Summary
Мы представляем протокол с использованием метода окрашивания Гольджи-Кокса в толстых участках мозга, для того, чтобы визуализировать нейроны с длинными дендритных деревьев, содержащихся в пробах отдельных тканей. Также представлены два варианта этого протокола, которые включают Cresyl фиолетовые контрастные и замораживание необработанных мозгов для длительного хранения.
Abstract
Метод Гольджи-Кокса нейронного окрашивания был использован в течение более чем двух сотен лет, чтобы продвинуть наше понимание морфологии нейронов в пределах гистологических образцов мозга. Несмотря на то, что является предпочтительным с практической точки зрения, чтобы подготовить участки мозга при наибольшей толщине возможно, для того, чтобы увеличить вероятность выявления окрашенных нейронов, которые полностью содержащихся в отдельных разделах, этот подход ограничен с технической точки зрения по рабочей дистанции высоких -magnification микроскопа цели. Мы сообщаем здесь протокол к окрашиванию нейронов с помощью метода Гольджи-Кокса в срезах мозга мышей, которые вырезаны при толщине 500 мкм, а для визуализации нейронов по всей глубине этих секций с использованием вертикального микроскопа, установленного с высокой разрешающей способностью 30X силикона 1,05 Н.А. цель масла погружения, который имеет рабочее расстояние 800 мкм. Мы также сообщаем два полезных варианта этого протокола, которые могут быть использованы для контрастной поверхностиустановлены срезы головного мозга с крезили Вайолет Ниссл пятно, или заморозить целые мозги для длительного хранения до секционирования и окончательной обработки. Основной протокол и его два варианты получение окрашенных толстых срезов головного мозга, в течение которого полные нейрон дендритных дерева и дендритные шипы могут быть надежно визуализироваться и количественно.
Introduction
Визуализация отдельных нейронов в образцах тканей позволяет на месте анализа нейронных морфологических характеристик, которые значительно продвинули наше понимание мозга и как это может быть под влиянием эндогенных заболеваний или экзогенных факторов окружающей среды. Метод окрашивания Гольджи-Кокса является экономически эффективными, относительно простых способами окрашивания случайной выборки нейронов в головном мозге. Во- первых , разработанный Гольджи 1 и модифицированной Коксом 2 в 1800 - х годах, исследователи доработан эту технику на протяжении многих лет , чтобы произвести четкие, хорошо окрашенные нейроны , которые могут быть использованы для визуализации и количественного определения как дендритной морфологии дерева и плотность позвоночника 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
Основным техническим фактором для визуализации нейронов, окрашенных в срезах мозга максимальная толщина среза, которая ограничена рабочим расстоянием, имеющихся в наличии высокого увеличения / микрообъективов с высокой разрешающей способностью. Общие цели масло погружения в 60 - 100X диапазон обеспечивают превосходное разрешение, но ограничены их рабочими расстояниями, которые не являются, как правило, не более 200 мкм. Срезы мозга разрезать на мкм диапазона 200 могут быть достаточными , чтобы визуализировать определенные типы нейронов , которые могут содержаться в пределах этой толщины среза, например пирамидальных нейроны в неглубоких слоях коры головного мозга 10, 11, 12, пирамидальных нейронов в области СА1 из гиппокампа 13, 14 и зернистых клеток в зубчатой извилине гиппокампа 15. Нейроны с относительно болеедендритные дерева, такие как пирамидальные нейроны в пределах глубоких слоев коры головного мозга , что для мыши может продлить более 800 мкм от тела 16 клеток, обеспечивает большую проблему , потому что мозг должен были бы быть разрезали на идеальный угле , чтобы содержать все дендриты дерева в пределах 200 мкм ломтиков. Это может даже не быть возможным, если дендрит или любой из его ветвей проходят в ростральной или каудальном направлении. В то время как можно решить это ограничение путем отслеживания нейрона на нескольких соседних участках мозга, этот подход представляет существенную техническую проблему в точном выравнивании разделов для отслеживания 17. Более практичным подходом было бы визуализировать целые нейроны, содержащиеся в срезах головного мозга, которые разрезаются на большей толщины.
Мы сообщаем здесь технику, чтобы окрасить нейроны в пределах 400 - 500 мкм срезах мозга мышей с помощью метода Гольджи-Кокса, и визуализировать их моrphology использование кремния цели масла погружения с высоким разрешением, который имеет рабочее расстояние 800 мкм. Пропитки и обработки протокола Гольджи-Кокса , который мы описываем модифицирован из одной из самых цитируемых современных протоколов в литературе 6. Наш подход с толстыми срезами мозга обеспечивает преимущество увеличения вероятности идентификации нейронов любого типа, которые полностью входит в секции. В дополнении к основному протоколу, мы также присутствует два варианта, которые обеспечивают уникальные преимущества: (1) Гольджи-Кокса окрашивание с крезили фиолетовые контрастирующие на поверхности смонтированных участков, с тем чтобы определить границы областей головного мозга и определить слои кора головного мозга, и (2) Гольджи-Кокса окрашивание с промежуточной стадии замораживания для длительного хранения пропитанных весь мозг перед секционирования и окончательная обработка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые самки мышей CD1-деформированного были использованы в данном исследовании. Подобное окрашивание может быть выполнено с использованием обоих полов в различных возрастах. Экспериментальные животные заботятся в соответствии с принципами и руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными, а также экспериментальный протокол был утвержден в Университете гвельфов животных комитета по уходу.
1. Гольджи-Кокс Окрашивание
- Гольджи-Кокса Пропитка Мозги
- Сделать раствор Гольджи-Кокса 1% (вес / объем) дихромат калия, 0,8% (вес / объем) хромат калия и 1% (вес / объем) хлорид ртути путем растворения дихромата калия и хромат калия в высококачественной воду отдельно , Смешайте растворы, добавьте хлорид ртути и фильтруют конечный раствор с использованием класса 1 фильтровальной бумаги. Храните раствор в темноте на срок до одного месяца.
- Обезболить мышь, используя 5% изофлуран.
- Эвтаназии мыши обезглавливания и быстро удалить мозг.
- Поместите мозг в сцинтилл ционный флакон на 20 мл, содержащую стеклянную 17 мл раствора Гольджи-Кокса и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 25 д.
- Cryoprotect мозг, помещая его в коническую пробирку 50 мл, содержащую 40 мл сахарозы криопротектора (30% (вес / объем) сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4) в темноте при температуре 4 ° С в течение 24 ч.
Примечание: Следующий необязательные три шага может быть использован в качестве альтернативы основному протокол, для того, чтобы заморозить мозг на этой стадии для длительного хранения. - Замораживание всего мозга, погрузив его в 200 мл изопентана, который был предварительно охлажденных на сухом льде.
- Поместите замороженный мозг в 50 мл коническую пробирку и хранить в темноте при -80 ° C.
- Когда готов приступить, растопить мозг, помещая его в коническую пробирку 50 мл, содержащую 40 мл криопротектора сахарозы в темноте при 4 ° С в течение 24 ч.
- Мозг Секционирование
- Удалить мозг из сахарозы и блокаK его для секционирования, отрезав мозжечок с помощью лезвия бритвы и оставляя плоский край на оставшийся хвостовой конце головного мозга.
- Тепло агар (3% (вес / объем) в воде) до тех пор, пока не будет расплавлен и дать остыть до тех пор, пока немного выше его точки плавления.
- Поместите мозг в небольшом одноразовом взвешивании блюда с его хвостовым концом лицевой стороной вниз и добавить достаточное количество растопленного агара, чтобы покрыть мозг.
- После того, как агар затвердеет, обрезать лишний агар оставляя приблизительно 2 - 4 мм, окружающей мозг и клей мозга стадии вибратомы с его хвостовым концом лицевыми стороной вниз, используя небольшое количество Этилцианакрилата клея.
- Заполните область стадии вибратомы с достаточным количеством криопротектора сахарозы, чтобы покрыть мозг, и раздел головного мозга при толщине среза 400 - 500 мкм (в зависимости от области мозга, которые будут рассмотрено), используя частоту колебаний 86 Гц и скорость лезвия продвижение 0,125 мм / с.
- Используя маленькую кисть, Участки головного мозга места в лунку 6-луночный планшет для культуры ткани, содержащего коммерчески доступную сетчатое дном вставки и предварительно заполнено 10 мл 6% (вес / объем) сахарозы в 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4.
- Инкубируйте разделы в темноте при 4 ° CO / N.
- Развитие Срезы мозга
- Использование сетки снизу вставки, передавать срезы головного мозга в новую лунке, содержащих 5 мл 2% (вес / объем) параформальдегида (PBD) в 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4. Инкубирует на качалке, двигающейся на медленной скорости в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промыть секции дважды путем переноса их в новые лунки, содержащие 5 мл воды. Промыть на качалке, двигающейся с умеренной скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Передача участков в новую лунку, содержащую 5 мл 2,7% (объем / объем) гидроксида аммония. Инкубирует на качалке, двигающейся с малой скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Промыть секции дважды путем переноса их в новые лунки, содержащие 5 мл воды. Мытье одвигаться с умеренной скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин на коромысла.
- Передача участков в новую лунку , содержащую 5 мл Fixative А (см Материалы таблицу) , который был разбавлен водой в 10 раз от своего первоначального приобретенной концентрации. Инкубирует на качалке, двигающейся с малой скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 25 мин.
- Промыть секции дважды путем переноса их в новые лунки, содержащие 5 мл воды. Промыть на качалке, двигающейся с умеренной скоростью в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Монтаж Срезы мозга
- Используя маленькую кисть, смонтировать разделы на предметные стекла микроскопа. Удалить лишнюю воду и агар с помощью пинцета и небольшой ткани. Убедитесь в том, что весь агар удален перед продолжением обезвоживания.
- Разрешить разделы высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение приблизительно 45 мин (400 мкм секций) или 90 мин (разделы 500 мкм).
Примечание: Время и надлежащий уровень сухости имеет решающее значение, и, возможно, должны быть определены в каждомлаборатория в зависимости от температуры окружающей среды и уровня влажности. Слишком короткое время сушки приводит к секциям опадания слайдов во время последующих стадий обезвоживания, и слишком долго время сушки приводит к секциям растрескивания. Секции будут по-прежнему являются блестящими на соответствующем уровне сухости. - Пятно участки с крезиловым фиолетовым путем размещения скользит в Коплин окрашивания банок, как показано.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг может быть использован для секций, которые никогда не были заморожены, для того, чтобы окрасить нейронные ядра с крезиловым фиолетовым. Мы обнаружили, что очистка и регидратация секции до инкубации в крезиловой фиалке приводит даже окрашивание и низкий фон по разделам.- Место в очищающее средство в течение 5 мин. Повторить один раз.
- Место в 100% этаноле в течение 5 мин. Повторить один раз.
- Место в 95% этанола в воде, а затем 75% этанола в воде, а затем 50% этанола в воде в течение 2 минут каждый.
- Место в воде в течение 5 мин.
- Место в 0,5% (вес / объем) CRESYL фиолетовый в воде в течение 7 мин.
- Место в воде в течение 2 мин. Повторить один раз.
- Высушить секции путем размещения слайдов в Коплине окрашивания банок, как указано.
- Место в 50% этанола в воде, а затем 75% этанола в воде, а затем 95% этанола в воде в течение 2 минут каждый.
- Место в 100% этаноле в течение 5 мин. Повторить один раз.
- Место в очищающее средство в течение 5 мин. Повторить один раз.
Примечание: Это обезвоживание и клиринговые разы достаточно, чтобы обработать мозг мыши, как описано в этой рукописи. Тем не менее, мы наблюдали для других видов, включая крыс и Коуберд, что заключительный шаг очистка может потребоваться быть продлен до 15 мин общего количества.
- Покровная секция с использованием безводной монтажной среды.
- Разрешить слайды сушить в горизонтальном положении в темноте при комнатной температуре в течение по крайней мере, 5 дней.
2. визуализации Витражи Нейроны в толстых срезах головного мозга
- Захват стеки изображения
- Включите микроскоп лампочку, камера и контроллер стадии.
- Откройте микроскоп программного обеспечения (например, Neurolucida).
- Поместите слайд на предметный столик микроскопа.
- Захват 2D широкий вид изображения участка мозга с использованием цели малом увеличении, такие как 1.25x 0,4 Н. А. Planapo или 4X 0,16 Н.А.
- Фокус изображения и настроить параметры камеры, включая время экспозиции и баланс белого.
- Создать контрольную точку, щелкнув левой кнопкой мыши в любом месте на участке
- Захват изображения, выбрав «получить одно изображение» в окне захвата изображений.
- Захват среднего разрешения изображения стеки области, содержащей нейроны (ы), представляющих интерес, с использованием 10Х 0,3 Н. UPlan FL N цели.
- Фокусировка изображения и настройки параметров камеры, включая экспозицию и баланс белого.
- Установите верхние и нижние границы для стека изображений, сосредоточившись на верхнюю часть сечения ай пункт «установить» рядом с «вершины стека» в окне захвата изображений, а затем внимание на нижней части раздела и выбрать «установить» рядом с «Дно стека» в окне захвата изображений.
- Установите шаг расстояние до 5 мкм путем ввода «5 мкм» рядом с «расстоянием между изображениями» в окне захвата изображений.
- Захват стеки изображений путем выбора «стек получить изображение» в окне захвата изображений.
- Повторите описанные выше шаги, чтобы захватить всю интересующую область, убедившись, что все изображения стеки перекрываются, по меньшей мере, на 10% в X и оси Y.
- Захват изображения высокого разрешения стеки области, содержащей нейрон интерес, с помощью NA силиконового масла цели погружения в 30X 1,05.
- Применяют 3 - 4 капли силиконового иммерсионного масла на предметное стекло и поставить цель над горкой, обеспечивая, чтобы контакт между объективом и О.И.л.
- Фокусировка изображения и настройки параметров камеры, включая экспозицию и баланс белого.
- Установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений, сосредоточившись на верхней части секции и выбрать «установить» рядом с «вершина стека» в окне захвата изображений, а затем внимание на нижней части раздела и выбрать «установить» рядом с «нижней частью стеки» в окне захвата изображений.
- Установка шага расстояние до 1 мкм путем ввода «1 мкм» рядом с «расстоянием между изображениями» в окне захвата изображений.
- Захват стеки изображений путем выбора «стек получить изображение» в окне захвата изображений.
- Повторите описанные выше шаги, чтобы захватить всю интересующую область, убедившись, что все изображения стеки перекрываются, по меньшей мере, на 10% в X и оси Y.
- Сохраните файл данных и сохранить все файлы изображений в формате TIFF для внешней обработки.
- Создание Z-проекции изображений в ImageJ
- Открытое программное обеспечение ImageJ, который установлен плагин Био-форматы.
- Выберите "Плагины" -> "Био-форматы" -> "Био-форматы Importer".
- Выберите файл изображения стека должен быть открыт.
- После того как файл открыт, изменения формата в RGB, выбрав «Image» -> «Вид» -> «RGB Color».
- Создайте Z-проекцию, выбрав "Image" -> "Стопка" -> "Z Project ...".
- Сохранить двумерную Z-проецируемое изображение в виде файла TIFF.
- Создание двумерного изображения монтаж всей интересующей области.
- Открытое программное обеспечение (например, Adobe Photoshop).
- Выберите "Файл" -> "Автоматизация" -> "Photomerge".
- Выберите «Просмотр», а затем добавить все Imagэс-файлы, которые будут объединены.
- Убедитесь в том, что «Blend Images Together» выбран, а затем выберите «OK».
- Сохраните полученный фотомонтаж образ всей области интереса в виде файла TIFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол окрашивания Гольджи-Кокс и два его варианта, описанной необязательная могут быть использованы для визуализации отдельных нейронов в пределах 400 - 500 мкм толщины срезов головного мозга. Характерные изображения монтажи двумерных Z-проекций , захваченные с использованием объектива 10х и 5 мкм шаги в оси Z, показаны на рисунке 1: А1 - С1 для большой площади корональных срезов головного мозга , который включает в коре головного мозга в области 1 передней части поясной извилины и тому вторичная моторная кора 18. Секции были вырезаны при 500 мкм. Обратите внимание , что вариант протокола , который включает в себя крезиловые фиолетовое окрашивание позволяет идентифицировать кортикальные слои клеток, например , как показан на корковый слой 1 вдоль пиальной поверхности секций на рисунке 1B1. Отмечу также , подобные внешнему вид окрашенных участков при использовании основного протокола , используя все свежие ткани (рис 1A1) и варианты протокола , в которомМозг замораживает часть пути через для длительного хранения (рис 1C1).
Использование высокого разрешения 30X 1,05 силикона Н.А. масла погружения объективного позволяет захвата штабелей изображения, которые больше в Х и Y осей, чем те, получены с помощью цели более высокого увеличения, таким образом, требует меньше всего стеки изображения заданного круг интересов. Частности, цель занятая имеет рабочее расстояние 800 мкм, что более чем достаточно для толстых срезов мозга изображений. Изображение монтажи двумерный Z-проекций захвачены с использованием этой цели и шагов 1 мкм на осях Z, показаны на рисунке 1 (А2-С2) в передней части поясной извилины области 1, и двумерный Z-проекции обводки для указанные нейроны показаны на рисунке 1: A3 - C3. Обратите внимание на изображения с высоким разрешением, которые позволяют для визуализации нейронов и их дендриты черезглубина каждого стека изображения. Вариант протокола с помощью крезиловых фиолетового добавляет фиолетовое Нисслят окрашивание через срез, однако с параметрами используют это клеточное окрашивание наблюдаются только вблизи верхней части срез. Вариант протокола, который включает в себя дополнительный этапе замораживания производит нейрон окрашивания, которое аналогично основному протокол, однако он также вводит диффузное фоновое окрашивание, которое создает появление дымки, дифрагируя свет ниже поверхности среза. Эта мутность наиболее очевидно при визуализации глубже в срез и проявляется в Z-проекции изображения на рис 1C2. Изображения, захваченные с использованием цели 30X могут быть также использованы для визуализации и количественного определения тонких нервных структур, таких как дендритные шипами. Одно-плоскости изображения показаны на рисунке 2 для дендритов , окрашенных с помощью основного протокола и его два варианта, с одним изображением , принятым в верхней части секции и одного снятого изображения в нижней части секции. Обратите внимание на Purplе крезилового фиолетового окрашивания Нисслю вещества в пределах отдельных нейронов ядер вблизи верхней части секции на рисунке 2B1, который рассматривается как диффузный фиолетовый фон / рассеянный свет вблизи нижней части секции на рисунке 2B2. Следует также отметить , что , хотя дендриты и их шипы хорошо окрашивали с использованием протокола с стадии замораживания, ранее упомянутой фоновой дымки , которая является очевидным в нижней части среза на рисунке 2C2 делает его более трудным визуализировать шипы, ограничивая контраст между их и прилегающий фон. Цели более высокий увеличени могут также использоваться , чтобы характеризовать дендритную морфологию позвоночника, как показано на рисунке 2: А3 - С3 , где иглы различной типы хорошо видны в срезах , окрашенных с использованием каждого из трех протоколов. Здесь была использована 60X 1,42 NA Цель масло-погружением. Мы также использовали этот протокол для окрашивания и его варианты, чтобы окрасить нейроны в hippocAmpus секций разрезать на 400 мкм. Как показано на рисунке 3, нейронные дендриты и шипы могут быть визуализированы как в сторону более-медиальных областей секции (например, гиппокамп зубчатая извилина область на рисунке 3: А2 - С2) и более-боковых областей секции (например , , гиппокамп СА3 область на рисунке 3: А3 - С3). Следует также отметить , что каждое условие окрашивания аналогичные результаты, преимущества и недостатки, показанным на фигурах 1 и 2 для коры головного мозга.
Конечная толщина обрабатываемых участков мозга зависит от конкретного варианта протокола, используемого. Как показано на фигуре 4А для секций , содержащих кору головного мозга и разрезать на 500 мкм, был значительный эффект варианта протокола по измеренной толщины обработки и монтажа / секций (покрывали односторонний ANOVA, p <0.0001). Здесь, толщина секций с использованием основного протокола (251,0 ± 12,5 (СЭМ) мкм (п = 6)) и варианты протокола с участием крезиловых фиолетовой (219,3 ± 8,5 мкм (п = 6)) было меньше, чем толщина секций с использованием варианты протокола с участием стадии замораживания (340,6 ± 17,1 мкм (п = 6)) (Бонферроните апостериорные испытания, каждое сравнение р ≤ 0,0006). Наблюдались Очень похожие эффекты варианта протокола для разделов , содержащих гиппокамп и разрезают при 400 мкм (фиг.4В, один конец ANOVA, р <0,0001). Здесь, толщина секций с использованием основного протокола (217,6 ± 19,2 мкм (п = 6)) и варианты протокола с участием крезиловой фиолетовая (198,0 ± 14,8 мкм (п = 6)) было меньше, чем толщина секций производятся при помощи вариант протокола с участием стадии замораживания (313,5 ± 8,4 мкм (п = 6)) (Бонферроните апостериорные испытания, каждое сравнение р ≤ 0,001).
Рисунок 1. Примерной Микрофотография Витраж Нейроны в зоне передней части поясной извилины 1. А1 - С1, слившиеся Z-проекция стеков изображения , полученная с использованием объектива 10й показана для одного полушария коры головного мозга , который включает в коре головного мозга области передней части поясной извилины 1 и вторичной моторной коры при приблизительно брегма 1,18 мм 18. Эти срезы при 500 мкм. Микрофотографии показаны с помощью главного все-свежего протокола (А1), для варианта свежего протокола с крезиловыми фиолетовым окрашиванием (B1) и для варианта протокола , в котором мозг заморожен следующими Гольджи-Коксе пропитки (C1). Шкала бары 500 мкм. С более высоким разрешение объединена Z-проекция изображения стеки , полученной с использованием объектива силиконового масла-иммерсионного 30X показаны на A2 - C2 для каждой области , указанной красной квuare в микрофотографиях в А1 - С1. Шкала бары 100 мкм. 2D Z-проекции нейронов обводка показаны в A3 - C3 для нейронов , обозначенных красной стрелкой на микрофотографиях в А2 - С2. Диаметр всех дендритов были установлены до 2 мкм для простоты иллюстрации. Шкала бары 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иллюстративные Микрофотографии дендритных шипиков для Окраска нейронов. Микрофотографии, захваченные с помощью цели масла погружения в 30X кремния представлены в одной фокальной плоскости для нейронных дендритов, расположенных в слое 1 зоны коры головного мозга 1. передней части поясной извилины Эти срезы при 500 мкм. Нейроны окрашивали с использованием п реш протокола (А1, А2), вариант протокола с крезил фиолетовым окрашиванием (В1, В2) и для варианта протокола , в котором мозг заморожены следующие Гольджи-Кокса пропитки (C1, C2). Микрофотографии были взяты в верхней части среза (A1 - C1) и в нижней части среза рядом с предметным стеклом микроскопа (А2 - С2). Шкала баров для А1-2, В1-2 и С1-2 составляет 50 мкм. Микрофотографии показаны в A3, B3 и C3 для одной фокальной плоскости с использованием более высокое увеличением цели 60X масла погружения, для того , чтобы идентифицировать различные типы позвоночника. Шкала баров для А3, B3 и C3 являются 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
55358 / 55358fig3.jpg»/>
Рисунок 3. Примерной Микрофотография Витраж Нейроны в гиппокампе. Микрофотографии , захваченные с использованием объектива 4X, показаны в одной фокальной плоскости для нейронов , окрашенных с использованием свежего протокола (А1), вариантом протокола крезиловых фиолетовым окрашиванием (B1) и для варианта протокола , в котором мозг замораживает следующие Гольджи-Кокса пропитки (С1 ). Секции были вырезаны при 400 мкм и показаны приблизительно брегма -2.18 мм 18. Шкала баров 500 мкм для А1 - С1. Большее увеличение микрофотография были получена с помощью цели масла погружения в 30X кремния и показана в одной фокальной плоскости для нейроне дендриты расположена в зубчатой извилине гиппокампа (А2 - С2) и СА3 гиппокампа (А3 - С3). Шкала баров 50 мкм для А2 - С2и A3 - С3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Толщина смонтированных секций. Измеряется толщина установленных секций показана на А , для секций , содержащих кору головного мозга при приблизительно брегма 1,18 мм 18 и разрезают при толщине 500 мкм, а в B для секций , содержащих гиппокамп при приблизительно брегма -2,18 мм 18 и разрезают на 400 мкм толщина. Измеренные срезы окрашивали с использованием либо свежий протокол, вариант протокола крезиловым фиолетовым окрашиванием, или вариант протокола, в котором мозг заморожен следующие Гольджи-Кокса пропитки. Для обеих областей мозга, наблюдалось значительное влияние протокола обработки(Односторонний ANOVA, р <0,0001), где секции из мозгов, которые были заморожен частью пути через протокол были значительно толще, чем те, которые не были заморожены (Бонферроните апостериорный тест, все р <0,001). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM для шести секций в каждой группе, а также наборы данных с различными буквами указывают на значительные различия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем протокол Гольджи-Кокса окрашивания вместе с двумя вариантами полезными для визуализации нейронов в толстых срезах головного мозга. Как показано на Представитель Результатов, использование объектива с высоким разрешением, который имеет большое рабочее расстояние 800 мкм позволяет для надежной визуализации целых нейронов по всей глубине срезов головного мозга, вырезанных при 500 мкм. Это исследование относительно толстых срезов головного мозга увеличивает вероятность того, что окрашенные нейроны любого типа полностью содержащуюся в срезе, что особенно важно для пирамидальных нейронов с длинными и сложными апикальными дендритами дерев. Например, в корональных участках мозга грызунов, это позволяет для включения нейронов, которые простираются дальше в ростральном или каудальном направлении, а также увеличивает пространство для ошибки при блокировке мозга непосредственно на стадии секционирования. Хотя мы описываем мозг секционирования в корональной плоскости только этот протокол может быть адаптирован для секционирования в других плиAnes по мере необходимости, чтобы полностью содержать меченые нейроны в отдельных разделах. Плоскость секционирования занятого будет зависеть от морфологических свойств популяции нейронов исследуемого. Дендритные шип можно визуализировать и количественно с использованием этого протокола, хотя цели более высокий увеличени необходимы для оценки типа позвоночника / морфология , такой как цели масла погружения 60X , используемых для получения микрофотографии на рисунке 2: A3 - C3. Это может быть использовано в толстых секций, но ограничена в верхней части среза в пределах рабочего расстояния объектива. Этот протокол также может быть адаптирован для использования в различных видах аналогичного размера мозга, как мы обнаружили, что стандартный 25-дневный период пропитки будет полностью окрасить нейроны на протяжении мыши, крыс и Коуберд мозга, не приводя к избыточному неспецифического окрашивания или фону что может произойти с периодами пропитывания за пределами одного месяца. Более короткие периоды пропитки могут быть достаточными для видов с SMaller мозг или в рассеченных образцах головного мозга от упомянутых выше видов, которые могут быть оптимизированы с помощью отдельного исследователя.
Из трех вариантов, представленных для этого окрашивания протокола, основной протокол с использованием свежих образцов мозга, которые не контрастно дает наилучшие результаты. Микрофотографии на рисунке 2 A демонстрируют , что этот основной протокол производит также меченные дендриты и шипы, которые хорошо видны в верхней и нижней части , смонтированных толстых секций. Добавление крезил фиолетовые контрастный имеет преимущество содействия определения мозга и мозговых области слоев коры головного мозга, но также добавил диффузный фиолетовый фон при визуализации глубоко в толстые секции. Однако, так как этот вариант протокола только окрашивает поверхность смонтированных толстых секций с крезиловым фиолетовым, дендритов и их шипов были хорошо видны в нижней части секций (Рисунок 2 В). Это также, как представляется, произвосе более четкая картина Нисслит окрашивания вблизи поверхности толстых секций , чем это показано в ранее отчетах, даже при использовании гораздо тоньше секций 19, 20, 21. Вариант протокола, который включает стадию замораживания дает приемлемые результаты для анализа дендритной морфологии дерева. Однако фоновое окрашивание намного темнее , чем в свежей ткани, которая является наиболее заметным при визуализации глубже в срез , таким образом , делая его более трудным для визуализации и количественного определения дендритных шипов (Рисунок 2 C). Мы предприняли попытку Cresyl фиолетовую контрастные в срезах головного мозга, которые были заморожены, и это порождало еще более темный-фиолетовый фон дымок, что сделало его чрезвычайно трудно визуализировать и количественно колючки в нижней части разреза (данные не показаны). Другим вариант безуспешного протокола, который был оценен включал замораживание мозга мыши перед Гольджи-Кокса impregnция. Это привело к окрашиванию клеточных объектов, которые могут быть глии, но не окрашивали любой тип нейрона (данные не показаны).
Есть два важных шагов в этом протоколе, которым необходимо следовать, чтобы получить успешные результаты. (1) Очень важно, чтобы проверить время сушки секций внутри каждой лаборатории, потому что это в значительной степени зависит от температуры и влажности. Если время сушки слишком коротко, участки отвалятся слайды во время процесса обезвоживания; если время сушки слишком долго, разделы треснут. Было бы полезно, чтобы проверить время сушки в наборе «тестовых» мозги как раз перед брикетированием изыскания, так как это может варьироваться в зависимости от сезона, даже с одной и той же лабораторией. (2) Весь избыток агар должен быть удален из раздела стекла микроскопа и перед стадиями обезвоживания. Если это не будет сделано, агар деформируется и может потянуть секцию от ползуна.
Еще одним важным фактором для гистологическихаль анализ биологических образцов усадка ткани. Мы обнаружили , что после обработки, монтаж, обезвоживание и coverslipping срезов головного мозга с использованием основного протокола Гольджи-Кокса , что конечная толщина секции была снижена примерно на половине первоначального значения разреза (рисунок 4). Также отметим , что секции , обработанные с использованием варианта протокола , который включал в себя стадию замораживания были значительно толще , чем свежие секций , которые были обработаны с помощью основного протокола (Рисунок 4). Это было интересным и неожиданным, поскольку оба протокола участвуют одни и те же криозащиты и обработки шагов, и только отличались от фактического замораживания мозга. Поэтому очень важно, чтобы учесть возможные различия в протоколах при сравнении данных нейронной морфологии, сгенерированных с помощью Гольджи-Кокса окрашивания из различных исследований или из разных лабораторий. Несмотря на то, что мы не смогли найти данные для конечной толщины секции в литературе, было бы полезнодля исследователей сообщать эти данные и / или правильные усадка ткани при освещении мер нейрона морфологии. Следует также отметить, что хотя конечная толщина> 200 мкм на участках, вырезанных при 500 мкм больше, чем рабочее расстояние от большинства задач с высоким увеличением, это все еще хорошо в пределах рабочего расстояния объектива 30X, используемой в нашей лаборатории. Так как дендриты и шипы отчетливо видны в нижней части этих срезов с использованием основного протокола Гольджи-Кокса, может быть возможно визуализировать нейроны, содержащиеся в разделах, вырезанных на гораздо большую толщину вплоть до и включая диапазон 1 мм.
Хотя этот протокол обеспечивает ряд преимуществ, включая возможность отслеживать длинные дендритные беседки в отдельных секциях, возможность отложить нарезку и обработку пропитанных мозгов, а возможность контрастного крезиловые фиолетовый, чтобы лучше определить структуры мозга, есть некоторые недостатки, которые долженбыть на рассмотрении. Инкубационный период 25 дней можно считать слишком долго для некоторых исследователей. Способность изображения вглубь установленных секций зависит от доступа к иммерсионный объектив высокого разрешения с большим рабочим расстоянием, которое является относительно дорогим. Кроме того, способность визуализировать тонкие структуры с высокой разрешающей способностью уменьшается по мере одного изображений вблизи нижней части установленного среза. Реализация этого протокола, следовательно, зависит от морфологических свойств нейронов и области мозга, которые будут изучены, и оборудование, доступное для исследователя. Мы рекомендуем использовать «тест» образцы для оптимизации переменного протокола до запуска научного исследования, таких как Гольджи-Кокса время пропитки для размера мозга и области интересов, а также плоскость и толщину секционирования для дендритов к визуализироваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Discovery Грант CDCB из естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC), лидеров фонда грант исследовательской инфраструктуры Джон Р. Эванс CDCB из Канады Фонд инноваций (CFI проект номер 30381), а также по открытие Грант NJM от NSERC. ELL была поддержана Стипендия Ontario Graduate и стипендию ВЗУ из Онтарио ветеринарного колледжа при Университете гвельфов. CDS была поддержана магистрант Research ассистентами из NSERC. ALM была поддержана Стипендия Александр Грэхем Белл из NSERC и в ВЗУ Scholarship из Онтарио ветеринарного колледжа при Университете гвельфов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
