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Neuroscience

मोटी मस्तिष्क धारा गोल्जी-कॉक्स विधि का प्रयोग भीतर इमेजिंग न्यूरॉन्स

Published: April 18, 2017 doi: 10.3791/55358
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

Summary

हम मोटी मस्तिष्क वर्गों में गोल्जी-कॉक्स धुंधला विधि का उपयोग कर, क्रम में लंबे वृक्ष के समान एक ऊतक के नमूने के भीतर निहित के पेड़ के साथ न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल के दो वेरिएंट भी प्रस्तुत कर रहे हैं कि शामिल cresyl बैंगनी counterstaining, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए असंसाधित दिमाग की ठंड।

Abstract

न्यूरॉन धुंधला की गोल्जी-कॉक्स विधि ऊतकीय मस्तिष्क के नमूने के भीतर न्यूरॉन आकृति विज्ञान की हमारी समझ अग्रिम करने के लिए और अधिक से अधिक दो सौ साल के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि यह, सबसे बड़ी मोटाई संभव पर मस्तिष्क वर्गों को तैयार करने के क्रम में रंगीन न्यूरॉन्स कि पूरी तरह से एकल वर्गों में शामिल हैं की पहचान करने की संभावना में वृद्धि करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से बेहतर है, इस दृष्टिकोण उच्च के काम दूरी के अनुसार एक तकनीकी नजरिए से सीमित है -magnification माइक्रोस्कोप उद्देश्यों। हम यहाँ माउस मस्तिष्क वर्गों में गोल्जी-कॉक्स विधि है कि 500 ​​सुक्ष्ममापी मोटाई में कटौती कर रहे हैं का उपयोग कर न्यूरॉन्स दाग के लिए, और एक ईमानदार खुर्दबीन एक उच्च संकल्प 30X 1.05 एनए सिलिकॉन के साथ लगे का उपयोग कर इन वर्गों की गहराई भर न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट तेल विसर्जन उद्देश्य एक 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी है। हम भी इस प्रोटोकॉल कि की सतह counterstain के लिए नियोजित किया जा सकता की दो उपयोगी वेरिएंट रिपोर्टcresyl वायोलेट निससल दाग के साथ मस्तिष्क वर्गों घुड़सवार, या सेक्शनिंग और अंतिम संसाधन से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए पूरे दिमाग को फ्रीज करने। मुख्य प्रोटोकॉल और उसके दो वेरिएंट रंगीन मोटी मस्तिष्क वर्गों, जो भर में पूर्ण न्यूरॉन वृक्ष के समान पेड़ों और डेन्ड्राइट कांटा मज़बूती से देखे जा सकते हैं और मात्रा निर्धारित उत्पादन।

Introduction

ऊतक के नमूने के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के दृश्य न्यूरॉन आकारिकी लक्षणों की सीटू विश्लेषण है, जो मस्तिष्क की हमारी समझ उन्नत काफी है और यह कैसे अंतर्जात रोग या एक्सोजेनस पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकता है के लिए अनुमति देता है। गोल्जी-कॉक्स धुंधला विधि एक लागत प्रभावी, मस्तिष्क के भीतर न्यूरॉन्स के नमूने के तौर पर धुंधला की अपेक्षाकृत सरल साधन है। सबसे पहले 1800 में गोल्जी 1 द्वारा विकसित और कॉक्स 2 द्वारा संशोधित, शोधकर्ताओं ने आगे पिछले कुछ वर्षों में इस तकनीक को परिष्कृत किया है स्पष्ट, अच्छी तरह से दाग न्यूरॉन्स कि कल्पना और दोनों वृक्ष के समान पेड़ आकृति विज्ञान और रीढ़ की हड्डी घनत्व 3, 4 यों किया जा सकता है निर्माण करने के लिए, 5, 6, 7, 8, 9।

मस्तिष्क वर्गों के भीतर दाग न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए एक प्रमुख तकनीकी विचार अधिकतम टुकड़ा मोटाई है, जो उपलब्ध उच्च आवर्धन / उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के काम दूरी के अनुसार सीमित है। 60 में आम तेल विसर्जन उद्देश्यों - 100X उत्कृष्ट समाधान प्रदान सीमा है, लेकिन उनके काम दूरी है कि आम तौर पर कोई 200 सुक्ष्ममापी से अधिक हैं द्वारा सीमित हैं। मस्तिष्क वर्गों 200 सुक्ष्ममापी रेंज में कटौती कुछ न्यूरॉन प्रकार है कि इस टुकड़ा मोटाई के भीतर समाहित किया जा सकता है, सेरेब्रल कॉर्टेक्स 10, 11, 12, के सीए 1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स के उथले परतों में उदाहरण के पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए कल्पना करने के लिए पर्याप्त हो सकता है हिप्पोकैम्पस 13, 14, और ग्रेन्युल हिप्पोकैम्पस 15 के देंताते जाइरस में कोशिकाओं। अपेक्षाकृत लंबे समय तक साथ न्यूरॉन्सइस तरह के सेरेब्रल कॉर्टेक्स की गहरी परतों के भीतर पिरामिड न्यूरॉन्स कि माउस सेल शरीर 16 से 800 से अधिक सुक्ष्ममापी विस्तार कर सकते हैं के लिए, एक अधिक से अधिक चुनौती प्रदान करते हैं क्योंकि दिमाग पूरे डेन्ड्राइट पेड़ को रोकने के लिए एक आदर्श कोण पर sectioned किया जा करने की आवश्यकता होगी के रूप में वृक्ष के समान पेड़, 200 सुक्ष्ममापी स्लाइस के भीतर। यह भी संभव नहीं हो सकता है अगर एक डेन्ड्राइट या उसकी शाखाओं में से किसी व्याख्यान चबूतरे वाला या दुम दिशा में विस्तार। हालांकि यह कई आसन्न मस्तिष्क वर्गों में एक न्यूरॉन अनुरेखण द्वारा इस सीमा को संबोधित करने के लिए संभव है, इस दृष्टिकोण 17 अनुरेखण के लिए सही ढंग से वर्गों संरेखित में एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। एक और अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण मस्तिष्क वर्गों है कि अधिक से अधिक मोटाई में कटौती कर रहे हैं के भीतर निहित पूरे न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए किया जाएगा।

गोल्जी-कॉक्स पद्धति का उपयोग करके चूहों के 500 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क वर्गों, और उनके मो कल्पना करने के लिए - हम यहाँ 400 के भीतर न्यूरॉन्स दाग के लिए एक तकनीक की रिपोर्टrphology एक उच्च संकल्प सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य एक 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी है कि का उपयोग कर। गोल्जी-कॉक्स संसेचन और प्रसंस्करण प्रोटोकॉल है कि हम का वर्णन साहित्य 6 में सबसे उद्धृत आधुनिक या प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है। मोटी मस्तिष्क वर्गों के साथ हमारा दृष्टिकोण किसी भी प्रकार कि पूरी तरह से अनुभाग के भीतर समाहित कर रहे हैं के न्यूरॉन्स की पहचान करने की संभावना को बढा का लाभ प्रदान करता है। मुख्य प्रोटोकॉल के अलावा, हम भी उपस्थित दो वेरिएशन कि अद्वितीय फायदे प्रदान करते हैं: (1) घुड़सवार वर्गों की सतह पर cresyl बैंगनी counterstain साथ गोल्जी-कॉक्स धुंधला क्रम में मस्तिष्क क्षेत्रों की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए और की परतों की पहचान के लिए सेरेब्रल कॉर्टेक्स, और सेक्शनिंग और अंतिम संसाधन से पहले गर्भवती पूरे दिमाग की लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक मध्यवर्ती ठंड कदम के साथ (2) गोल्जी-कॉक्स धुंधला।

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Protocol

वयस्क महिला CD1 तनाव चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। इसी प्रकार धुंधला विभिन्न उम्र में दोनों लिंगों का उपयोग कर पूरा किया जा सकता। प्रायोगिक पशुओं सिद्धांतों और पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार के लिए परवाह कर रहे थे, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल Guelph पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. गोल्जी-कॉक्स धुंधला

  1. बुद्धि की गोल्जी-कॉक्स संसेचन
    1. अलग से उच्च गुणवत्ता वाले पानी में पोटेशियम डाइक्रोमेट और पोटेशियम क्रोमेट भंग द्वारा 1% की गोल्जी-कॉक्स समाधान (w / v) पोटेशियम डाइक्रोमेट, 0.8% (w / v) पोटेशियम क्रोमेट और 1% (w / v) mercuric क्लोराइड बनाओ । समाधान मिक्स, mercuric क्लोराइड जोड़ सकते हैं और अंतिम समाधान ग्रेड 1 फिल्टर पेपर का उपयोग कर फ़िल्टर करें। अप करने के लिए एक महीने के लिए अंधेरे में समाधान स्टोर।
    2. माउस 5 isoflurane% का उपयोग anesthetize।
    3. कत्ल के द्वारा माउस euthanize और जल्दी से मस्तिष्क को हटा दें।
    4. मस्तिष्क एक 20 मल ग्‍लास सिंटिलेशन गोल्जी-कॉक्स समाधान के 17 एमएल युक्त शीशी में रखें और के लिए 25 डी आर टी पर अंधेरे में सेते हैं।
    5. यह एक 50 एमएल शंक्वाकार सुक्रोज cryoprotectant के 40 एमएल युक्त ट्यूब में 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में (30% 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 में (w / v) सुक्रोज) रखकर मस्तिष्क Cryoprotect।
      ध्यान दें: निम्नलिखित वैकल्पिक तीन चरणों आदेश लंबी अवधि के भंडारण के लिए इस स्तर पर मस्तिष्क फ्रीज करने में, मुख्य प्रोटोकॉल के लिए एक विकल्प के रूप में नियोजित किया जा सकता।
    6. 200 एमएल isopentane कि सूखी बर्फ पर precooled कर दिया गया है में विसर्जित करके पूरे मस्तिष्क फ्रीज।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और अंधेरे में दुकान में जमे हुए मस्तिष्क रखें।
    8. जब आगे बढ़ने के लिए तैयार है, यह एक 50 एमएल शंक्वाकार 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सुक्रोज cryoprotectant के 40 एमएल युक्त ट्यूब में रखकर मस्तिष्क पिघलना।
  2. मस्तिष्क सेक्शनिंग
    1. सुक्रोज और गुट से मस्तिष्क निकालेंसेरिबैलम एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर काट और मस्तिष्क के शेष दुम अंत में एक फ्लैट बढ़त को छोड़ कर सेक्शनिंग के लिए यह k।
    2. हीट अगर (3% (w / v) पानी में) जब तक यह पिघल और ठंडा होने जब तक यह अपने गलनांक से थोड़ा ऊपर है।
    3. इसकी दुम अंत चेहरे से नीचे के साथ एक छोटी-सी डिस्पोजेबल वजन डिश में मस्तिष्क रखें और मस्तिष्क को कवर करने के पिघल अगर की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें।
    4. एक बार अगर जम गया है, लगभग 2 छोड़ने अतिरिक्त अगर ट्रिम - मस्तिष्क आसपास के 4 मिमी और उसके दुम अंत का सामना नीचे एथिल cyanoacrylate गोंद की एक छोटी राशि का उपयोग कर के साथ एक vibratome का चरण के लिए मस्तिष्क गोंद।
    5. सुक्रोज cryoprotectant की पर्याप्त मात्रा के साथ vibratome के मंच क्षेत्र भरें 400 का एक टुकड़ा मोटाई कम से मस्तिष्क, और खंड मस्तिष्क को कवर करने के - 500 सुक्ष्ममापी (मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर जांच की जा करने के लिए) 86 हर्ट्ज की एक कंपन आवृत्ति का उपयोग और 0.125 मिमी / की एक पत्ती उन्नति की गति।
    6. एक छोटी सी पेंट ब्रश का उपयोग करना, एक 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध जाल नीचे आवेषण और युक्त थाली के एक कुएँ में जगह मस्तिष्क वर्गों पहले से भरे 6% के 10 एमएल (w / v) 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 में सुक्रोज के साथ।
    7. 4 डिग्री सीओ / एन पर अंधेरे में वर्गों सेते हैं।
  3. मस्तिष्क वर्गों का विकास
    1. जाल नीचे आवेषण का उपयोग करना, 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 में एक नया अच्छी तरह से 2% की 5 एमएल (w / v) paraformaldehyde (PBD) युक्त में मस्तिष्क वर्गों हस्तांतरण। एक रॉकर 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में धीमी गति से आगे बढ़ पर सेते हैं।
    2. वर्गों उन्हें पानी की 5 एमएल युक्त नए कुओं स्थानांतरित करके दो बार धोएं। एक रॉकर 5 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक मध्यम गति से आगे बढ़ पर धो लें।
    3. 2.7% (v / v) अमोनियम हाइड्रॉक्साइड 5 एमएल युक्त एक नया कुएं में स्थानांतरण वर्गों। एक रॉकर 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक धीमी गति से आगे बढ़ पर सेते हैं।
    4. वर्गों उन्हें पानी की 5 एमएल युक्त नए कुओं स्थानांतरित करके दो बार धोएं। धो ओna रॉकर 5 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक मध्यम गति से घूम रहा है।
    5. एक नया अच्छी तरह से लगानेवाला एक 5 एमएल युक्त में स्थानांतरण वर्गों (देखें सामग्री तालिका) है कि पानी 10x में अपने मूल खरीदा एकाग्रता से पतला किया गया है। एक रॉकर 25 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक धीमी गति से आगे बढ़ पर सेते हैं।
    6. वर्गों उन्हें पानी की 5 एमएल युक्त नए कुओं स्थानांतरित करके दो बार धोएं। एक रॉकर 5 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक मध्यम गति से आगे बढ़ पर धो लें।
  4. मस्तिष्क धारा बढ़ते
    1. एक छोटी सी पेंट ब्रश का प्रयोग, खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों माउंट। अतिरिक्त पानी निकाल दें और चिमटी और एक छोटे से ऊतक का उपयोग कर अगर। सुनिश्चित करें कि सभी अगर निर्जलीकरण के साथ आगे बढ़ने से पहले हटा दिया जाता है।
    2. लगभग 45 मिनट के लिए (400 सुक्ष्ममापी वर्गों) या 90 मिनट (500 सुक्ष्ममापी वर्गों) के लिए आर टी पर हवा शुष्क करने के लिए वर्गों की अनुमति दें।
      नोट: सूखापन के समय और उचित स्तर महत्वपूर्ण है, और प्रत्येक में निर्धारित किया जा करना पड़ सकता हैप्रयोगशाला परिवेश के तापमान और आर्द्रता के स्तर पर निर्भर करता है। बहुत छोटा एक सुखाने समय बाद निर्जलीकरण चरणों के दौरान स्लाइड के गिरने वर्गों की ओर जाता है, और बहुत लंबा एक सुखाने समय खुर वर्गों की ओर जाता है। धारा अभी भी सूखापन की उचित स्तर पर चमकदार होने के लिए दिखाई देगा।
    3. के रूप में इंगित Coplin धुंधला जार में स्लाइड रखकर cresyl बैंगनी साथ दाग वर्गों।
      नोट: यह वैकल्पिक कदम आदेश cresyl बैंगनी साथ neuronal नाभिक दाग करने के लिए, वर्गों है कि जमे हुए नहीं किया गया था के लिए नियोजित किया जा सकता। हमने पाया है कि साफ करने और cresyl बैंगनी में ऊष्मायन से पहले वर्गों rehydrating भी धुंधला हो जाना और वर्गों में कम पृष्ठभूमि की ओर जाता है है।
      1. 5 मिनट के लिए एजेंट के समाशोधन में रखें। एक बार पुन: दोहराएं।
      2. 100% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए रखें। एक बार पुन: दोहराएं।
      3. 95% इथेनॉल में पानी में 2 मिनट प्रत्येक के लिए पानी में तो 50% इथेनॉल के पानी में 75% इथेनॉल रखें, उसके बाद, और।
      4. पानी में 5 मिनट के लिए रखें।
      5. 0.5% में रखें (w / v) रचनात्मक7 मिनट के लिए पानी में syl बैंगनी।
      6. पानी में 2 मिनट के लिए रखें। एक बार पुन: दोहराएं।
    4. के रूप में इंगित Coplin धुंधला जार में स्लाइड रखकर वर्गों निर्जलीकरण।
      1. 50% इथेनॉल में पानी में 2 मिनट प्रत्येक के लिए पानी में तो 95% इथेनॉल पानी में 75% इथेनॉल रखें, उसके बाद, और।
      2. 100% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए रखें। एक बार पुन: दोहराएं।
      3. 5 मिनट के लिए एजेंट के समाशोधन में रखें। एक बार पुन: दोहराएं।
        नोट: ये निर्जलीकरण और समाशोधन बार इस पांडुलिपि में वर्णित के रूप माउस दिमाग पर कार्रवाई करने के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, हम चूहे और cowbird सहित अन्य प्रजातियों के लिए देखा है, कि अंतिम समाशोधन कदम 15 मिनट के कुल तक बढ़ाया जा करना पड़ सकता है।
    5. Coverslip वर्गों एक निर्जल बढ़ते माध्यम का उपयोग।
    6. स्लाइड के लिए कम से कम 5 डी आर टी पर अंधेरे में क्षैतिज सुखाने के लिए अनुमति दें।

मोटी मस्तिष्क वर्गों के भीतर 2. इमेजिंग स्टेन्ड न्यूरॉन्स

  1. छवि ढेर कैप्चरिंग
  2. माइक्रोस्कोप प्रकाश बल्ब, कैमरा, और चरण नियंत्रक चालू करें।
  3. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (जैसे, Neurolucida) खोलें।
  4. माइक्रोस्कोप के मंच पर एक स्लाइड रखें।
  5. इस तरह के 1.25x 0.4 एनए PlanAPO या 4 एक्स 0.16 एनए के रूप में एक कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग कर मस्तिष्क खंड के एक 2D चौड़े दृश्य छवि पर कब्जा
    1. छवि ध्यान केंद्रित करने और जोखिम समय और सफेद संतुलन सहित कैमरा सेटिंग्स समायोजित करें।
    2. खंड पर कहीं भी छोड़ दिया क्लिक करके एक संदर्भ बिंदु बनाएं
    3. "एकल छवि अधिग्रहण" छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर का चयन करके छवि कैप्चर करें।
  6. ब्याज की न्यूरॉन्स (रों) युक्त क्षेत्र के मध्य-रिज़ॉल्यूशन वाली छवि के ढेर पर कब्जा, एक 10X 0.3 एनए UPlan FL एन उद्देश्य का उपयोग कर।
    1. छवि ध्यान केंद्रित करने और जोखिम और सफेद संतुलन सहित कैमरा सेटिंग्स समायोजित करें।
    2. की धारा एक शीर्ष करने के लिए ध्यान केंद्रित करके छवि ढेर के लिए ऊपरी और निचले सीमाएं निर्धारितnd का चयन "सेट" छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "ढेर के शीर्ष" के बगल में, और फिर अनुभाग के नीचे करने के लिए ध्यान केंद्रित कर और का चयन छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "सेट" करने के लिए "ढेर के नीचे" अगले।
    3. छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "छवियों के बीच की दूरी" "5 सुक्ष्ममापी" के बगल में दर्ज करके 5 सुक्ष्ममापी करने के लिए कदम दूरी स्थापित करें।
    4. छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "अधिग्रहण छवि ढेर" का चयन करके छवि ढेर कैप्चर करें।
    5. ब्याज की पूरे क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए ऊपर के चरणों को दोहराएँ, यह सुनिश्चित करें कि सभी छवि के ढेर एक्स और वाई अक्ष में कम से कम 10% से ओवरलैप बना रही है।
  7. ब्याज की न्यूरॉन युक्त क्षेत्र के उच्च संकल्प छवि के ढेर पर कब्जा, एक 30X 1.05 एनए सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर।
    1. स्लाइड के लिए सिलिकॉन विसर्जन तेल के 4 बूँदें और स्लाइड से अधिक उद्देश्य जगह, उद्देश्य और Oi के बीच संपर्क बनाने के लिए यह सुनिश्चित करना - 3 लागू करेंएल।
    2. छवि ध्यान केंद्रित करने और जोखिम और सफेद संतुलन सहित कैमरा सेटिंग्स समायोजित करें।
    3. खंड के शीर्ष करने के लिए ध्यान केंद्रित कर और का चयन "सेट" द्वारा छवि ढेर के लिए ऊपरी और निचले सीमाएं निर्धारित छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर, और फिर "ढेर के शीर्ष" खंड की तह तक ध्यान केंद्रित कर के बगल "सेट" छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "ढेर के नीचे" के बगल में।
    4. छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "छवियों के बीच की दूरी" "1 सुक्ष्ममापी" के बगल में दर्ज करके 1 सुक्ष्ममापी करने के लिए कदम दूरी स्थापित करें।
    5. छवि अधिग्रहण खिड़की के भीतर "अधिग्रहण छवि ढेर" का चयन करके छवि ढेर कैप्चर करें।
    6. ब्याज की पूरे क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए ऊपर के चरणों को दोहराएँ, यह सुनिश्चित करें कि सभी छवि के ढेर एक्स और वाई अक्ष में कम से कम 10% से ओवरलैप बना रही है।
  8. डेटा फ़ाइल सहेजें और बाहरी प्रसंस्करण के लिए TIFF प्रारूप में सभी छवि फ़ाइलें सहेजें।
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  • जेड प्रक्षेपण छवियाँ और छवि montages बनाने के
    1. ImageJ में जेड प्रक्षेपण चित्र बनाएं
      1. ओपन ImageJ सॉफ्टवेयर है कि जैव प्रारूप प्लगइन स्थापित किया है।
      2. का चयन करें "प्लग इन" -> "जैव प्रारूप" -> "जैव प्रारूप आयातक"।
      3. खोले जाने के लिए छवि ढेर फ़ाइल का चयन करें।
      4. > "प्रकार" - -> "आरजीबी रंग" एक बार जब फ़ाइल को खोला गया है, "छवि" का चयन करके आरजीबी के लिए प्रारूप बदल जाते हैं।
      5. "छवि" का चयन करके जेड प्रक्षेपण बनाएं -> "ढेर" -> "जेड परियोजना ..."।
      6. एक TIFF फ़ाइल के रूप में दो आयामी जेड प्रक्षेपण छवि सहेजें।
    2. ब्याज की पूरे क्षेत्र के एक द्वि-आयामी चित्र असेंबल बनाएँ।
      1. सॉफ्टवेयर (जैसे, एडोब फोटोशॉप) खोलें।
      2. "फाइल" का चयन करें -> "स्वचालित करें" -> "Photomerge"।
      3. "ब्राउज़ करें" का चयन करें और फिर सभी imag जोड़नेतों फ़ाइलें विलय कर दिया जाए।
      4. सुनिश्चित करें कि "एक साथ छवियाँ ब्लेंड" चयनित है और फिर "ठीक है"।
      5. एक TIFF फ़ाइल के रूप में ब्याज की पूरे क्षेत्र की जिसके परिणामस्वरूप असेंबल छवि सहेजें।

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    Representative Results

    500 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क वर्गों - यह गोल्जी-कॉक्स धुंधला प्रोटोकॉल और उसके दो वैकल्पिक वेरिएंट वर्णित 400 के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए नियोजित किया जा सकता। दो आयामी जेड अनुमानों के प्रतिनिधि छवि montages एक 10X उद्देश्य और जेड अक्ष में 5 सुक्ष्ममापी चरणों का उपयोग कर कब्जा कर लिया चित्र 1 में दिखाया गया है: A1 - कोरोनल मस्तिष्क वर्गों का एक बड़ा क्षेत्र है कि पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था क्षेत्र 1 और भी शामिल है के लिए सी 1 माध्यमिक मोटर प्रांतस्था 18। धारा 500 सुक्ष्ममापी में काट रहे थे। ध्यान दें कि प्रोटोकॉल संस्करण कि cresyl वायलेट धुंधला शामिल के रूप में cortical परत 1 चित्रा 1B1 में वर्गों के pial सतह के साथ के लिए देखा उदाहरण के लिए, cortical सेल परतों की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह भी ध्यान रखें रंगीन वर्गों की इसी तरह की उपस्थिति जब सब-ताजा ऊतक (चित्रा 1A1) और प्रोटोकॉल संस्करण का उपयोग कर मुख्य प्रोटोकॉल का उपयोग, जिसमेंदिमाग लंबी अवधि के भंडारण (चित्रा 1C1) के लिए के माध्यम से भाग रास्ता जमे हुए हैं।

    एक उच्च संकल्प 30X 1.05 एनए सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करते हैं, कि एक्स में बड़े होते हैं और वाई में एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया उन लोगों की तुलना अक्ष छवि के ढेर पर कब्जे के लिए अनुमति देता है इस प्रकार एक दिया छवि के लिए कम कुल ढेर की आवश्यकता होती है पंसदीदा छेत्र। विशेष रूप से कार्यरत उद्देश्य एक 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी, जो छवि मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए अधिक से अधिक पर्याप्त है है। दो आयामी जेड अनुमानों के छवि montages इस उद्देश्य को और Z अक्ष में 1 सुक्ष्ममापी चरणों का उपयोग कर कब्जा कर लिया पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था क्षेत्र 1 के भीतर चित्रा 1 (ए 2-C2) में दिखाया गया है, और के लिए ट्रेसिंग के दो आयामी जेड अनुमानों सी 3 - ए 3: संकेत दिया न्यूरॉन्स चित्र 1 में दिखाया गया है। ध्यान दें कि न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए उच्च संकल्प छवियों और के माध्यम से अपने डेन्ड्राइटप्रत्येक छवि ढेर की गहराई। प्रोटोकॉल cresyl बैंगनी का उपयोग कर संस्करण टुकड़ा भर में बैंगनी Nissl धुंधला कहते हैं, मानकों तथापि साथ कार्यरत इस सेलुलर धुंधला केवल टुकड़ा के शीर्ष के निकट मनाया जाता है। प्रोटोकॉल संस्करण है कि वैकल्पिक ठंड कदम भी शामिल है, लेकिन यह भी है कि टुकड़ा की सतह के नीचे प्रकाश diffracting द्वारा धुन्ध की उपस्थिति बनाता है एक विसरित पृष्ठभूमि धुंधला परिचय न्यूरॉन धुंधला है कि मुख्य प्रोटोकॉल के समान है पैदा करता है,। इस धुंध सबसे स्पष्ट जब टुकड़ा में गहरी इमेजिंग और चित्रा 1C2 में जेड प्रक्षेपण छवि में स्पष्ट है। 30X उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया छवियाँ भी कल्पना और इस तरह के वृक्ष के समान spines रूप में ठीक न्यूरोनल संरचनाओं यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल विमान छवियों एक छवि खंड के शीर्ष के पास ले जाया गया और एक छवि अनुभाग के तल के पास ले जाया साथ, मुख्य प्रोटोकॉल और उसके दो वेरिएंट का उपयोग कर दाग डेन्ड्राइट के लिए चित्र 2 में दिखाया गया है। नोट purplचित्रा 2B1, में अनुभाग जो चित्रा 2B2 में अनुभाग के तल के पास के रूप में फैलाना बैंगनी पृष्ठभूमि / बिखरे हुए प्रकाश में देखा जाता है के शीर्ष के निकट व्यक्ति न्यूरोनल नाभिक के भीतर Nissl पदार्थ की ई cresyl वायलेट धुंधला। यह भी ध्यान रखें कि हालांकि डेन्ड्राइट और उनके कांटा ठंड कदम है, पहले से उल्लेख किया पृष्ठभूमि धुन्ध कि चित्रा 2C2 में टुकड़ा के तल के पास स्पष्ट है इसे और अधिक मुश्किल के बीच विरोधाभास को सीमित करके कांटा कल्पना करने के लिए बनाता है के साथ प्रोटोकॉल का उपयोग अच्छी तरह से दाग हैं उन्हें और आसन्न पृष्ठभूमि। उच्च आवर्धन उद्देश्यों भी चित्र 2 में वृक्ष के समान रीढ़ आकृति विज्ञान चिह्नित करने के लिए, शो के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता: ए 3 - सी 3 जहां भिन्न प्रकार के मेरुदंड तीन प्रोटोकॉल में से प्रत्येक का उपयोग कर दाग वर्गों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। यहाँ, एक 60x एनए 1.42 तेल-विसर्जन उद्देश्य इस्तेमाल किया गया था। हम भी इस धुंधला प्रोटोकॉल और उसके संस्करण hippoc भीतर न्यूरॉन्स दाग करने के लिए नियोजितवर्गों के ampus 400 सुक्ष्ममापी में काट लें। और खंड के अधिक पार्श्व क्षेत्रों (जैसे -: जैसा कि 3 चित्र में दिखाया, न्यूरॉन डेन्ड्राइट और कांटा अधिक औसत दर्जे का (सी 2 ए 2 जैसे, हिप्पोकैम्पस 3 चित्र में देंताते जाइरस क्षेत्र) खंड के क्षेत्रों की ओर दोनों देखे जा सकते हैं , 3 चित्र में हिप्पोकैम्पस सीए 3 क्षेत्र: A3 - सी 3)। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्येक धुंधला हालत इसी तरह के परिणाम, आंकड़े 1 और 2 सेरेब्रल कॉर्टेक्स के लिए में दिखाया गया है उन लोगों के लिए फायदे और नुकसान का उत्पादन किया।

    संसाधित मस्तिष्क वर्गों के अंतिम मोटाई कार्यरत विशिष्ट प्रोटोकॉल संस्करण पर निर्भर करता है। जैसा कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स युक्त वर्गों के लिए चित्रा 4 ए में दिखाया गया है और 500 सुक्ष्ममापी में कटौती, वहाँ संसाधित मापा मोटाई पर प्रोटोकॉल संस्करण की एक महत्वपूर्ण प्रभाव था और घुड़सवार / coverslipped वर्गों (एक तरह से एनोवा, पी <0.0001)। इधर, वर्गों की मोटाई मुख्य प्रोटोकॉल का उपयोग किया (251.0 ± 12.5 (SEM) सुक्ष्ममापी (n = 6)) और cresyl बैंगनी से जुड़े प्रोटोकॉल संस्करण (219.3 ± 8.5 सुक्ष्ममापी (n = 6)) वर्गों की मोटाई से छोटी थी ठंड कदम (340.6 ± 17.1 सुक्ष्ममापी (n = 6)) (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण, 0.0006 ≤ प्रत्येक तुलना पी) को शामिल प्रोटोकॉल संस्करण का उपयोग किया। प्रोटोकॉल संस्करण के बहुत समान प्रभाव हिप्पोकैम्पस युक्त वर्गों के लिए मनाया जाता है और 400 सुक्ष्ममापी (चित्रा 4 बी, एक तरह से एनोवा, पी <0.0001) में काट रहे थे। इधर, वर्गों की मोटाई मुख्य प्रोटोकॉल का उपयोग किया (217.6 ± 19.2 सुक्ष्ममापी (n = 6)) और प्रोटोकॉल संस्करण को शामिल cresyl बैंगनी (198.0 ± 14.8 सुक्ष्ममापी (n = 6)) वर्गों की मोटाई से छोटी थी का उपयोग करके बनाया प्रोटोकॉल संस्करण ठंड कदम (313.5 ± 8.4 सुक्ष्ममापी (n = 6)) (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण, 0.001 ≤ प्रत्येक तुलना पी) को शामिल।


    चित्र 1 पूर्वकाल सिंगुलेट क्षेत्र में स्टेन्ड न्यूरॉन्स के अनुकरणीय Photomicrographs 1. A1 - सी 1, एक 10X उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त कर लिया छवि के ढेर के मर्ज किए गए जेड अनुमानों सेरेब्रल कॉर्टेक्स कि पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था क्षेत्र 1 और माध्यमिक शामिल में से एक गोलार्द्ध के लिए दिखाए जाते हैं मोटर प्रांतस्था लगभग शीर्षस्थान 1.18 मिमी 18। इन वर्गों 500 सुक्ष्ममापी में काट रहे थे। Photomicrographs, मुख्य अखिल ताजा प्रोटोकॉल (A1) का उपयोग कर cresyl वायलेट धुंधला (बी 1) के साथ नए सिरे प्रोटोकॉल संस्करण के लिए और प्रोटोकॉल प्रकार, जिसमें दिमाग गोल्जी-कॉक्स संसेचन (C1) निम्नलिखित जमे हुए हैं के लिए दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों 500 सुक्ष्ममापी हैं। लाल वर्ग ने संकेत दिया प्रत्येक क्षेत्र के लिए सी 2 - उच्च संकल्प जेड प्रक्षेपण छवि के ढेर एक 30X सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त कर लिया ए 2 में दिखाया गया है विलय कर दियाA1 में photomicrographs में uare - सी 1। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं। न्यूरॉन ट्रेसिंग के 2 डी जेड अनुमानों ए 3 में दिखाए जाते हैं - सी 2 - ए 2 में photomicrographs में लाल तीर द्वारा संकेत न्यूरॉन्स के लिए सी 3। सभी डेन्ड्राइट के व्यास चित्रण में आसानी के लिए 2 सुक्ष्ममापी करने के लिए निर्धारित किया गया। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2. स्टेन्ड न्यूरॉन्स के लिए वृक्ष के समान spines के अनुकरणीय Photomicrographs। Photomicrographs एक 30X सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया न्यूरॉन पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था क्षेत्र 1. इन सेक्शनों में 500 सुक्ष्ममापी में काट रहे थे की परत 1 के भीतर स्थित डेन्ड्राइट के लिए एक फोकल विमान में दिखाए जाते हैं। न्यूरॉन्स च का उपयोग कर दाग रहे थे resh प्रोटोकॉल (A1, A2), cresyl वायलेट धुंधला (बी 1, बी 2) और प्रोटोकॉल प्रकार, जिसमें दिमाग गोल्जी-कॉक्स संसेचन (C1, C2) निम्नलिखित जमे हुए हैं के लिए के साथ प्रोटोकॉल संस्करण। (A2 - सी 2) - (सी 1 A1) और माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए अगले टुकड़ा के नीचे स्थित Photomicrographs टुकड़ा के शीर्ष के निकट ले जाया गया। स्केल A1-2, B1-2 और C1-2 के लिए सलाखों के 50 सुक्ष्ममापी हैं। Photomicrographs, ए 3, बी 3 और सी 3 एक फोकल एक उच्च आवर्धन 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर विमान के लिए में दिखाए जाते हैं क्रम अलग रीढ़ प्रकारों की पहचान करने में। स्केल ए 3, बी 3 और सी 3 के लिए सलाखों के 10 सुक्ष्ममापी हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    चित्रा 3. हिप्पोकैम्पस में स्टेन्ड न्यूरॉन्स के अनुकरणीय Photomicrographs। Photomicrographs एक 4 एक्स उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया सी 1 ताजा प्रोटोकॉल (A1), cresyl वायलेट धुंधला (बी 1) के साथ प्रोटोकॉल संस्करण का उपयोग कर दाग न्यूरॉन्स के लिए एक फोकल हवाई जहाज़ में दिखाए जाते हैं और प्रोटोकॉल संस्करण के लिए है, जिसमें दिमाग गोल्जी-कॉक्स संसेचन निम्नलिखित जमे हुए हैं ( )। धारा 400 सुक्ष्ममापी में काट रहे थे और लगभग शीर्षस्थान -2.18 मिमी 18 पर दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों A1 के लिए 500 सुक्ष्ममापी हैं - सी 1। उच्च आवर्धन photomicrographs एक 30X सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया और न्यूरॉन के लिए एक फोकल हवाई जहाज़ में दिखाए जाते हैं हिप्पोकैम्पस के देंताते जाइरस क्षेत्र के भीतर स्थित डेन्ड्राइट (A2 - सी 2) और हिप्पोकैम्पस के सीए 3 क्षेत्र (ए 3 - सी 3)। स्केल सलाखों ए 2 के लिए 50 सुक्ष्ममापी हैं - सी 2और ए 3 - सी 3। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्र 4. घुड़सवार धारा की मोटाई। घुड़सवार वर्गों की मापा मोटाई लगभग सेरेब्रल कॉर्टेक्स शीर्षस्थान 1.18 मिमी 18 युक्त वर्गों के लिए एक में दिखाया गया है और 500 सुक्ष्ममापी मोटाई में कटौती, और हिप्पोकैम्पस पर लगभग शीर्षस्थान -2.18 मिमी 18 युक्त वर्गों के लिए बी में और 400 सुक्ष्ममापी में कटौती मोटाई। मापा वर्गों या तो ताजा प्रोटोकॉल, cresyl वायलेट धुंधला के साथ प्रोटोकॉल संस्करण है, या प्रोटोकॉल प्रकार, जिसमें दिमाग गोल्जी-कॉक्स संसेचन निम्नलिखित जमे हुए हैं का उपयोग कर दाग रहे थे। दोनों मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए, वहाँ प्रसंस्करण प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण प्रभाव था(एक तरह से एनोवा, पी <0.0001), जहां दिमाग कि प्रोटोकॉल के माध्यम से जमे हुए भाग रास्ता थे से वर्गों उन है कि जमे हुए नहीं थे की तुलना में काफी मोटा थे (Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण, सभी पी <0.001)। डाटा प्रत्येक समूह में छह वर्गों के लिए के रूप में मतलब ± SEM दिखाए जाते हैं, और अलग अलग पत्र के साथ डेटा सेट काफी अंतर से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    हम यहाँ दो उपयोगी वेरिएंट के साथ एक गोल्जी-कॉक्स धुंधला प्रोटोकॉल मोटी मस्तिष्क वर्गों के भीतर न्यूरॉन्स दृश्यमान करने के लिए का वर्णन। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है, एक लंबे 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी है कि एक उच्च संकल्प उद्देश्य के उपयोग मस्तिष्क वर्गों 500 सुक्ष्ममापी में कटौती की गहराई भर पूरे न्यूरॉन्स की विश्वसनीय दृश्य के लिए अनुमति देता है। अपेक्षाकृत मोटी मस्तिष्क वर्गों के इस अध्ययन में संभावना है कि किसी भी प्रकार की दाग ​​न्यूरॉन्स पूरी तरह से टुकड़ा है, जो लंबी और जटिल शिखर डेन्ड्राइट के पेड़ के साथ पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के भीतर समाहित कर रहे हैं बढ़ जाती है। उदाहरण के लिए, कृंतक मस्तिष्क के कोरोनल वर्गों में, इस न्यूरॉन्स कि व्याख्यान चबूतरे वाला या दुम दिशा में आगे विस्तार के शामिल किए जाने के लिए अनुमति देता है, और जब सेक्शनिंग कदम पर वर्गाकार मस्तिष्क को अवरुद्ध भी त्रुटि के लिए कमरे बढ़ जाती है। हालांकि हम कोरोनल विमान केवल, इस प्रोटोकॉल अन्य pl में अनुभाग के लिए अनुकूलित किया जा सकता में अनुभाग मस्तिष्क का वर्णनके रूप में आवश्यक anes पूरी तरह से एकल वर्गों का नाम दिया न्यूरॉन्स होते हैं करने के लिए। सेक्शनिंग कार्यरत के विमान की जांच की जा न्यूरॉन आबादी का रूपात्मक गुण पर निर्भर करेगा। वृक्ष के समान कांटा कल्पना और हालांकि उच्च आवर्धन उद्देश्यों रीढ़ प्रकार / 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य चित्र 2 में photomicrographs का उत्पादन किया जाता के रूप में ऐसी आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है: ए 3 - सी 3। यह मोटी वर्गों में नियोजित किया जा सकता है, लेकिन उद्देश्य के काम दूरी के भीतर टुकड़ा के शीर्ष तक सीमित है। यह प्रोटोकॉल भी समान मस्तिष्क के आकार की विभिन्न प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में हम अतिरिक्त गैर विशिष्ट धुंधला या पृष्ठभूमि के लिए अग्रणी के बिना पाया है कि एक मानक 25 दिन की संसेचन अवधि पूरी तरह से दाग होगा माउस, चूहा और cowbird मस्तिष्क भर न्यूरॉन्स कि एक महीने से परे संसेचन समय के साथ हो सकता है। छोटे संसेचन अवधि के साथ प्रजातियों के लिए पर्याप्त हो सकता हैmaller दिमाग या उपर्युक्त प्रजातियों, जो व्यक्तिगत अन्वेषक द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है से दिमाग की विच्छेदित नमूनों में।

    इस धुंधला प्रोटोकॉल के लिए प्रस्तुत तीन वेरिएंट में से, ताजा मस्तिष्क नमूने का उपयोग मुख्य प्रोटोकॉल counterstained नहीं कर रहे हैं सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त होते हैं। चित्र 2 ए में Photomicrographs है कि इस मुख्य प्रोटोकॉल अच्छी तरह से लेबल डेन्ड्राइट और कांटा है कि आसानी से ऊपर और घुड़सवार मोटी वर्गों के तल के पास दिखाई दे रहे हैं पैदा करता है का प्रदर्शन। cresyl बैंगनी counterstain जोड़ा जा रहा है मस्तिष्क क्षेत्रों और सेरेब्रल कॉर्टेक्स परतों की परिभाषा को सुविधाजनक बनाने का लाभ दिया है, लेकिन जब मोटी वर्गों में गहरी visualizing भी एक फैलाना बैंगनी पृष्ठभूमि गयी। हालांकि, बाद से इस प्रोटोकॉल संस्करण केवल दाग cresyl बैंगनी, डेन्ड्राइट और उनके कांटा के साथ घुड़सवार मोटी वर्गों की सतह वर्गों के नीचे (चित्रा 2 बी) के पास स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे। यह भी produ प्रतीत होता हैपहले से, रिपोर्ट में यहां तक कि जब बहुत पतली वर्गों 19, 20, 21 का उपयोग करते हुए दिखाया गया है कि तुलना में मोटी वर्गों की सतह के पास Nissl धुंधला का एक स्पष्ट पैटर्न सीई। प्रोटोकॉल संस्करण है कि ठंड के कदम शामिल हैं वृक्ष के समान पेड़ आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए स्वीकार्य परिणाम प्राप्त होते हैं। हालांकि, पृष्ठभूमि धुंधला ताजा ऊतक है, जो सबसे ध्यान देने योग्य है जब इस प्रकार टुकड़ा में गहरी इमेजिंग इसे और अधिक मुश्किल कल्पना और डेन्ड्राइट कांटा (चित्रा 2 सी) अंदाजा लगाना बनाने में तुलना में बहुत गहरा है। हम दिमाग से वर्गों कि जमे हुए किया गया था में cresyl बैंगनी counterstain का प्रयास किया है, और यह एक और भी-गहरा बैंगनी पृष्ठभूमि धुन्ध है कि यह बहुत ही मुश्किल अनुभाग के नीचे स्थित कल्पना और कांटा यों के लिए किए गए उत्पादन (डेटा नहीं दिखाया गया है)। एक और असफल प्रोटोकॉल संस्करण हैं जिनका मूल्यांकन किया गया था शामिल गोल्जी-कॉक्स impregn करने के लिए माउस दिमाग ठंड से पहलेसमझना। यह सेलुलर वस्तुओं glia किया गया हो सकता है की धुंधला आये लेकिन न्यूरॉन के किसी भी प्रकार के दाग नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

    इस प्रोटोकॉल कि सफल परिणाम प्राप्त करने के पालन किया जाना चाहिए में दो महत्वपूर्ण कदम हैं। (1) यह प्रत्येक प्रयोगशाला के भीतर वर्गों के सुखाने समय सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह तापमान और आर्द्रता पर बहुत निर्भर है। यदि सुखाने समय बहुत छोटा है, वर्गों निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान स्लाइड गिर जाएगा; यदि सुखाने समय बहुत लंबा है, वर्गों दरार होगा। यह, "परीक्षण" दिमाग सिर्फ एक शोध अध्ययन preforming से पहले का एक सेट में सुखाने समय सत्यापित करने के लिए लाभप्रद हो के रूप में इस एक ही प्रयोगशाला के साथ मौसम से भिन्न हो सकते हैं होगा। (2) सभी अतिरिक्त अगर अनुभाग और निर्जलीकरण चरणों से पहले खुर्दबीन स्लाइड से हटा दिया जाना चाहिए। यदि ऐसा नहीं किया जाता, अगर ख़राब होगा और स्लाइड के बंद खंड खींच सकता है।

    histologic के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारकजैविक नमूनों की अल विश्लेषण ऊतक संकोचन है। हमने पाया है कि प्रसंस्करण के बाद, बढ़ते निर्जलित प्रक्रिया और मुख्य गोल्जी-कॉक्स प्रोटोकॉल है कि अंतिम खंड मोटाई मूल कटौती मूल्य के लगभग आधे से कम हो गया था (चित्रा 4) का उपयोग कर मस्तिष्क वर्गों coverslipping। यह भी ध्यान रखें कि वर्गों प्रोटोकॉल संस्करण है कि ठंड कदम शामिल का उपयोग करके संसाधित ताजा वर्गों है कि मुख्य प्रोटोकॉल (चित्रा 4) के माध्यम से प्रोसेस किया गया की तुलना में काफी मोटा थे। यह दोनों रोचक और अप्रत्याशित है क्योंकि दोनों प्रोटोकॉल एक ही cryoprotection और प्रसंस्करण चरणों शामिल है, और केवल दिमाग की वास्तविक ठंड से अलग था। इसलिए यह जब विभिन्न अध्ययनों से या अलग प्रयोगशालाओं से गोल्जी-कॉक्स धुंधला उपयोग करते हुए उत्पन्न न्यूरॉन आकृति विज्ञान डेटा की तुलना प्रोटोकॉल में संभावित मतभेद के लिए खाते के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि हम के लिए साहित्य में अंतिम अनुभाग मोटाई डेटा खोजने के लिए सक्षम नहीं थे, यह फायदेमंद हो सकता हैजब न्यूरॉन आकृति विज्ञान के उपायों रिपोर्टिंग जांचकर्ताओं इस डेटा और / या ऊतक संकोचन के लिए सही रिपोर्ट करने के लिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि 500 ​​सुक्ष्ममापी में कटौती वर्गों के लिए> 200 सुक्ष्ममापी के अंतिम मोटाई सबसे उच्च आवर्धन उद्देश्यों के काम दूरी से अधिक है, यह अभी भी अच्छी तरह से हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल 30X उद्देश्य के काम दूरी पर है। चूंकि डेन्ड्राइट और कांटा इन मुख्य गोल्जी-कॉक्स प्रोटोकॉल का उपयोग स्लाइस के तल के पास स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, यह करने के लिए और 1 मिमी रेंज सहित एक बहुत बड़ी मोटाई में कटौती वर्गों के भीतर निहित न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए संभव हो सकता है।

    हालांकि इस प्रोटोकॉल एकल खंड में लंबे वृक्ष के समान arbors का पता लगाने की क्षमता सहित लाभ के एक नंबर प्रदान करता है, विकल्प टुकड़ा करने की क्रिया और गर्भवती दिमाग के प्रसंस्करण, और cresyl बैंगनी साथ counterstaining बेहतर मस्तिष्क संरचना की पहचान करने का विकल्प देरी करने के लिए, वहाँ कुछ नुकसान कर रहे हैं कि चाहिएविचार किया जाए। 25 दिन की ऊष्मायन अवधि कुछ जांचकर्ताओं के लिए बहुत लंबा माना जा सकता है। छवि करने की क्षमता बढ़ वर्गों में गहरी एक लंबे समय तक काम दूरी है, जो अपेक्षाकृत महंगी है के साथ एक उच्च संकल्प विसर्जन उद्देश्य के लिए उपयोग पर निर्भर करता है। इसके अलावा, उच्च संकल्प के साथ ठीक संरचनाओं कल्पना करने की क्षमता बढ़ टुकड़ा के नीचे स्थित एक छवियों के रूप में कम हो जाती है। इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन इसलिए न्यूरॉन्स और मस्तिष्क क्षेत्र के रूपात्मक गुण पर निर्भर करता है का अध्ययन किया जाना, और उपकरणों अन्वेषक के लिए उपलब्ध। हम "परीक्षण" नमूने के उपयोग के इस तरह के मस्तिष्क और ब्याज की क्षेत्र के आकार के लिए गोल्जी-कॉक्स संसेचन समय के रूप में एक शोध अध्ययन, चलाने से पहले प्रोटोकॉल चर अनुकूलन करने के लिए, और विमान और करने के लिए वृक्ष के समान आर्बर के लिए सेक्शनिंग की मोटाई की सिफारिश देखे जा।

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    Disclosures

    लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

    Acknowledgments

    इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI परियोजना संख्या 30,381) से CDCB करने के लिए एक जॉन आर इवांस नेताओं फंड अनुसंधान बुनियादी ढांचे अनुदान, और द्वारा से CDCB करने के लिए एक डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया NSERC से NJM करने के लिए एक डिस्कवरी अनुदान। ELL एक ओंटारियो ग्रेजुएट छात्रवृत्ति द्वारा और Guelph विश्वविद्यालय में ओंटारियो पशु चिकित्सा कॉलेज से OVC छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया। सीडीएस NSERC से एक स्नातक छात्र अनुसंधान assistantship द्वारा समर्थित किया गया। एएलएम NSERC से एक एलेक्जेंडर ग्राहम बेल छात्रवृत्ति द्वारा और Guelph विश्वविद्यालय में ओंटारियो पशु चिकित्सा कॉलेज से OVC छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    potassium dichromate Fisher Scientific P188-100 Hazardous
    potassium chromate Fisher Scientific P220-100 Hazardous
    mercuric chloride Fisher Scientific S25423 Hazardous
    Whatman grade 1 filter paper Fisher Scientific 1001-185
    isoflurane Pharmaceutical Partners of Canada CP0406V2
    20 mL scintillation vial Fisher Scientific 03-337-4
    sucrose Bioshop Canada SUC700.1
    sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S5011-500G
    sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9390-500G
    50 mL conical tube Fisher Scientific 12-565-271
    isopentane Fisher Scientific AC126470010 Also known as 2-methylbutane; hazardous
    agar Sigma Aldrich A1296-100G
    small weigh dish Fisher Scientific 02-202-100
    vibratome Leica VT1000 S
    6-well tissue culture plates Fisher Scientific 08-772-1b
    mesh bottom tissue culture inserts Fisher Scientific 07-200-214
    paraformadelhyde (PFA), 16% Electron Microscope Sciences 15710-S Hazardous
    ammonium hydroxide Fisher Scientific A669S-500 Hazardous
    Kodak Fixative A Sigma Aldrich P7542
    superfrost plus slides Fisher Scientific 12-550-15
    CitroSolv clearing agent Fisher Scientific 22-143-975
    anhydrous ethyl alcohol Commercial Alcohols N/A
    cresyl violet Sigma Aldrich C1791
    permount Fisher Scientific SP15-100
    upright microscope Olympus BX53 model
    colour camera, 12 bit MBF Biosciences DV-47d QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
    3D motorized microscope stage, controller and enoders MBF Biosciences N/A Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
    4X microscope objective Olympus 4x 0.16 N.A. UplanSApo
    10X microscope objective Olympus 10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
    30X microscope objective Olympus 30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
    60X microscope objective Olympus 60x 1.42 N.A. PlanAPO N
    silicone immersion oil Olympus Z-81114
    Neurolucida software MBF Biosciences Version 10
    ImageJ software U. S. National Institutes of Health Current version With the OME Bio-Formats plugin installed
    Photoshop software Adobe version CS6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Louth, E. L., Sutton, C. D., Mendell, A. L., MacLusky, N. J., Bailey, C. D. C. Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (122), e55358, doi:10.3791/55358 (2017).

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