Summary
Vi presenterer en protokoll for anvendelse av Golgi-Cox fargingsmetode i tykke hjernesnitt, for å synlig nevroner med lange dendrittiske trær som inneholdes i enkelt vevsprøver. To varianter av denne protokollen er også presentert som involverer kresylfiolett motfarging, og frysing av ubehandlede hjerner for langtidslagring.
Abstract
Golgi-Cox metode for nevron farging har vært ansatt i mer enn to hundre år å fremme vår forståelse av neuron morfologi innen histologiske hjerneprøver. Mens det er foretrukket ut fra et praktisk perspektiv for å fremstille hjernesnitt ved den største tykkelsen mulig, for å øke sannsynligheten for å identifisere fargede neuroner som er fullt ut inneholdt i enkeltseksjoner, er begrenset fra et teknisk perspektiv av arbeidsavstanden av høy denne tilnærmingen -magnification mikroskop mål. Vi rapporterer her en protokoll for å farge neuroner ved hjelp av Golgi-Cox metode i musehjernesnitt som er kappet i 500 um tykkelse, og for å visualisere nevroner gjennom hele dybden av disse deler ved hjelp av en opprettstående mikroskop utstyrt med et høy-oppløsning 30X 1,05 NA silikon olje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Vi rapporterer også to nyttige varianter av denne protokoll som kan anvendes for å motfarge overflatenmontert hjernesnitt med cresylfiolett Nissl beis, eller for å fryse Hjernene i hel form for lengre tids lagring før seksjonering og endelig behandling. Hoved protokoll og de to variantene fremstille fargede tykke hjernesnitt, gjennom hvilken komp neuron dendrittiske trær og dendritt pigger kan bli pålitelig visualisert og kvantifisert.
Introduction
Visualiseringen av individuelle nevroner i vevsprøver tillater in-situ analyse av nevroner morfologiske egenskaper, som i betydelig grad har avansert vår forståelse av hjernen og hvordan den kan bli påvirket av endogene sykdom eller eksogene miljøfaktorer. Golgi-Cox fargingsmetode er en kostnadseffektiv, forholdsvis enkelt middel for farging av et tilfeldig utvalg av nevronene i hjernen. Først utviklet av Golgi 1 og modifisert av Cox 2 i 1800, har forskere videreutviklet denne teknikken i løpet av årene for å fremstille klare og fargede neuroner som kan brukes til å visualisere og kvantifisere begge dendrittisk tre morfologi og ryggrad tetthet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
En vesentlig teknisk betraktning for visualisering av fargede neuroner i hjernesnitt er den maksimale skivetykkelse, som er begrenset av arbeidsavstand på tilgjengelige høy forstørrelse / høyoppløselige mikroskop mål. Vanlige olje-neddykking målene i 60 - 100 X avstand gir god oppløsning, men er begrenset av deres arbeids avstander som er typisk ikke større enn 200 um. Hjerne deler som er skåret på 200 pm området kan være tilstrekkelig for å visualisere visse neuron typer som kan finnes i denne skivetykkelse, f.eks pyramidale neuroner i grunne lag av hjernebarken 10, 11, 12, pyramidale neuroner i CA1-regionen av hippocampus 13, 14 og granulceller i gyrus dentatus av hippocampus 15. Nerveceller med relativt lengredendrittiske trær, slik som pyramidale neuroner innenfor dype lag av hjernebarken som for mus kan strekke seg mer enn 800 um fra cellelegemet 16, gir en større utfordring fordi hjernen må være i snitt ved en perfekt vinkel for å inneholde hele dendritt treet mindre enn 200 um skiver. Dette kan ikke selv være gjennomførbart om en dendritt eller en hvilken som helst av dens grener strekker seg i den rostrale eller caudal retning. Selv om det er mulig å løse denne begrensningen ved å spore en neuron i flere tilstøtende hjernesnitt, innfører denne tilnærmingen en betydelig teknisk utfordring i å innrette delene nøyaktig for sporing 17. En mer praktisk tilnærming ville være å visualisere hele nerveceller som finnes i hjernesnitt som er skåret i en større tykkelse.
Vi rapporterer her en teknikk for å sette flekker neuroner i løpet av fra 400 - 500 um tykke hjernesnitt for mus ved hjelp av Golgi-Cox-metoden, og å visualisere deres morphology ved hjelp av et høyoppløselig silikonolje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Golgi-Cox impregnering og behandling protokoll som vi beskriver er modifisert fra en av de ovenfor siterte moderne protokoller i litteraturen 6. Vår tilnærming med tykke hjernesnitt gir den fordel av å øke sannsynligheten for å identifisere neuroner av enhver type som er fullt ut inneholdt i seksjonen. I tillegg til hovedprotokollen, vi også presentere to varianter som gir unike fordeler: (1) Golgi-Cox farging med cresylfiolett motfarge på overflaten av monterte seksjoner, for å definere grensene for hjerneregionene og for å identifisere lag av cerebral cortex, og (2) Golgi-Cox farging med et mellomliggende frysetrinn for langtidslagring av impregnerte hjernene før seksjonering og endelig behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne hunn CD1-stamme mus ble anvendt i denne studien. Lignende flekker kan oppnås ved hjelp av begge kjønn i ulike aldre. Forsøksdyr var ivaretatt i henhold til de prinsipper og retningslinjer for den kanadiske Council on Animal Care, og den eksperimentelle protokollen ble godkjent av University of Guelph Animal Care Committee.
1. Golgi-Cox Beising
- Golgi-Cox Impregnering av Brains
- Gjør Golgi-Cox oppløsning av 1% (w / v) kaliumdikromat, 0,8% (w / v) kaliumkromat og 1% (w / v) kvikksølvklorid ved oppløsning av kalium-dikromat og kalium-kromat i høy-kvalitet vann separat . Blande løsningene, tilsett kvikksølvklorid og filtrere den endelige løsning ved hjelp karakter 1 filterpapir. Oppbevar løsningen i mørket i opptil en måned.
- Bedøve mus ved hjelp av 5% isofluran.
- Avlive musen ved halshogging og raskt fjerne hjernen.
- Plasser hjernen i et 20 mL scintillasjonsglass inneholdende 17 ml av Golgi-Cox-løsning og inkuberes i mørke ved RT i 25 d.
- Cryoprotect hjernen ved å sette den inn i en 50 ml konisk rør inneholdende 40 ml av sukrose kryobeskyttelsesmiddel (30% (vekt / volum) sukrose i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4) i mørke ved 4 ° C i 24 timer.
MERK: Følgende tilleggs tre trinn kan benyttes som et alternativ til hovedprotokollen, for å fryse hjernen på dette trinn for langtidslagring. - Fryse hele hjernen ved å dyppe den i 200 ml isopentan som har blitt forhåndsavkjølt på tørris.
- Plasser den frosne hjernen til et 50 ml konisk rør og oppbevares i mørket ved -80 ° C.
- Når klar til å fortsette, tine hjernen ved å sette den inn i en 50 ml konisk rør inneholdende 40 ml av sukrose kryobeskyttelsesmiddel i mørke ved 4 ° C i 24 timer.
- Brain Seksjonering
- Fjern hjernen fra sukrose og blokkenk det til snitting ved å kutte av lillehjernen ved hjelp av et barberblad og etterlater en flat kant på den gjenværende caudale enden av hjernen.
- Varme-agar (3% (vekt / volum) i vann) inntil den er smeltet og fikk avkjøles til den er litt over dens smeltepunkt.
- Plasser hjerne i en liten engangs veie tallerken med sin haleendeflate-ned og tilsettes en tilstrekkelig mengde av smeltet agar for å dekke hjernen.
- Når agaren er stivnet, trim overskytende agar forlater omtrent 2 - 4 mm som omgir hjernen og lim hjernen til det stadiet av en vibratome med sin haleendeflate-ned ved hjelp av en liten mengde av etyl-cyanoakrylat-lim.
- Fyll sceneområdet av vibratome med en tilstrekkelig mengde av sukrose kryobeskyttelsesmiddel å dekke hjernen, og seksjon hjernen på en skive tykkelse på fra 400 - 500 mm (avhengig av hjerneregionen som skal undersøkes) ved hjelp av en vibrasjonsfrekvens på 86 Hz og et blad fremme hastighet på 0,125 mm / s.
- Ved hjelp av en liten pensel, Sted hjerneseksjoner i en brønn på en 6-brønners vevkulturplate inneholdende kommersielt tilgjengelige mesh-bunninnsatser og pre-fylt med 10 ml 6% (vekt / volum) sukrose i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4.
- Inkuber seksjoner i mørke ved 4 ° CO / N.
- Utviklingen av hjernen Seksjoner
- Ved å bruke maske-bunninnsatser, overføre hjernesnitt inn i en ny brønn inneholdende 5 ml av 2% (vekt / volum) paraformaldehyd (PBD) i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4. Inkuber på en vippe som beveger seg med lav hastighet i mørke ved RT i 15 min.
- Vask seksjoner to ganger ved å overføre dem til nye brønner inneholdende 5 ml vann. Vask på en vippe beveger seg med en moderat hastighet i mørke ved RT i 5 min.
- Overføringsseksjonen og inn i en ny brønn inneholdende 5 ml av 2,7% (v / v) ammoniumhydroxyd. Inkuber på en vippe beveger seg med en lav hastighet i mørke ved RT i 15 min.
- Vask seksjoner to ganger ved å overføre dem til nye brønner inneholdende 5 ml vann. Vask ona vippe beveger seg med en moderat hastighet i mørke ved RT i 5 min.
- Overføringsseksjonen og inn i en ny brønn inneholdende 5 ml fiksativ A (se Materialer tabell) som har blitt fortynnet i vann 10x fra sin opprinnelige innkjøpt konsentrasjon. Inkuber på en vippe beveger seg med en lav hastighet i mørke ved RT i 25 min.
- Vask seksjoner to ganger ved å overføre dem til nye brønner inneholdende 5 ml vann. Vask på en vippe beveger seg med en moderat hastighet i mørke ved RT i 5 min.
- Montering Brain Seksjoner
- Bruk en liten pensel, montere deler bort på objektglass. Fjerne overflødig vann og agar ved bruk av pinsetter og en liten vev. Sørg for at all agar fjernes før du fortsetter med dehydrering.
- Tillat deler til lufttørke ved romtemperatur i omtrent 45 min (400 jim snitt) eller 90 min (500 jim snitt).
MERK: timing og passende tørrhetsgraden er kritisk, og kan måtte bestemmes i hvertlaboratorium, avhengig av omgivelsestemperatur og luftfuktighet. For kort tørketid fører til seksjoner som faller av fra objektglass under påfølgende dehydrering trinn, og en for lang tørketid fører til seksjoner cracking. Avsnittene vil fortsatt synes å være skinnende på riktig nivå av tørrhet. - Flekk-seksjoner med kresylfiolett ved å plassere glir inn Coplin Fargetrau som angitt.
MERK: Denne valgfrie trinnet kan benyttes for deler som aldri hadde vært frosset, for å farge nevrale kjerner med kresylfiolett. Vi har funnet ut at avregning og rehydrating seksjoner før inkubasjon i cresylfiolett fører til enda flekker og lav bakgrunns over seksjoner.- Sett i clearing agent for 5 min. Gjenta en gang.
- Plasser i 100% etanol i 5 min. Gjenta en gang.
- Plasser i 95% etanol i vann, deretter 75% etanol i vann, og deretter 50% etanol i vann i 2 minutter hver.
- Sett i vann i 5 min.
- Plasser i 0,5% (w / v) cresyl fiolett i vann i 7 min.
- Plasser i vann i 2 min. Gjenta en gang.
- Dehydrere seksjoner ved å plassere glir inn Coplin Fargetrau som angitt.
- Plasser i 50% etanol i vann, deretter 75% etanol i vann, og deretter 95% etanol i vann i 2 minutter hver.
- Plasser i 100% etanol i 5 min. Gjenta en gang.
- Sett i clearing agent for 5 min. Gjenta en gang.
Merk: Disse dehydrering og behandlingstiden er tilstrekkelig til å behandle musehjerner som beskrevet i dette manuskriptet. Vi har imidlertid observert for andre arter, inkludert rotte og Cowbird, at den avsluttende avregning trinnet kan ha behov for å bli forlenget opp til 15 minutter totalt.
- Dekkseksjoner ved hjelp av et vannfritt monteringsmedium.
- Tillat lysbilder tørke horisontalt i mørket ved romtemperatur i minst 5 d.
2. Imaging Stained Nerveceller innen Tykke hjernesnitt
- Fange bildestakker
- Slå på mikroskopet lyspære, kamera, og scenen kontrolleren.
- Åpne mikroskop programvare (f.eks Neurolucida).
- Plasser et lysbilde på mikroskopet scenen.
- Fang et 2D bred-syn bilde av hjernen delen ved å bruke en lav forstørrelse objektiv som 1,25X 0,4 NA PlanAPO eller 4X 0,16 NA
- Fokuser bildet og justere kamerainnstillingene inkludert eksponeringstiden og hvitbalanse.
- Opprett et referansepunkt ved å venstreklikke hvor som helst på seksjonen
- Fange bildet ved å velge "kjøpe enkeltbilde" i bildet oppkjøpet vinduet.
- Capture mid-oppløsning stabler av området som inneholder nevroner (r) av interesse, ved hjelp av en 10X 0,3 NA UPlan FL N objektiv.
- Fokuser bildet og justere kamerainnstillingene, inkludert eksponering og hvitbalanse.
- Still inn øvre og nedre grenser for bildestakk ved å fokusere på toppen av seksjonen ennd velge "satt" ved siden av "toppen av stabelen" innenfor ervervet bildevindu, og deretter fokusering til bunnen av seksjonen og velge "satt" ved siden av "bunnen av stabelen" i bilde-innhentingsvinduet.
- Still trinn avstand til 5 um ved å taste "5 um" ved siden av "avstanden mellom bilder" i bilde-innhentingsvinduet.
- Fange bildet stabelen ved å velge "erverve bildestabelen" i bilde-innhentingsvinduet.
- Gjenta trinnene ovenfor for å fange opp hele området av interesse, å sørge for at alle bildestakker overlappe hverandre med minst 10% i X- og Y-aksene.
- Fange høyoppløste bilde stabler av det området som inneholder neuron av interesse, ved hjelp av en 30X 1.05 NA silikonolje-neddykking objektiv.
- Legg 3 - 4 dråper av silikonolje nedsenking til sleiden og plasser objektiv over glidestykket, og sikrer til å gjøre kontakt mellom målet og oil.
- Fokuser bildet og justere kamerainnstillingene, inkludert eksponering og hvitbalanse.
- Still inn øvre og nedre grenser for bildestakk ved å fokusere på toppen av seksjonen og velge "satt" ved siden av "top of stack" i bildet oppkjøpet vinduet, og deretter fokusere på bunnen av seksjonen og velge "set" ved "bunnen av stabelen" i bilde-innhentingsvinduet.
- Still trinn avstand til omkring 1 pm ved å taste "1 pm" ved siden av "avstanden mellom bilder" i bilde-innhentingsvinduet.
- Fange bildet stabelen ved å velge "erverve bildestabelen" i bilde-innhentingsvinduet.
- Gjenta trinnene ovenfor for å fange opp hele området av interesse, å sørge for at alle bildestakker overlappe hverandre med minst 10% i X- og Y-aksene.
- Lagre datafilen og lagre alle bildefiler i TIFF-format for ekstern behandling.
- Lag Z-projeksjon bilder i ImageJ
- Åpne ImageJ programvare som har bio-formater plugin installert.
- Velg "Plugins" -> "Bio-formater" -> "Bio-formater Importer".
- Velg bildet stabelen filen som skal åpnes.
- Når filen er åpnet, endre formatet til RGB ved å velge "Image" -> "Type" -> "RGB Color".
- Lag Z-projeksjon ved å velge "Image" -> "Stacks" -> "Z Prosjekt ...".
- Lagre todimensjonal Z-projeksjon bildet som en TIFF-fil.
- Lag et todimensjonalt bilde montasje av hele området av interesse.
- Åpne programvaren (for eksempel Adobe Photoshop).
- Velg "File" -> "Automat" -> "Photomerge".
- Velg "Bla gjennom" og deretter legge alle images-filer som skal flettes.
- Pass på at "Blend Images Together" er valgt, og velg deretter "OK".
- Lagre den resulterende montasje bilde av hele området av interesse som en TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette Golgi-Cox farging protokoll og de to beskrevne valgfrie varianter kan anvendes for å visualisere individuelle neuroner i løpet av 400 - 500 um tykke hjernesnitt. Representative bilde montasjer av to-dimensjonale Z-fremspring tatt ved hjelp av et 10X objektiv og 5 um trinn i Z-aksen er vist i figur 1: A1 - C1 for et stort område av koronale hjernesnitt som innbefatter fremre cingulate cortex område 1 og den sekundær motor cortex 18. Snitt ble kuttet på 500 pm. Legg merke til at protokollen variant som inkluderer kresylfiolett farging muliggjør identifikasjon av cortical cellelag, for eksempel som vist for kortikale lag 1 langs pial overflaten av seksjonene i figur 1B1. Legg også merke til likheten mellom farvede snitt ved bruk av hoved protokoll som bruker en frisk vev (figur 1A1) og den protokoll variant derhjerner er frosset frem gjennom for langtidslagring (figur 1C1).
Bruken av en høy-oppløsning 30X 1,05 NA silikonolje-neddykking objektiv gir mulighet for fangst av bildestakker som er større i X- og Y-aksene enn de som er fanget ved hjelp av en høyere forstørrelse objektiv, slik at det kreves færre totale stabler for å avbilde et gitt interesseområde. Det spesielle formålet som anvendes har en 800 um arbeidsavstanden, noe som er mer enn tilstrekkelig til å bilde tykke hjernesnitt. Bilde montasjer av to-dimensjonale Z-anslag er fanget ved hjelp av dette objektiv og 1 mikrometer trinn i Z-aksen er vist i figur 1 (A2-C2) i den fremre cingulate cortex område 1, og to-dimensjonale Z-projeksjoner av tracings for angitte neuroner er vist i figur 1: A3 - C3. Merk bildene med høy oppløsning som gir mulighet for visualisering av nevroner og deres dendritter gjennomDybden til hvert bilde stabel. Protokollen variant ved hjelp av kresylfiolett legger purpur Nissl-farging på tvers av skive, men med parameterne som anvendes denne cellulære farging bare observert nær toppen av stykket. Protokollen variant som innbefatter den valgfrie frysetrinnet produserer neuron farging som er lik hovedprotokollen, men det introduserer også en diffus bakgrunnsfarging som skaper utseende av dis ved diffraksjon lys under overflaten av snittet. Dette dis er mest fremtredende når avbildning dypere inn i stykket, og er tydelige i Z-projeksjonsbildet i figur 1C2. Av bilder tatt med 30X objektiv kan også benyttes til å visualisere og kvantifisere fin neuronal strukturer som dendrittutløperne. Single-planbilder er vist i figur 2 for dendritter farget ved hjelp av hovedprotokollen og dens to varianter, med ett bilde tatt nær toppen av seksjonen og ett bilde tatt nær bunnen av seksjonen. Legg merke til lille kresylfiolett farging av Nissl-substans i de enkelte nevronale kjerner nær toppen av snittet i figur 2B1, som er sett på som diffus fiolett bakgrunn / spredt lys i nærheten av bunnen av seksjonen i figur 2B2. Legg også merke til at selv om dendritter og deres pigger er godt farget ved anvendelse av protokollen med frysetrinnet den tidligere nevnte bakgrunn dis som er tydelig nær bunnen av skiven i figur 2C2 gjør det mer vanskelig å visualisere pigger ved å begrense kontrasten mellom dem og den tilstøtende bakgrunn. Høyere forstørrelse mål kan også brukes til å karakter dendrittiske ryggrad morfologi, som vist i figur 2: A3 - C3 hvor pigger med forskjellige typer er godt synlig i seksjonene farget ved hjelp av hver av de tre protokoller. Her ble en 60X 1,42 NA olje-objektiv nedsenking anvendt. Vi har også anvendt denne farging protokollen og dens varianter å farge neuroner innenfor hippocAmpus av seksjoner kuttet på 400 pm. Som vist i figur 3, kan neuron dendritter og pigger bli visualisert både mot de mer-mediale deler av seksjonen (f.eks hippocampus dentate gyrus region i figur 3: A2 - C2) og den mer-sideområder i seksjonen (f.eks , hippocampus CA3 region i figur 3: A3 - C3). Det skal også bemerkes at hver farging betingelse ga tilsvarende resultater, fordeler og ulemper som de som er vist i figurene 1 og 2 for den cerebrale cortex.
Den endelige tykkelse av bearbeidede hjernesnitt avhenger av den aktuelle protokoll varianten anvendes. Som vist i figur 4A for deler som består av den cerebrale cortex og kuttet på 500 um, var der en signifikant effekt av protokollen variant på den målte tykkelse av behandlet og montert / coverslipped seksjoner (en-veis ANOVA, p <0,0001). Her er tykkelsen av seksjonene gjort ved hjelp av selve hoved (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)), og fremgangs variant involverer kresylfiolett (219,3 ± 8,5 mm (n = 6)) var mindre enn tykkelsen av seksjonene gjort anvendelse av protokollen variant som omfatter frysing trinn (340,6 ± 17,1 mm (n = 6)) (Bonferroni post-hoc-test, idet hver sammenligning p ≤ 0,0006). Meget lignende virkninger av fremgangsmåte-variant ble observert for deler som består av hippocampus og kuttet ved 400 nm (figur 4B, en-veis ANOVA, p <0,0001). Her er tykkelsen av seksjonene gjort ved hjelp av selve hoved (217,6 ± 19,2 mm (n = 6)), og fremgangs variant involverer kresylfiolett (198,0 ± 14,8 mm (n = 6)) var mindre enn tykkelsen av seksjonene blir utført ved hjelp protokollen variant som omfatter frysing trinn (313,5 ± 8,4 mm (n = 6)) (Bonferroni post-hoc-test, idet hver sammenligning p ≤ 0,001).
Figur 1. Eksempler Mikrofotografier av flekket nerveceller i den fremre cingulate område 1. A1 - C1, blir slått sammen Z-projeksjoner av bildestakker ervervet ved hjelp av et 10X objektiv vist for en halvkule av den cerebrale cortex som omfatter den fremre cingulate cortex område 1 og sekundær motor cortex ved ca. Bregma 1,18 mm 18. Disse snitt ble kuttet på 500 pm. Mikrofotografier er vist ved hjelp av de viktigste all-frisk-protokoll (A1) for den friske protokoll varianten med cresylfiolett farging (B1) og for protokollen variant hvor hjernene fryses følgende Golgi-Cox impregnering (C1). Skala barer er 500 pm. Høyere oppløsning fusjonerte Z-projeksjons bildestakker ervervet ved å bruke en silikonolje 30X objektiv-neddykking er vist i A2 - C2 for hvert område fremgår av den røde square i mikrofotografiene i A1 - C1. Skala barer er 100 um. 2D-Z-projeksjoner av neuron-kurvene er vist i A3 - C3 til neuronene indikert med rød pil i mikrofotografiene i A2 - C2. Diameteren til alle dendritter ble satt til 2 um for å lette illustrasjonen. Skala barer er 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempler Mikrofotografier av dendrittutløperne Farget neuroner. Mikrofotografier tatt ved hjelp av en 30X silikonolje-neddykking objektiv disse er vist i fokalplanet for neuron-dendritter ligger innenfor laget 1 av den fremre cingulate cortex område 1. Disse snitt ble kuttet på 500 pm. Nevronene ble farget med f resh protokoll (A1, A2), protokollen varianten med cresylfiolett farging (B1, B2) og for protokollen variant hvor hjernene fryses følgende Golgi-Cox impregnering (C1, C2). Mikrofotografier ble tatt nær toppen av stykket (A1 - C1) og nær bunnen av skiven ved siden av objektglass (A2 - C2). Skala barer for A1-2, b1-2 og C1-2 er 50 um. Mikrofotografier er vist i A3, B3 og C3 for en fokusplan ved hjelp av en høyere forstørrelse 60x olje-objektiv nedsenking, for å identifisere forskjellige typer ryggraden. Skala barer for A3, B3 og C3 er 10 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
55358 / 55358fig3.jpg"/>
Figur 3. Eksempler Mikrofotografier av flekket nevroner i hippocampus. Mikrofotografier tatt ved hjelp av en 4x objektiv disse er vist i fokalplanet for nevroner farges ved hjelp av den friske protokoll (A1), protokollen varianten med cresylfiolett farging (B1) og for protokollen variant hvor hjernene fryses følgende Golgi-Cox impregnering (C1- ). Snitt ble kuttet på 400 pm og er vist på ca. Bregma -2,18 mm 18. Skala barer er 500 pm for A1 - C1. Høyere forstørrelse mikrofotografier ble tatt med en 30X silikonolje-neddykking objektiv og disse er vist i fokalplanet for neuron dendritter ligger innenfor dentate gyrus regionen av hippocampus (A2 - C2) og den CA3-regionen av hippocampus (A3 - C3). Skala linjene er 50 um for A2 - C2og A3 - C3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tykkelsen av monterte seksjoner. Den målte tykkelse av monterte seksjoner er vist i A for deler som består av hjernebarken ved ca. Bregma 1,18 mm 18 og skåret på 500 um tykkelse, og i B for deler som består av hippocampus ved ca. Bregma -2,18 mm 18 og kuttet ved 400 um tykkelse. Målte seksjonene ble farget ved å bruke enten ferskt protokollen, protokollen varianten med cresylfiolett flekker, eller protokoll variant hvor hjernene fryses følgende Golgi-Cox impregnering. For begge hjerneregioner, var det en signifikant effekt av behandling protokollen(Enveis ANOVA, p <0,0001), hvor seksjoner fra hjernen som var frosset frem gjennom protokollen var signifikant tykkere enn de som ikke var frosset (Bonferroni post-hoc test, alle p <0,001). Dataene er vist som gjennomsnitt ± SEM for seks seksjoner i hver gruppe, og datasett med forskjellige bokstaver indikerer signifikante forskjeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en Golgi-Cox farging protokoll sammen med to nyttige varianter for visualisering av neuroner i løpet av tykke hjernesnitt. Som vist i de representative resultater, gav bruken av en høy-oppløsning objektiv som har en lang 800 um arbeidsavstand gjør det mulig å pålitelig visualisering av hele neuroner i hele dybden av hjerne deler som er skåret på 500 pm. Denne studien av forholdsvis tykke hjernesnitt øker sannsynligheten for at farget neuroner fra en hvilken som helst type er fullt ut inneholdt i den skive, som er spesielt viktig for pyramidale neuroner med lange og kompliserte apikale dendritt-trær. For eksempel, i koronale seksjoner av gnagerhjerne, gjør dette for å inkludere neuroner som strekker seg lengre i den rostrale eller caudal retning, og øker også rom for feil når blokkering av hjernen holdent ved snitting trinn. Selv om vi beskrive hjerne snitting i coronalplan eneste, kan denne protokollen kan tilpasses for snitting i andre planes som kreves for å full inneholder merkede nevroner i enkeltseksjoner. Flyet av seksjonering ansatt vil avhenge av de morfologiske egenskapene til nervecellen befolkningen under etterforskning. Dendrittutløperne kan bli visualisert og kvantifisert ved anvendelse av denne protokollen, selv om høyere forstørrelse målene er nødvendig for å vurdere ryggrad type / morfologi såsom 60X olje-neddykking objektiv som brukes til å fremstille mikrofotografiene i figur 2: A3 - C3. Dette kan anvendes i tykke seksjoner, men er begrenset til toppen av stykket innen arbeidsavstanden til målet. Denne protokollen kan også tilpasses for bruk i forskjellige arter av lignende hjerne størrelse, da det er funnet at en standard 25-dagers impregneringsperioden vil fullt ut sette flekker neuroner i løpet av mus, rotte og Cowbird hjerne uten å føre til overskudd av ikke-spesifikk farging eller bakgrunn som kan forekomme med impregneringsperioder utover en måned. Kortere impregneringsperioder kan være tilstrekkelig for arter med sMøller hjerner eller i dissekerte prøver av hjerner fra de ovenfor nevnte art, som kan optimaliseres ved den enkelte søkeren.
Av de tre varianter som er presentert for denne farging protokollen, hovedprotokollen ved bruk av friske hjerneprøver som ikke er motfarget gir de beste resultatene. Mikrofotografier i Figur 2 A viser at denne hoved protokollen produserer brønn-merkede dendritter og pigger som er lett synlig nær toppen og bunnen av monterte tykke seksjoner. Ved å legge til kresylfiolett motfarge har fordelen av å lette definisjonen av hjerneregioner og Hjernebark-lag, men også lagt en diffus fiolett bakgrunn når visualiserer dypt inn i tykke seksjoner. Imidlertid, siden denne protokollen variant bare flekker på overflaten av monterte tykke seksjoner med cresylfiolett, dendritter og deres organer var klart synlig nær bunnen av seksjoner (figur 2 B). Dette synes også å Produce en klarere mønster av Nissl flekker nær overflaten av tykkere tverrsnitt enn det som er vist i tidligere rapporter, selv ved bruk av mye tynnere partier 19, 20, 21. Protokollen variant som inkluderer frysing trinn gir akseptable resultater for analyse av dendrittiske tre morfologi. Imidlertid er det bakgrunnsfarging mye mørkere enn i friske vev, som er mest merkbart når avbildning dypere inn i skiven noe som gjør det mer vanskelig å visualisere og kvantifisere dendritt pigger (figur 2C). Vi forsøkte den cresylfiolett motfarge i seksjoner fra hjerner som hadde vært frosset, og dette produserte en enda-mørkere lilla bakgrunn dis som gjorde det ekstremt vanskelig å visualisere og kvantifisere pigger nær bunnen av seksjonen (data ikke vist). En annen mislykket protokoll variant som ble undersøkt inkluderte iskaldt musehjerner før Golgi-Cox impregnasjon. Dette resulterte i farging av cellulære gjenstander som kan ha vært glia, men ble ikke farget noen form for neuron (data ikke vist).
Det er to viktige skritt i denne protokoll som må følges for å oppnå gode resultater. (1) Det er viktig å kontrollere tørketiden av seksjoner i hver laboratorium, fordi dette er sterkt avhengig av temperatur og fuktighet. Hvis tørketiden er for kort, vil deler falle av skinnene i løpet av dehydrering prosessen; hvis tørketiden er for lang, vil deler sprekke. Det ville være fordelaktig å kontrollere tørketiden i et sett av "test" hjerner like før preforming en studie, da dette kan variere fra sesong til og med det samme laboratorium. (2) Alle overskytende agar må fjernes fra seksjonen og objektglass før dehydratiseringen trinnene. Dersom dette ikke er gjort, vil den deformeres agar og kan trekke delen ut av sleiden.
En annen viktig faktor for histologiskal analyse av biologiske prøver er vev krymping. Vi har funnet at etter behandling, montering, dehydrering og coversliphjernesnitt ved hjelp av hoved Golgi-Cox protokoll som den siste delen tykkelsen ble redusert til omtrent halvparten av den opprinnelige kuttet verdi (figur 4). Legg også merke til at delene er behandlet ved anvendelse av protokollen varianten som er inkludert i frysetrinnet var signifikant tykkere enn de friske deler som ble behandlet med hovedprotokollen (figur 4). Dette var både interessant og uventet fordi begge protokollene involvert de samme kryobeskyttelse og behandlingstrinn, og bare skilte seg ved selve frysing av hjerner. Det er derfor viktig å ta hensyn til mulige forskjeller i protokoller når man sammenligner neuron morfologi data generert ved hjelp av Golgi-Cox flekker fra forskjellige undersøkelser eller fra forskjellige laboratorier. Selv om vi ikke var i stand til å finne data for siste delen tykkelse i litteraturen, ville det være gunstigfor forskere å rapportere denne informasjon og / eller korrigere for vev krymping ved rapportering av målinger av neuron morfologi. Det bør også bemerkes at selv om den endelige tykkelse på> 200 pm for deler som er skåret på 500 um, er større enn arbeidsavstanden til de fleste høy-forstørring, er dette likevel godt innenfor arbeidsdistanse av 30X objektiv anvendt i vårt laboratorium. Siden dendritter og pigger er klart synlig nær bunnen av disse skiver ved hjelp av hoved Golgi-Cox-protokollen, kan det være mulig å visualisere neuroner inneholdt i deler som er skåret på et mye større tykkelse opp til og inkludert 1 mm området.
Selv om denne protokollen byr på en rekke fordeler, inkludert evnen til å spore lange dendrittiske arbors i enkeltseksjoner, vil muligheten for å forsinke kutting og behandling av impregnerte hjerner, og muligheten til å kontra med cresylfiolett for å bedre identifisere strukturer i hjernen, er det noen ulemper som børbli vurdert. Den 25-dagers inkubasjonstid kan vurderes for lang for noen etterforskere. Evnen til å avbilde dypt inn monterte seksjoner er avhengig av tilgang til en nedsenking objektiv med høy oppløsning med en lang arbeidsavstand, som er forholdsvis kostbart. I tilegg vil evnen til å visualisere en fin struktur med høy oppløsning avtar når ett bilde i nærheten av bunnen av den monterte skive. Gjennomføringen av denne fremgangsmåte avhenger derfor av de morfologiske egenskaper til de neuroner og hjerneområde som skal undersøkes, og det utstyr som er tilgjengelig for undersøkeren. Vi anbefaler bruk av "test" prøver å optimalisere protokoll variabler før innkjøring en studie, slik som Golgi-Cox tid etter impregneringen for størrelsen av hjernen og regionen av interesse, og det plan og tykkelsen av seksjonering for det dendrittiske Arbor bli visualisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Discovery Grant til CDCB fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC), en John R. Evans Leaders Fund forskningsinfrastruktur tilskudd til CDCB fra Canada Foundation for innovasjon (CFI prosjektnummer 30381), og ved å en Discovery Grant til NJM fra NSERC. ELL ble støttet av en Ontario Graduate Scholarship og ved en OVC stipend fra Ontario Veterinary College ved University of Guelph. CDS ble støttet av en Undergraduate Student Forskning assistant fra NSERC. ALM ble støttet av en Alexander Graham Bell Stipend fra NSERC og ved en OVC stipend fra Ontario Veterinary College ved University of Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
