11, 12, les neurones pyramidaux de la région CA1 de la hippocampe 13, 14, et les cellules granulaires du gyrus denté de l'hippocampe 15. Neurones avec relativement plusarbres dendritiques, tels que les neurones pyramidaux dans les couches profondes du cortex cérébral que pour la souris peut dépasser de plus de 800 um à partir du corps de la cellule 16, fournissent un plus grand défi , car les cerveaux devraient être sectionné à un angle idéal pour contenir l'ensemble de l' arbre dendritique à moins de 200 um tranches. Cela peut ne pas être encore possible si un dendrites ou l'une de ses branches s'étendent dans la direction rostrale ou caudale. Bien qu'il soit possible de remédier à cette limitation en traçant un neurone à travers plusieurs sections du cerveau adjacentes, cette approche présente un défi technique important dans l' alignement des sections avec précision pour le traçage 17. Une approche plus pratique serait de visualiser les neurones entiers contenus dans les sections du cerveau qui sont découpées à une plus grande épaisseur.
Nous rapportons ici une technique pour colorer les neurones dans 400 - coupes de cerveau d'épaisseur 500 um de souris en utilisant la méthode Golgi-Cox, et de visualiser leur morphology en utilisant un objectif à immersion dans l'huile silicone à haute résolution qui a une distance de travail de 800 um. Le protocole d'imprégnation et de traitement Golgi-Cox que nous décrivons est modifié à partir de l' un des protocoles modernes les plus cités dans la littérature 6. Notre approche avec des coupes de cerveau épais offre l'avantage d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones de tout type qui sont entièrement contenu dans la section. En plus du protocole principal, nous présentons également deux variantes qui offrent des avantages uniques: (1) coloration Golgi-Cox avec le contre-colorant violet de crésyl sur la surface des sections montées, afin de définir les limites des régions du cerveau et d'identifier les couches de la cortex cérébral, et (2) la coloration de Golgi-Cox avec une étape intermédiaire de congélation pour le stockage à long terme des cerveaux entiers imprégnés avant la coupe et le traitement final.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Des souris femelles CD1-souches adultes ont été utilisés dans cette étude. coloration similaire peut être réalisée en utilisant les deux sexes à différents âges. animaux expérimentaux ont été pris en charge selon les principes et les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, et le protocole expérimental a été approuvé par l'Université de Guelph Comité de protection des animaux.
1. Golgi-Cox Staining
- Golgi-Cox Imprégnation de cerveaux
- Ajouter la solution Golgi-Cox de 1% (p / v) de dichromate de potassium, 0,8% (p / v) chromate de potassium et 1% (p / v) de chlorure mercurique en dissolvant le dichromate de potassium et le chromate de potassium dans de l'eau de haute qualité séparément . Mélanger les solutions, ajoutez le chlorure mercurique et filtrer la solution finale à l'aide du papier filtre grade 1. Conserver la solution dans l'obscurité pendant jusqu'à un mois.
- Anesthésier la souris en utilisant 5% d'isoflurane.
- Euthanasier la souris par décapitation et retirer rapidement le cerveau.
- Placer le cerveau dans un flacon à scintillation en verre de 20 ml contenant 17 ml de solution Golgi-Cox et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 25 jours.
- Cryoprotect le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 ml contenant 40 ml de saccharose cryoprotecteur (30% (p / v) de saccharose dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4) dans l'obscurité à 4 ° C pendant 24 h.
REMARQUE: Les options trois étapes suivantes peuvent être utilisées comme une alternative au protocole principal, afin de geler le cerveau à ce stade pour le stockage à long terme. - Geler l'ensemble du cerveau en le plongeant dans 200 ml isopentane qui a été pré-refroidi sur la glace sèche.
- Placez le cerveau congelé dans un tube conique de 50 ml et stocker dans l'obscurité à -80 ° C.
- Lorsqu'il est prêt à poursuivre, décongeler le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 ml contenant 40 ml de saccharose cryoprotecteur dans l'obscurité à 4 ° C pendant 24 h.
- cerveau Sectionnement
- Retirez le cerveau du saccharose et block pour sectionner en coupant le cervelet en utilisant une lame de rasoir et en laissant un bord plat à l'extrémité caudale restante du cerveau.
- agar-agar de chaleur (3% (p / v) dans de l'eau) jusqu'à ce qu'il soit fondu et laisser refroidir jusqu'à ce qu'elle soit légèrement supérieure à son point de fusion.
- Placez le cerveau dans un petit plat à usage unique peser avec son extrémité caudale face vers le bas et ajouter une quantité suffisante d'agar fondu pour couvrir le cerveau.
- Une fois solidification de la gélose, de l'assiette excès agar laissant environ 2 - 4 mm entourant le cerveau et coller le cerveau au stade d'un vibratome avec son extrémité caudale face vers le bas en utilisant une petite quantité de colle de type cyanoacrylate d'éthyle.
- Remplir la zone d'étape du vibratome avec une quantité suffisante de cryoprotecteur du saccharose à couvrir le cerveau, et la section du cerveau à une épaisseur de tranche de 400 - 500 pm (en fonction de la région du cerveau à examiner) en utilisant une fréquence de vibration de 86 Hz et une vitesse d'avancement de la lame de 0,125 mm / s.
- En utilisant une petite brosse de peinture, Lieu des coupes de cerveau dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant des inserts en maille à fond disponibles dans le commerce et pré-remplie avec 10 ml de 6% (p / v) de saccharose dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4.
- Incuber sections dans l'obscurité à 4 ° CO / N.
- Développer les sections du cerveau
- Utilisation des inserts en maille-bas, transférer des coupes de cerveau dans un nouveau puits contenant 5 ml de 2% (p / v) de paraformaldehyde (PBD) dans 0,1 M de tampon de phosphate, pH 7,4. Incuber sur un bras oscillant se déplace à vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. Laver sur une bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
- les sections de transfert dans un nouveau puits contenant 5 ml de 2,7% (v / v) d'hydroxyde d'ammonium. Incuber sur un bras oscillant se déplaçant à une vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. laver ona bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
- Les sections de transfert dans un nouveau puits contenant 5 ml de fixatif A (voir Tableau Matériaux) qui a été dilué dans de l' eau 10 fois à partir de sa concentration d' origine acheté. Incuber sur un bras oscillant se déplaçant à une vitesse lente dans l'obscurité à température ambiante pendant 25 min.
- Laver deux fois les sections en les transférant vers de nouveaux puits contenant 5 ml d'eau. Laver sur une bascule se déplaçant à une vitesse modérée dans l'obscurité à température ambiante pendant 5 min.
- Montage Sections du cerveau
- L'utilisation d'un petit pinceau, monter des sections sur des lames de microscope. Retirer l'excès d'eau et d'agar en utilisant une pince à épiler et un petit tissu. Assurez-vous que tous agar est retiré avant de procéder à la déshydratation.
- Laisser sécher à l'air les sections à température ambiante pendant environ 45 min (à 400 um sections) ou 90 min (500 um sections).
NOTE: Le moment et bon niveau de sécheresse est critique, et peut être déterminée dans chaquelaboratoire selon la température ambiante et le niveau d'humidité. Trop court un temps de séchage conduit à des sections chute des diapositives au cours des étapes de déshydratation ultérieures, et trop long temps de séchage conduit à des sections de craquage. Les articles apparaîtront encore être brillant au niveau de sécheresse approprié. - sections taches avec du violet de crésyl en plaçant des diapositives dans des pots de Coplin comme indiqué.
REMARQUE: Cette étape facultative peut être utilisée pour les sections qui n'a jamais été congelé, afin de colorer les noyaux des neurones avec le violet de crésyl. Nous avons constaté que la compensation et les sections réhydrater avant l'incubation en violet de crésyl conduit à même coloration et faible bruit de fond à travers les sections.- Placez en agent de compensation pendant 5 min. Répéter une fois.
- Placez dans 100% d'éthanol pendant 5 min. Répéter une fois.
- Placer dans 95% d'éthanol dans l'eau, puis 75% d'éthanol dans de l'eau, puis 50% d'éthanol dans l'eau pendant 2 minutes à chaque fois.
- Placez dans l'eau pendant 5 min.
- Placer dans 0,5% (p / v) cresyl violette dans l'eau pendant 7 min.
- Placez dans l'eau pendant 2 min. Répéter une fois.
- Déshydrater sections en plaçant des diapositives dans des pots de Coplin comme indiqué.
- Placer dans 50% d'éthanol dans de l'eau, puis 75% d'éthanol dans de l'eau, puis 95% d'éthanol dans l'eau pendant 2 minutes à chaque fois.
- Placez dans 100% d'éthanol pendant 5 min. Répéter une fois.
- Placez en agent de compensation pendant 5 min. Répéter une fois.
NOTE: Ces déshydratation et les temps d'élimination sont suffisantes pour traiter les cerveaux de souris comme décrit dans ce manuscrit. Cependant, nous avons observé pour d'autres espèces, y compris le rat et le vacher, que l'étape de compensation finale peut être étendue jusqu'à 15 min au total.
- sections lamelle couvre-objet en utilisant un milieu de montage anhydre.
- Permettre aux lames sécher à l'horizontale dans l'obscurité à température ambiante pendant au moins 5 d.
2. Imagerie Stained Neurones dans les sections du cerveau épais
- Capture d'image Stacks
- Allumez l'ampoule du microscope, la caméra et contrôleur de scène.
- Ouvrez le logiciel de microscope (par exemple, Neurolucida).
- Placez une lame sur la platine du microscope.
- Capturer une image large vue 2D de la section du cerveau à l'aide d'un objectif de faible grossissement tel que 1,25X 0,4 NA PlanApo ou 4X 0,16 NA
- Mettre l'accent image et ajuster les réglages de l'appareil, y compris le temps d'exposition et la balance des blancs.
- Créer un point de référence en cliquant avec le bouton gauche ne importe où sur la section
- Capturer l'image en sélectionnant « acquérir une image unique » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Capturer des piles d'images à mi-résolution de la zone contenant les neurones (s) d'intérêt, en utilisant un objectif 10X 0,3 NA UPlan FL N.
- Focaliser l'image et régler les paramètres de l'appareil, y compris l'exposition et la balance des blancs.
- Fixer les limites supérieure et inférieure pour la pile d'images en se concentrant sur le haut de la section d'unnd sélectionner « set » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images, et en se concentrant ensuite au fond de la section et en sélectionnant « réglé » à côté de « bas de pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Régler la distance de l'étape de 5 um en entrant « 5 um » près de « la distance entre les images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Capturez la pile d'images en sélectionnant « acquérir pile d'images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Répéter les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d'intérêt, faire en sorte que toutes les piles d'images se chevauchent d'au moins 10% dans les axes X et Y.
- Capturer des piles d'images à haute résolution de la zone contenant le neurone d'intérêt, en utilisant un objectif d'immersion dans l'huile de silicone 30X 1,05 NA.
- Appliquer 3 - 4 gouttes d'huile d'immersion de silicone à la diapositive et placez l'objectif sur la lame, assurant de prendre contact entre l'objectif et Oil.
- Focaliser l'image et régler les paramètres de l'appareil, y compris l'exposition et la balance des blancs.
- Fixer les limites supérieure et inférieure pour la pile d'images en se concentrant sur le haut de la section et en sélectionnant « réglé » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images, et en se concentrant ensuite au fond de la section et en sélectionnant « set » à côté de « bas de pile » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Régler la distance de l'étape à 1 um en entrant « 1 um » près de « la distance entre les images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Capturez la pile d'images en sélectionnant « acquérir pile d'images » dans la fenêtre d'acquisition d'images.
- Répéter les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d'intérêt, faire en sorte que toutes les piles d'images se chevauchent d'au moins 10% dans les axes X et Y.
- Enregistrez le fichier de données et enregistrer tous les fichiers d'image au format TIFF pour le traitement externe.
- Créer des images de projection en Z ImageJ
- Ouvrez le logiciel ImageJ qui a le plug-in Bio-formats installés.
- Sélectionnez "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Importateur Bio-Formats".
- Sélectionnez le fichier de pile d'images à ouvrir.
- Une fois que le fichier est ouvert, changer le format RVB en sélectionnant « Image » -> « Type » -> « Couleur RVB ».
- Créer la projection de Z en sélectionnant "Image" -> "Stacks" -> "Projet Z ...".
- Enregistrer l'image Z-projection à deux dimensions sous forme de fichier TIFF.
- Créer un montage d'image à deux dimensions de la surface entière d'intérêt.
- Ouvrez le logiciel (par exemple, Adobe Photoshop).
- Sélectionnez "Fichier" -> "Automatiser" -> "Photomerge".
- Sélectionnez « Parcourir », puis ajoutez les images fichiers à fusionner.
- Assurez-vous que « Blend Images Together » est sélectionné puis sélectionnez « OK ».
- Enregistrez l'image de montage résultant de toute la zone d'intérêt en tant que fichier TIFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ce protocole de coloration Golgi-Cox et ses deux variantes décrites facultatifs peuvent être utilisés pour visualiser les neurones individuels à moins de 400 - 500 um d'épaisseur des coupes de cerveau. Image représentative des montages de deux dimensions Z-projections capturées en utilisant un objectif 10X et 5 um étapes de l'axe Z sont représentés sur la figure 1: A1 - C1 pour une grande surface de coupes cérébrales coronales qui comprend la zone de cortex cingulaire antérieur 1 et le cortex moteur secondaire 18. Les sections ont été coupées à 500 um. On notera que la variante de protocole qui comprend la coloration de violet de crésyle permet l'identification des couches de cellules corticales, par exemple comme on le voit pour la couche corticale 1 le long de la surface piale des sections sur la figure 1B1. A noter également l'apparence similaire des sections colorées en utilisant le protocole principal en utilisant tous frais tissus (figure 1A1) et la variante de protocole dans lequelcerveaux sont ainsi gelés partie grâce à un stockage à long terme (figure 1C1).
L'utilisation d'une haute résolution 30X 1,05 NA objectif huile d'immersion silicone permet la capture des piles d'images qui sont plus grandes dans le axes X et Y que celles qui sont capturées à l'aide d'un objectif plus élevé de grossissement, ce qui nécessite moins de piles totales à l'image une donnée centre d'intérêt. L'objectif particulier employé a une distance de travail de 800 um, ce qui est plus que suffisant pour coupes de cerveau d'image d'épaisseur. Image en montages de deux dimensions projections Z capturées à l' aide de cet objectif et 1 pm étapes de l'axe Z sont représentés sur la figure 1 (A2-C2) dans la zone du cortex cingulaire antérieur 1, et en deux dimensions des saillies en Z de tracés pour le neurones indiquées sont représentés sur la figure 1: A3 - C3. Notez les images haute résolution qui permettent la visualisation des neurones et leurs dendrites par lala profondeur de chaque pile d'images. La variante de protocole en utilisant le violet de crésyl ajoute coloration pourpre Nissl dans la tranche, mais avec les paramètres utilisés cette coloration cellulaire est observé que près de la partie supérieure de la tranche. La variante de protocole qui comprend l'étape de congélation en option produit une coloration neurone qui est similaire au protocole principal, mais il présente également une coloration de fond diffus qui crée l'apparence d'un voile par diffraction de la lumière en dessous de la surface de la tranche. Ce trouble est le plus apparent lors de l' imagerie plus profondément dans la tranche et est visible dans l'image de projection de Z sur la figure 1C2. Les images capturées en utilisant l'objectif 30X peuvent également être utilisés pour visualiser et de quantifier les structures neuronales fines telles que des épines dendritiques. Images-plan unique sont représentés sur la figure 2 pour dendrites colorées en utilisant le protocole principal et ses deux variantes, avec une image prise près du sommet de la section et une image prise à proximité du fond de la section. Notez le purple crésyle coloration au violet de la substance de Nissl à l'intérieur des noyaux neuronaux individuels à proximité du haut de la section sur la figure 2B1, qui est considérée comme diffuse fond violet / lumière diffusée vers le bas de la section sur la figure 2B2. Notez également que même si dendrites et leurs épines sont bien colorées à l' aide du protocole à l'étape de congélation, la brume d'arrière - plan mentionné précédemment qui apparaît au bas de la tranche de la figure 2C2 rend plus difficile de visualiser des épines en limitant le contraste entre dessus et l'arrière-plan adjacent. Objectifs plus élevés grossissement peuvent également être utilisées pour caractériser la morphologie des épines dendritiques, comme le montrent la figure 2: A3 - C3 où épines de types différents sont clairement visibles dans les sections colorées en utilisant chacun des trois protocoles. Ici, un objectif-immersion dans l'huile 60X 1,42 NA a été utilisé. Nous avons également utilisé ce protocole de coloration et de ses variantes de tache neurones dans le hippocampus des sections coupées à 400 um. Comme le montre la Figure 3, les dendrites des neurones et des épines peuvent être visualisées à la fois vers les zones les plus-médial de la section (par exemple, l'hippocampe dentate région gyrus sur la figure 3: A2 - C2) et les zones les plus-latérales de la section (par exemple , , l'hippocampe CA3 région de la Figure 3: A3 - C3). Il convient également de noter que chaque condition de coloration produit des résultats similaires, des avantages et des inconvénients à ceux représentés sur les figures 1 et 2 pour le cortex cérébral.
L'épaisseur finale des coupes de cerveau traitées dépend de la variante de protocole spécifique utilisé. Comme représenté sur la figure 4A pour les sections contenant le cortex cérébral et coupé à 500 pm, il y avait un effet significatif de la variante de protocole de l'épaisseur mesurée du traitement et montée / sections ( sous une lamelle à une voie ANOVA, p <0,0001). Ici, l'épaisseur des sections faite en utilisant le protocole principal (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) et la variante de protocole impliquant le violet de crésyl (219,3 ± 8,5 um (n = 6)) est inférieure à l'épaisseur des sections faite en utilisant la variante de protocole impliquant l'étape de congélation (340,6 ± 17,1 pm (n = 6)) (Bonferroni test post-hoc, chaque comparaison p ≤ 0,0006). Très effets similaires de variant de protocole ont été observées pour des sections contenant l'hippocampe et coupées à 400 um (figure 4B, une ANOVA, p <0,0001). Ici, l'épaisseur des sections faite en utilisant le protocole principal (217,6 ± 19,2 pm (n = 6)) et la variante de protocole impliquant le violet de crésyl (198,0 ± 14,8 pm (n = 6)) est inférieure à l'épaisseur des sections faites en utilisant le variante de protocole impliquant l'étape de congélation (313,5 ± 8,4 um (n = 6)) (Bonferroni test post-hoc, chaque comparaison p ≤ 0,001).
Figure 1. Des exemples des photomicrographies de Stained neurones dans la zone cingulaire antérieur 1. A1 - C1, fusionnés projections Z de piles d'images acquises en utilisant un objectif 10X sont présentés pour un hémisphère du cortex cérébral qui comprend la zone du cortex cingulaire antérieur 1 et secondaire cortex moteur à environ 1,18 mm 18 bregma. Ces sections ont été coupées à 500 um. Les photomicrographies sont représentés à l' aide du protocole principal de tous les frais (A1), pour la variante de protocole frais avec coloration au violet de crésyl (B1) et pour la variante de protocole dans lequel les cerveaux sont congelés suivant l' imprégnation Golgi-Cox (C1). Les barres d'échelle sont de 500 pm. Résolution supérieure fusionné piles d'images de projection de Z acquises en utilisant un objectif d'immersion dans l'huile 30X silicium sont montrés dans A2 - C2 pour chaque zone indiquée par le carré rougeuare dans les photomicrographies à A1 - C1. Les barres d'échelle sont de 100 pm. Des projections de Z-2D des tracés de neurones sont présentés dans A3 - C3 pour les neurones indiqué par la flèche rouge dans les photomicrographies de la A2 - C2. Le diamètre de tous les dendrites ont été fixés à 2 um pour faciliter l'illustration. Les barres d'échelle sont de 100 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Exemplaire photomicrographies de Épines pour dendritique Stained Neurones. Photomicrographies capturées en utilisant un objectif à immersion d'huile de silicium 30X sont présentés dans un même plan focal pour dendrites des neurones situés dans une couche de la zone de cortex cingulaire antérieur 1. Ces sections ont été coupées à 500 um. Les neurones ont été colorés à l'aide du f protocole resh (A1, A2), la variante de protocole avec coloration au violet de crésyl (B1, B2) et pour la variante de protocole dans lequel les cerveaux sont congelés suivant l' imprégnation Golgi-Cox (C1, C2). Des photomicrographies ont été prises dans la partie supérieure de la tranche (A1 - C1) et à proximité du fond de la tranche à côté de la lame de microscope (A2 - C2). Barres d'échelle pour A1-2, B1-2 et C1-2 sont de 50 um. Microphotographies sont présentés dans A3, B3 et C3 pour un plan focal en utilisant un objectif 60x-immersion dans l'huile plus grossissement, afin d'identifier les différents types de la colonne vertébrale. Barres d'échelle pour A3, B3 et C3 sont de 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
55358 / 55358fig3.jpg »/>
Figure 3. Exemplaire photomicrographies de Stained dans le Hippocampus Neurones. Photomicrographies capturées en utilisant un objectif de 4X sont présentés dans un même plan focal pour les neurones colorés en utilisant le protocole frais (A1), la variante de protocole avec coloration au violet de crésyl (B1) et pour la variante de protocole dans lequel les cerveaux sont congelés suivant l' imprégnation Golgi-Cox (C1 ). Les coupes ont été coupées à 400 um et sont présentés à environ -2,18 mm 18 bregma. Les barres d'échelle sont de 500 pm pour A1 - C1. La hausse des microphotographies d'agrandissement ont été capturées en utilisant un objectif d'immersion dans l'huile silicone 30X et sont représentés dans un plan focal pour dendrites des neurones situés dans le gyrus région gyrus de l'hippocampe (A2 - C2) et la région CA3 de l'hippocampe (A3 - C3). Les barres d'échelle sont de 50 um pour A2 - C2et A3 - C3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Épaisseur des sections Montés. L'épaisseur mesurée de sections montées est représentée sur A pour des sections contenant du cortex cérébral à environ 1,18 mm 18 bregma et coupé à 500 um d' épaisseur, et en B pour des sections contenant l'hippocampe à environ -2,18 mm 18 bregma et coupé à 400 um épaisseur. sections mesurées ont été colorées en utilisant soit le protocole frais, la variante de protocole avec coloration au violet de crésyl, ou la variante de protocole dans lequel les cerveaux sont congelés suivant l'imprégnation Golgi-Cox. Pour les deux régions du cerveau, il y avait un effet significatif du protocole de traitement(Sens unique ANOVA, p <0,0001), où les sections de cerveau qui ont été congelés ainsi partie par le protocole étaient significativement plus épaisses que celles qui ne sont pas gelés (Bonferroni test post-hoc, p <0,001). Les données sont présentées en moyenne ± SEM pour six sections dans chaque groupe, et des ensembles de données avec des lettres différentes indiquent des différences significatives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous décrivons ici un protocole de coloration Golgi-Cox ainsi que deux variantes utiles pour visualiser les neurones dans les sections du cerveau épais. Comme le montrent les résultats représentatifs, l'utilisation d'un objectif à haute résolution qui a une longue 800 um distance de travail permet la visualisation fiable de l'ensemble des neurones tout au long de la profondeur des coupes de cerveau coupées à 500 um. Cette étude des coupes de cerveau relativement épaisses augmente la probabilité que les neurones colorés de tout type sont entièrement contenus dans la tranche, ce qui est particulièrement important pour les neurones pyramidaux avec apical arbres dendrites longues et compliquées. Par exemple, dans les sections coronales du cerveau des rongeurs, ce qui permet l'inclusion des neurones qui se prolongent plus loin dans la direction rostrale ou caudale, et augmente également la marge d'erreur lors du blocage du cerveau carrément à l'étape sectionner. Bien que nous décrivons cerveau sectionnant dans le plan coronal que, ce protocole peut être adapté pour sectionner dans d'autres planes que nécessaire pour contenir complètement étiquetés neurones dans les sections individuelles. Le plan de sectionnement utilisé dépendra des propriétés morphologiques de la population de neurones à l'étude. Épines dendritiques peuvent visualiser et de quantifier en utilisant ce protocole, bien que des objectifs plus élevés grossissement sont nécessaires pour évaluer le type / morphologie colonne vertébrale, comme l'objectif-immersion dans l'huile 60X utilisée pour produire les microphotographies à la figure 2: A3 - C3. Cela peut être employé dans des sections épaisses, mais se limite à la partie supérieure de la tranche dans la distance de travail de l'objectif. Ce protocole peut également être adapté pour une utilisation dans les différentes espèces de la taille du cerveau similaire, comme nous l'avons constaté qu'une période d'imprégnation standard 25 jours pleinement tache neurones tout au long de la souris, le rat et le cerveau vacher sans conduire à un excès de coloration ou de fond non spécifique qui peut se produire avec des périodes d'imprégnation au-delà d'un mois. Des périodes plus courtes d'imprégnation peuvent être suffisantes pour les espèces avec scerveaux Maller ou dans des échantillons de cerveaux disséqués à partir des espèces mentionnées ci-dessus, qui peuvent être optimisés par l'investigateur individuel.
Parmi les trois variantes présentées pour ce protocole de coloration, le principal protocole en utilisant des échantillons de cerveau frais qui ne sont pas les meilleurs rendements contrecolorées résultats. Des photomicrographies de la figure 2 A démontrent que ce protocole principal produit bien étiquetés dendrites et des épines qui sont facilement visibles à proximité de la partie supérieure et inférieure des sections épaisses montés. Ajout de la contre-coloration violet de crésyl a l'avantage de faciliter la définition des régions du cerveau et des couches du cortex cérébral, mais aussi ajouté un fond violet diffuse lors de la visualisation en profondeur dans les sections épaisses. Cependant, étant donné que cette variante de protocole colore seulement la surface des sections épaisses montées avec du violet de crésyle, les dendrites et leurs épines étaient clairement visibles dans la partie inférieure de sections (figure 2 B). Cela semble également produCE un motif de coloration plus claire Nissl près de la surface des sections épaisses que celle représentée dans les rapports précédemment, même en utilisant des sections beaucoup plus minces 19, 20, 21. La variante de protocole qui comprend l'étape de congélation donne des résultats acceptables pour l'analyse de la morphologie de l'arbre dendritique. Cependant, la coloration de fond est beaucoup plus sombre que celle dans les tissus frais, ce qui est plus visible lors de l' imagerie plus profondément dans la tranche ce qui rend plus difficile de visualiser et de quantifier les épines dendritiques (figure 2 C). Nous avons essayé la contre-coloration violette crésyl dans les sections de cerveaux qui avaient été gelés, ce qui a produit une brume de fond violet, même plus foncée qui a rendu extrêmement difficile de visualiser et de quantifier les épines près du fond de la section (données non présentées). Une autre variante de protocole échoué qui a été évalué inclus le gel des cerveaux de souris avant Golgi-Cox impregnation. Cela a donné lieu à la coloration des objets cellulaires qui peuvent avoir été glie, mais ne tache pas tout type de neurone (données non présentées).
Il y a deux étapes critiques dans ce protocole qui doit être suivi pour obtenir de bons résultats. (1) Il est essentiel de vérifier le temps de séchage des sections dans chaque laboratoire, car cela dépend fortement de la température et de l'humidité. Si le temps de séchage est trop courte, les sections vont tomber les diapositives pendant le processus de déshydratation; si le temps de séchage est trop long, sections craquerez. Il serait avantageux de vérifier le temps de séchage dans un ensemble de cerveaux « test » juste avant de préformage une étude de recherche, car cela peut varier selon la saison même avec le même laboratoire. (2) Tous les excès d'agar doit être retiré de la section et lame de microscope avant les étapes de déshydratation. Si cela ne se fait pas, l'agar-agar se déforme et peut tirer la partie hors de la diapositive.
Un autre facteur important pour la histologiquesal analyse d'échantillons biologiques est le rétrécissement du tissu. Nous avons constaté que après le traitement, de montage, de déshydratation et de lamelles coupes de cerveau en utilisant le protocole principal Golgi-Cox que l'épaisseur de la section finale a été réduite d'environ la moitié de la valeur seuil d' origine (figure 4). Notez également que les sections traitées en utilisant la variante de protocole comprenant l'étape de congélation étaient significativement plus épaisses que les sections fraîches qui ont été traitées par le biais du protocole principal (Figure 4). Ce fut à la fois intéressant et inattendu parce que les deux protocoles impliqués les mêmes Cryoprotection et les étapes de traitement, et ne diffèrent par le gel réelle des cerveaux. Il est donc essentiel de tenir compte des différences potentielles dans les protocoles lorsque l'on compare les données de morphologie des neurones générés en utilisant une coloration Golgi-Cox de différentes études ou de différents laboratoires. Bien que nous ne sommes pas en mesure de trouver des données pour l'épaisseur de la dernière section dans la littérature, il serait bénéfiquepour les enquêteurs de signaler ces données et / ou corriger le retrait des tissus lors de la déclaration des mesures de la morphologie des neurones. Il convient également de noter que, bien que l'épaisseur finale de> 200 um pour les sections coupées à 500 um est supérieure à la distance de travail de la plupart des objectifs à fort grossissement, cela est encore bien dans la distance de travail de l'objectif 30x utilisé dans notre laboratoire. Étant donné que les dendrites et les épines sont clairement visibles à proximité du fond de ces tranches en utilisant le protocole principal Golgi-Cox, il peut être possible de visualiser les neurones contenus dans des sections coupées à une épaisseur beaucoup plus importante jusqu'à et y compris la gamme de 1 mm.
Bien que ce protocole offre un certain nombre d'avantages, y compris la possibilité de tracer de longues arborisation dendritique dans les sections individuelles, la possibilité de retarder le découpage et le traitement des cerveaux imprégnés, et la possibilité de contre-coloration avec du violet de crésyl pour mieux identifier les structures du cerveau, il y a quelques inconvénients devraitêtre considéré. La période d'incubation de 25 jours peut être considéré comme trop long pour certains chercheurs. La capacité de l'image en profondeur dans les sections montées dépend de l'accès à un objectif d'immersion à haute résolution avec une longue distance de travail, ce qui est relativement cher. En outre, la capacité de visualiser des structures fines avec une haute résolution diminue à mesure que l'un des images proches de la partie inférieure de la tranche montée. La mise en œuvre de ce protocole dépend donc des propriétés morphologiques des neurones et de la région du cerveau à étudier, et l'équipement disponible à l'enquêteur. Nous recommandons l'utilisation d'échantillons « test » pour optimiser les variables de protocole avant l'exécution d'une étude de recherche, tels que le temps d'imprégnation Golgi-Cox pour la taille du cerveau et de la région d'intérêt, et le plan et l'épaisseur de la coupe de l'arbre dendritique à visualiser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention à la découverte de SBCDC du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), une subvention d'infrastructure de recherche du Fonds des leaders John R. Evans à SBCDC de la Fondation canadienne pour l'innovation (numéro de projet CFI 30381), et par une subvention à la découverte du CRSNG à NJM du. ELL a été soutenu par une bourse d'études supérieures de l'Ontario et par une bourse d'études OEV du Collège vétérinaire de l'Ontario à l'Université de Guelph. CDS a été pris en charge par un poste d'assistant de recherche des étudiants de premier cycle du CRSNG. ALM a été soutenu par une bourse d'études Alexander Graham Bell du CRSNG et par une bourse d'études OEV du Collège vétérinaire de l'Ontario à l'Université de Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
