Summary
Se presenta un protocolo por el método de tinción de Golgi-Cox en secciones de cerebro de espesor, con el fin de visualizar las neuronas con árboles dendríticos largas contenidos dentro de muestras de tejido individuales. También se presentan dos variantes de este protocolo que implica cresilo contratinción violeta, y la congelación de los cerebros no transformadas para almacenamiento a largo plazo.
Abstract
El método de Golgi-Cox de la tinción de las neuronas ha sido empleado durante más de doscientos años para avanzar en nuestra comprensión de la morfología de las neuronas dentro del cerebro muestras histológicas. Si bien es preferible desde un punto de vista práctico para preparar secciones de cerebro en el mayor espesor posible, a fin de aumentar la probabilidad de identificar neuronas teñidas que están contenidos completamente dentro de las secciones individuales, este enfoque es limitado desde un punto de vista técnico por la distancia de trabajo de alto -magnification objetivos de microscopio. Presentamos aquí un protocolo para teñir las neuronas utilizando el método de Golgi-Cox en secciones de cerebro de ratón que se cortan en 500 espesor m, y para visualizar las neuronas en toda la profundidad de estas secciones usando un microscopio vertical equipado con una alta resolución de 30X de silicona 1,05 NA objetivo de inmersión en aceite que tiene una distancia de trabajo de 800 m. describen además dos variantes útiles de este protocolo que se puede emplear para contrateñir la superficie demontado secciones de cerebro con la tinción de violet Nissl de cresilo, o para congelar los cerebros enteros para almacenamiento a largo plazo antes de seccionar y el procesamiento final. El protocolo principal y sus dos variantes producen secciones de cerebro de espesor manchadas, a lo largo de la cual los árboles neurona dendríticas completos y espinas dendríticas se pueden visualizar y cuantificar de forma fiable.
Introduction
La visualización de las neuronas individuales dentro de muestras de tejido permite el análisis in situ de las neuronas características morfológicas, que ha avanzado significativamente nuestra comprensión del cerebro y cómo puede ser influenciado por la enfermedad endógena o factores ambientales exógenas. El método de tinción de Golgi-Cox es un medio rentables, relativamente simples de la tinción de una muestra aleatoria de las neuronas dentro del cerebro. En primer lugar desarrollado por Golgi 1 y modificado por Cox 2 en la década de 1800, los investigadores han perfeccionado esta técnica en los últimos años para producir neuronas claros y bien teñidas con que se pueden utilizar para visualizar y cuantificar tanto la morfología del árbol dendrítico y la densidad de la columna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Una consideración técnica importante para la visualización de las neuronas teñidas dentro de las secciones del cerebro es el espesor máximo rebanada, que está limitada por la distancia de trabajo de los objetivos disponibles de gran aumento / de alta resolución del microscopio. objetivos de inmersión en aceite comunes en el 60 - 100X gama proporcionan una excelente resolución, pero están limitados por sus distancias de trabajo que son típicamente no mayor de 200 m. Las secciones de cerebro de corte en el rango de 200 micras pueden ser adecuadas para visualizar ciertos tipos de neuronas que pueden estar contenidos dentro de este grosor de corte, por ejemplo las neuronas piramidales en las capas superficiales de la corteza cerebral 10, 11, 12, las neuronas piramidales en la región CA1 de la hipocampo 13, 14, y las células granulares en el giro dentado del hipocampo 15. Las neuronas con relativamente más largoárboles dendríticos, tales como las neuronas piramidales en las capas profundas de la corteza cerebral que para el ratón se puede extender más de 800 m desde el cuerpo celular 16, proporcionan un mayor reto porque tendrían que ser seccionada en un ángulo perfecto cerebros para contener todo el árbol de dendritas dentro de los 200 m rodajas. Esto puede incluso no ser factible si una dendrita o cualquiera de sus ramas se extienden en la dirección rostral o caudal. Si bien es posible abordar esta limitación mediante el trazado de una neurona a través de múltiples secciones de cerebro adyacentes, este enfoque presenta un desafío técnico significativo en la alineación de las secciones con precisión para la localización 17. Un enfoque más práctico sería para visualizar las neuronas enteras contenidas dentro de las secciones del cerebro que se cortan en un espesor mayor.
Presentamos aquí una técnica para teñir las neuronas dentro de 400 - secciones de cerebro de espesor 500 micras de ratones utilizando el método de Golgi-Cox, y para visualizar su morphology usando un silicio objetivo de inmersión en aceite de alta resolución que tiene una distancia de trabajo de 800 m. La impregnación y el procesamiento de protocolo de Golgi-Cox que describimos se modificó a partir de uno de los protocolos modernos más citados en la literatura 6. Nuestro enfoque con secciones de cerebro de espesor proporciona la ventaja de aumentar la probabilidad de identificar neuronas de cualquier tipo que están contenidos completamente dentro de la sección. Además del protocolo principal, también presentes dos variaciones que proporcionan ventajas únicas: (1) la tinción de Golgi-Cox con la contratinción cresil violeta en la superficie de las secciones montadas, con el fin de definir los límites de las regiones del cerebro y para identificar capas de la corteza cerebral, y (2) tinción de Golgi-Cox con una etapa de congelación intermedio para el almacenamiento a largo plazo de cerebros enteros impregnadas antes de seccionar y el procesamiento final.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ratones CD1-deformación hembras adultas se utilizaron en este estudio. tinción similar se puede lograr usando ambos sexos en diversas edades. Los animales experimentales fueron atendidos de acuerdo a los principios y directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y el protocolo experimental fue aprobado por la Universidad de Guelph Cuidado de Animales.
1. Golgi-Cox tinción
- Golgi-Cox La impregnación de cerebros
- Hacer la solución Golgi-Cox de 1% (w / v) de dicromato de potasio, 0,8% (w / v) de cromato de potasio y 1% (w / v) de cloruro de mercurio disolviendo el dicromato de potasio y cromato de potasio en agua de alta calidad por separado . Mezclar las soluciones, añadir el cloruro de mercurio y filtrar la solución final utilizando grado 1 papel de filtro. Guardar la solución en la oscuridad durante un máximo de un mes.
- Anestesiar al ratón usando 5% de isoflurano.
- La eutanasia el ratón por decapitación y eliminar rápidamente el cerebro.
- Coloque el cerebro en un vial de centelleo de 20 mL glass que contenía 17 ml de solución de Golgi-Cox y se incuba en la oscuridad a TA durante 25 d.
- Cryoprotect el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contenía 40 ml de sacarosa crioprotector (30% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4) en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
Nota: Las siguientes tres pasos opcionales se pueden emplear como alternativa al protocolo principal, con el fin de congelar el cerebro en esta etapa para el almacenamiento a largo plazo. - Congelar todo el cerebro sumergiéndolo en 200 ml de isopentano que ha sido previamente enfriada en hielo seco.
- Coloque el cerebro congelado en un tubo cónico de 50 ml y almacenar en la oscuridad a -80 ° C.
- Cuando esté listo para proceder, descongelar el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 40 ml de crioprotector sacarosa en la oscuridad a 4 ° C durante 24 h.
- Seccionamiento cerebro
- Retire el cerebro de la sacarosa y el bloquek es para seccionar cortando el cerebelo utilizando una hoja de afeitar y dejando un borde plano en el extremo caudal restante del cerebro.
- agar de calor (3% (w / v) en agua) hasta que se funde y se deja enfriar hasta que esté ligeramente por encima de su punto de fusión.
- Coloque el cerebro en un pequeño plato desechable sopesar con su extremo caudal boca abajo y añadir una cantidad suficiente de agar fundido para cubrir el cerebro.
- Una vez que el agar se ha solidificado, recortar el exceso de agar dejando aproximadamente de 2 - 4 mm que rodea el cerebro y la cola del cerebro a la etapa de un vibratome con su cara hacia abajo extremo caudal usando una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato de etilo.
- Llenar el área de la etapa de la vibratome con una cantidad suficiente de crioprotector sacarosa para cubrir el cerebro, y la sección del cerebro en un grosor de corte alcanzan 400 - 500! M (dependiendo de la región del cerebro a ser examinado) usando una frecuencia de vibración de 86 Hz y una velocidad de avance de la hoja de 0,125 mm / s.
- Usando un pequeño pincel, Secciones lugar cerebro en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos que contiene insertos y de malla inferior comercialmente disponibles precargada con 10 ml de 6% (w / v) de sacarosa en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Incubar las secciones en la oscuridad a 4 ° CO / N.
- El desarrollo de las secciones del cerebro
- El uso de los insertos de malla inferior, transferir secciones de cerebro en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de paraformaldehído al 2% (v / w) (PBD) en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4. Incubar en un eje de balancín se mueve a velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
- Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
- secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de 2,7% (v / v) de hidróxido de amonio. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 15 min.
- Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. lavar ona eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
- Secciones de transferencia en un nuevo pocillo que contenía 5 ml de fijador A (ver Tabla de Materiales) que ha sido diluido en 10 veces de agua de su original concentración comprado. Incubar en un eje de balancín que se mueve a una velocidad lenta en la oscuridad a TA durante 25 min.
- Lavar las secciones dos veces transfiriéndolos a nuevos pocillos que contienen 5 ml de agua. Lavar en un eje de balancín se mueve a una velocidad moderada en la oscuridad a TA durante 5 min.
- Montaje de las secciones del cerebro
- Usando un pincel pequeño, montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Eliminar el exceso de agua y agar usando pinzas y una pequeña de tejido. Asegúrese de que todo el agar se retira antes de proceder a la deshidratación.
- Permitir secciones se sequen al aire a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min (400 m secciones) o 90 min (500 m secciones).
NOTA: El nivel de temporización y adecuado de sequedad es crítica, y puede necesitar ser determinado en cadalaboratorio dependiendo de la temperatura ambiente y nivel de humedad. Demasiado corto un tiempo de secado conduce a las secciones que están fuera de las diapositivas durante etapas de deshidratación posteriores, y demasiado largo de un tiempo de secado conduce a secciones de craqueo. Secciones todavía parecen ser brillante en el nivel apropiado de sequedad. - secciones se tiñen con violeta de cresilo mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
NOTA: Este paso opcional puede emplearse para las secciones que nunca habían sido congelados, con el fin de teñir los núcleos neuronales con violeta de cresilo. Hemos encontrado que la compensación y la rehidratación de las secciones antes de la incubación en violeta de cresilo conduce a incluso las manchas y bajo fondo a través de secciones.- Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
- Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
- Colocar en etanol al 95% en agua, a continuación, 75% de etanol en agua, y luego etanol al 50% en agua durante 2 min cada una.
- Colocar en agua durante 5 min.
- Colocar en 0,5% cre (v / w)violeta Syl en agua durante 7 min.
- Colocar en agua durante 2 min. Repita una vez.
- Deshidratar secciones mediante la colocación de diapositivas en recipientes de tinción Coplin como se indica.
- Colocar en 50% de etanol en agua, luego 75% de etanol en agua, y luego etanol al 95% en agua durante 2 min cada una.
- Colocar en 100% de etanol durante 5 min. Repita una vez.
- Colocar en agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
Nota: Estos deshidratación y de compensación veces son suficientes para procesar cerebros de ratón como se describe en este manuscrito. Sin embargo, hemos observado para otras especies, incluida la rata y cowbird, que puede necesitar ser extendido hasta 15 min total de la etapa de limpieza final.
- secciones cubreobjetos usando un medio de montaje anhidro.
- Permitir que se sequen horizontalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 5 d.
2. Imaging manchado neuronas en el cerebro secciones gruesas
- La captura de Pilas de imágenes
- Encender la bombilla de luz del microscopio, cámara, y el controlador de fase.
- Abra el software de microscopio (por ejemplo, Neurolucida).
- Coloque una diapositiva en la platina del microscopio.
- Capturar una en toda la vista de la imagen 2D de la sección de cerebro usando un objetivo de baja magnificación como 1,25X 0,4 NA PlanApo o 4X 0,16 NA
- Enfoque la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo el tiempo de exposición y balance de blancos.
- Crear un punto de referencia haciendo clic izquierdo en cualquier parte de la sección
- Capture la imagen seleccionando la opción "recibir la imagen única" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Captura mediados de resolución pilas de imágenes de la zona que contiene las neuronas (s) de interés, usando un 10X 0,3 objetivo NA UPlan FL N.
- Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
- Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección de unand selección de "ajuste" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Ajuste la distancia de paso de 5 micras mediante la introducción de "5 micras" junto a "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
- Captura de alta resolución pilas de imágenes de la zona que contiene la neurona de interés, utilizando un 30X 1,05 NA silicona objetivo de inmersión en aceite.
- Aplicar 3 - 4 gotas de aceite de inmersión de silicona a la diapositiva y coloque el objetivo sobre el portaobjetos, asegurando a hacer contacto entre el objetivo y el OIl.
- Enfocar la imagen y ajustar la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
- Establecer los límites superior e inferior de la pila de imágenes, centrándose en la parte superior de la sección y seleccionando "set" al lado de "parte superior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego se centra en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" junto a "parte inferior de la pila" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Ajuste la distancia de paso de 1 m mediante la introducción de "1 m" al lado de "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Capturar la pila de imágenes mediante la selección de "pila de adquirir" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
- Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superponen en al menos un 10% en los ejes X e Y.
- Guarde el archivo de datos y guardar todos los archivos de imagen en formato TIFF para el procesamiento externo.
- Crear imágenes Z-proyección en ImageJ
- el software ImageJ abierto que ha instalado el plugin Bio-formatos.
- Seleccione "Plug-ins" -> "Bio-formatos" -> "Bio-Formatos importador".
- Seleccione el archivo de imagen de pila que se abrirá.
- Una vez abierto el archivo, cambiar el formato a RGB seleccionando la opción "Imagen" -> "Tipo" -> "Color RGB".
- Crear el Z-proyección seleccionando "Imagen" -> "Pilas" -> "Z proyecto ...".
- Guarda la imagen Z-proyección bidimensional como un archivo TIFF.
- Crear un montaje de imagen bidimensional de toda el área de interés.
- Abra el software (por ejemplo, Adobe Photoshop).
- Seleccione "Archivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
- Seleccione "Examinar" y luego añadir todas imagES archivos que se fusionen.
- Asegurar que "Blend Images Juntos" está seleccionado y luego seleccione "OK".
- Guardar la imagen resultante montaje de toda el área de interés como un archivo TIFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo de tinción Golgi-Cox y sus dos variantes opcionales descritos pueden emplearse para visualizar las neuronas individuales dentro de 400 - 500 micras secciones de cerebro de espesor. Montajes de imágenes representativos de dos dimensiones Z-proyecciones capturados usando un objetivo de 10X y 5 micras pasos en el eje Z se muestran en la Figura 1: A1 - C1 para un área grande de secciones cerebrales coronales que incluye el área de la corteza cingulada anterior 1 y la córtex motor secundario 18. Se cortaron secciones a 500! M. Tenga en cuenta que la variante de protocolo que incluye la tinción de violeta de cresilo permite la identificación de las capas de células corticales, por ejemplo como se ha visto para la capa cortical 1 a lo largo de la superficie pial de las secciones en la figura 1B1. Tenga en cuenta también el aspecto similar de secciones teñidas utilizando el protocolo principal usando todo-fresco tejido (Figura 1A1) y la variante de protocolo en el cualcerebros se congelan en parte a través de almacenamiento a largo plazo (Figura 1C1).
El uso de una alta resolución 30X 1.05 silicona NA objetivo de inmersión en aceite permite la captura de pilas de imágenes que son más grandes en el ejes X e Y de los capturados usando un objetivo de mayor aumento, por lo que requiere un menor número de pilas totales a una imagen dada Area de interes. El objetivo particular empleado tiene una distancia de trabajo de 800 m, que es más que suficiente para secciones de cerebro de espesor de imagen. Montajes de imagen de dos dimensiones Z-proyecciones capturaron con este objetivo y 1 m pasos en el eje Z se muestra en la Figura 1 (A2-C2) dentro de la corteza cingulada anterior área de la corteza 1, y de dos dimensiones Z-proyecciones de trazados para el neuronas indicadas se muestran en la Figura 1: A3 - C3. Tenga en cuenta que las imágenes de alta resolución que permiten la visualización de las neuronas y sus dendritas a través de laprofundidad de cada pila de imágenes. La variante de protocolo usando violeta de cresilo añade tinción de Nissl púrpura a través de la rebanada, sin embargo con los parámetros emplean esta tinción celular sólo se observa cerca de la parte superior de la rebanada. La variante de protocolo que incluye la etapa de congelación opcional produce tinción neurona que es similar al protocolo principal, sin embargo, también introduce una tinción de fondo difusa que crea la apariencia de turbidez por difracción de luz por debajo de la superficie de la rebanada. Esta niebla es más evidente cuando la formación de imágenes más profundamente en la rebanada y es evidente la imagen Z-proyección en la figura 1C2. Las imágenes capturadas utilizando el objetivo 30X también se pueden usar para visualizar y cuantificar estructuras neuronales finas tales como espinas dendríticas. Imágenes individuales del plano se muestran en la Figura 2 para dendritas teñidas utilizando el protocolo principal y sus dos variantes, con una imagen tomada cerca de la parte superior de la sección y una imagen tomada cerca de la parte inferior de la sección. Tenga en cuenta el purple violeta de cresilo tinción de Nissl sustancia dentro de los núcleos neuronales individuales cerca de la parte superior de la sección en la figura 2B1, que se ve el fondo púrpura como difusa luz / dispersado cerca de la parte inferior de la sección en la figura 2B2. Tenga en cuenta también que aunque dendritas y sus espinas son bien teñidas utilizando el protocolo con la etapa de congelación, la ya mencionada-neblina de fondo que es aparente cerca de la parte inferior de la rebanada en la Figura 2C2 hace que sea más difícil visualizar espinas limitando el contraste entre ellos y el fondo adyacente. Objetivos-aumento mayor también se pueden utilizar para caracterizar la morfología de la espina dendrítica, como se muestra en la Figura 2: A3 - C3 donde espinas de diferentes tipos son claramente visibles en secciones teñidas utilizando cada uno de los tres protocolos. En este caso, se utilizó un objetivo de 60x NA 1.42 de inmersión en aceite. También empleamos este protocolo de tinción y sus variantes para teñir las neuronas dentro del hippocampus de secciones de corte a 400! m. Como se muestra en la Figura 3, las dendritas de las neuronas y las espinas se pueden visualizar tanto hacia las áreas más-medial de la sección (por ejemplo, la región de giro dentado del hipocampo en la Figura 3: A2 - C2) y las zonas de más-lateral de la sección (por ejemplo, , la región CA3 del hipocampo en la Figura 3: A3 - C3). También hay que señalar que cada condición de tinción produjo resultados similares, ventajas y desventajas a las que se muestran en las Figuras 1 y 2 para la corteza cerebral.
El espesor final de las secciones del cerebro procesadas depende de la variante de protocolo específico empleado. Como se muestra en la figura 4A para las secciones que contienen la corteza cerebral y cortar a 500! M, hubo un efecto significativo de la variante de protocolo sobre el espesor medido de procesado y montado / secciones coverslipped (ANOVA de una vía, p <0,0001). Aquí, el espesor de las secciones hizo usando el protocolo principal (251,0 ± 12,5 (SEM) m (n = 6)) y la variante de protocolo que implica violeta de cresilo (219,3 ± 8,5 m (n = 6)) era menor que el espesor de las secciones hecha utilizando la variante de protocolo que implica la etapa de congelación (340,6 ± 17,1 m (n = 6)) (test de Bonferroni post-hoc, cada comparación p ≤ 0,0006). Se observaron efectos muy similares de la variante de protocolo para las secciones que contienen el hipocampo y se cortan a 400 m (Figura 4B, ANOVA de una vía, p <0,0001). Aquí, el espesor de las secciones hizo usando el protocolo principal (217,6 ± 19,2 m (n = 6)) y la variante de protocolo que implica violeta de cresilo (198,0 ± 14,8 m (n = 6)) fue menor que el espesor de las secciones hechas usando las variante de protocolo que implica la etapa de congelación (313,5 ± 8,4 m (n = 6)) (test de Bonferroni post-hoc, cada comparación p ≤ 0,001).
Figura 1. Ejemplar fotomicrografías de Stained Las neuronas en el área anterior Cingulate 1. A1 - C1, se fusionó Z-proyecciones de pilas de imágenes adquiridas utilizando un objetivo 10X se muestran para un hemisferio de la corteza cerebral que incluye el área de la corteza cingulada anterior 1 y secundaria corteza motora aproximadamente a Bregma 1,18 mm 18. Estas secciones fueron cortadas a 500! M. Las fotomicrografías se muestran utilizando la principal todo-fresco protocolo (A1), para la variante de protocolo fresco con tinción de violeta de cresilo (B1) y para la variante de protocolo en el que los cerebros se congelan siguiente Golgi-Cox impregnación (C1). Las barras de escala son 500 m. De mayor resolución se fusionó Z-proyección pilas de imágenes adquiridas utilizando un objetivo de silicio de inmersión en aceite 30X se muestran en A2 - C2 para cada área indicado por el cuadrado rojouare en las fotomicrografías en A1 - C1. Las barras de escala son 100 m. 2D Z-proyecciones de los trazados de las neuronas se muestran en A3 - C3 para las neuronas indicados por la flecha roja en las fotomicrografías en el A2 - C2. El diámetro de todas las dendritas se establecieron a 2 m para facilitar la ilustración. Las barras de escala son 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplar fotomicrografías de las espinas dendríticas para Stained neuronas. Las fotomicrografías capturados usando un objetivo de inmersión en aceite 30X de silicio se muestran en un plano focal de dendritas de neuronas ubicadas dentro de la capa 1 de la área de la corteza cingulada anterior 1. Estas secciones fueron cortadas a 500! M. Las neuronas se tiñeron usando el f protocolo Resh (A1, A2), la variante de protocolo con tinción de violeta de cresilo (B1, B2) y para la variante de protocolo en el que los cerebros se congelan siguiente Golgi-Cox impregnación (C1, C2). Las fotomicrografías se tomaron cerca de la parte superior de la rebanada (A1 - C1) y cerca de la parte inferior de la rebanada al lado del portaobjetos de microscopio (A2 - C2). Las barras de escala para A1-2, B1-2 y C1-2 son 50 m. Las fotomicrografías se muestran en la A3, B3 y C3 de un plano focal usando un mayor aumento del objetivo de inmersión en aceite 60X, con el fin de identificar los diferentes tipos de la columna vertebral. Las barras de escala para A3, B3 y C3 son 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
55358 / 55358fig3.jpg"/>
Figura 3. Ejemplar fotomicrografías de Stained Las neuronas en el hipocampo. Las fotomicrografías capturados usando un objetivo 4X se muestran en un plano focal para las neuronas teñidas utilizando el protocolo fresco (A1), la variante de protocolo con tinción de violeta de cresilo (B1) y para la variante de protocolo en el que los cerebros se congelan siguiente Golgi-Cox de impregnación (C1 ). Se cortaron secciones a 400 micras y se muestran en aproximadamente Bregma -2,18 mm 18. Las barras de escala son 500 micras para A1 - C1. Fotomicrografías de mayor aumento fueron capturados utilizando un objetivo de inmersión en aceite 30X de silicio y se muestran en un plano focal para dendritas neurona situado dentro de la región del giro dentado del hipocampo (A2 - C2) y la región CA3 del hipocampo (A3 - C3). Las barras de escala son de 50 m para A2 - C2y A3 - C3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El espesor de las secciones montadas. El espesor medido de las secciones montadas se muestra en una de las secciones que contienen la corteza cerebral en aproximadamente Bregma 1,18 mm 18 y se corta a 500 m de espesor, y en B para las secciones que contienen el hipocampo aproximadamente a Bregma -2,18 mm 18 y se corta a 400 micras espesor. secciones medidas se tiñeron utilizando el protocolo fresco, la variante de protocolo con tinción de violeta de cresilo, o la variante de protocolo en el que los cerebros se congelan siguiente Golgi-Cox impregnación. Para ambas regiones del cerebro, hubo un efecto significativo de protocolo de procesamiento(ANOVA de una vía, p <0,0001), donde las secciones de los cerebros que eran parte del camino congelado a través del protocolo fueron significativamente más gruesas que las que no se congela (prueba de Bonferroni post-hoc, todos p <0,001). Los datos se muestran como la media ± SEM de seis secciones en cada grupo, y los conjuntos de datos con diferentes letras indican diferencias significativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se describe aquí un protocolo de tinción Golgi-Cox junto con dos variantes útiles para la visualización de las neuronas dentro de las secciones del cerebro de espesor. Como se muestra en los resultados representativos, el uso de un objetivo de alta resolución que tiene una larga distancia m de trabajo 800 permite la visualización fiable de las neuronas enteras a lo largo de la profundidad de las secciones del cerebro cortadas a 500! M. Este estudio de secciones del cerebro relativamente gruesas aumenta la probabilidad de que las neuronas teñidas de cualquier tipo están contenidas completamente dentro de la porción, que es especialmente importante para las neuronas piramidales con árboles dendrita apical largo y complicado. Por ejemplo, en las secciones coronales de cerebro de roedor, esto permite la inclusión de las neuronas que se extienden más lejos en la dirección rostral o caudal, y también aumenta el margen de error al bloquear el cerebro de lleno en la etapa de seccionamiento. Aunque describimos cerebro de seccionamiento en el plano coronal solamente, este protocolo puede ser adaptado para seccionar en otros plAnes según se requiera para completamente contiene neuronas marcadas dentro de las secciones individuales. El plano de seccionado empleada dependerá de las propiedades morfológicas de la población de neuronas bajo investigación. Las espinas dendríticas pueden visualizarse y cuantificarse usando este protocolo, aunque se requieren objetivos de mayor magnificación para evaluar tipo columna vertebral / morfología, tales como el objetivo de inmersión en aceite 60X utilizado para producir las fotomicrografías en la Figura 2: A3 - C3. Esto se puede emplear en secciones gruesas, pero se limita a la parte superior de la rebanada dentro de la distancia de trabajo del objetivo. Este protocolo también se puede adaptar para su uso en diferentes especies de tamaño del cerebro similar, ya que hemos encontrado que un periodo de impregnación estándar de 25 días las neuronas en todo el ratón, la rata y el cerebro cowbird manchará totalmente sin conducir a exceso de tinción o de fondo no específica que pueden ocurrir con los períodos de impregnación más allá de un mes. períodos más cortos de impregnación pueden ser suficientes para especies con scerebros Menores o en muestras disecadas de cerebros de las especies antes mencionadas, lo que podría ser optimizados por el investigador individual.
De las tres variantes que se presentan para este protocolo de tinción, el protocolo principal usando muestras de cerebro frescas que no se tiñen produce los mejores resultados. Las fotomicrografías de la Figura 2 A demuestran que este protocolo principal produce dendritas y espinas bien etiquetados que son fácilmente visibles en la parte superior e inferior de las secciones gruesas montadas. La adición de la contratinción de violeta de cresilo tiene la ventaja de facilitar la definición de las regiones del cerebro y las capas de la corteza cerebral, pero también añadió un fondo púrpura difusa al visualizar profundamente en secciones gruesas. Sin embargo, puesto que esta variante de protocolo sólo tiñe la superficie de secciones gruesas montadas con violeta de cresilo, dendritas y sus espinas eran claramente visibles en la parte inferior de las secciones (Figura 2 B). Esto también parece produce un patrón más clara de la tinción de Nissl cerca de la superficie de las secciones gruesas que la que se muestra en los informes anteriormente, incluso cuando se utilizan secciones mucho más delgadas 19, 20, 21. La variante de protocolo que incluye la etapa de congelación produce resultados aceptables para el análisis de la morfología de árbol dendrítico. Sin embargo, la tinción de fondo es mucho más oscuro que en el tejido fresco, que es más notable cuando la formación de imágenes más profundamente en la rebanada por lo que es más difícil de visualizar y cuantificar espinas dendríticas (Figura 2 C). Se intentó el colorante de contraste cresil violeta en las secciones de cerebros que habían sido congelados, y esto produjo una bruma fondo púrpura oscuro uniforme-que hacía extremadamente difícil de visualizar y cuantificar espinas en la parte inferior de la sección (datos no mostrados). Otra variante de protocolo sin éxito que se evaluó incluyen el bloqueo de los cerebros de ratón antes de Golgi-Cox impregnación. Esto resultó en la tinción de los objetos celulares que pueden haber sido glía, pero no mancha cualquier tipo de neurona (datos no mostrados).
Hay dos pasos críticos en este protocolo que se debe seguir para obtener resultados exitosos. (1) Es crítico para verificar el tiempo de secado de secciones dentro de cada laboratorio, ya que esta depende de la temperatura y la humedad altamente. Si el tiempo de secado es demasiado corto, las secciones se caen de las diapositivas durante el proceso de deshidratación; si el tiempo de secado es demasiado largo, las secciones se agrietan. Sería ventajoso para verificar el tiempo de secado en un conjunto de cerebros "prueba" justo antes de preformación un estudio de investigación, ya que esto puede variar según la temporada, incluso con el mismo laboratorio. (2) Todos exceso de agar se debe quitar de la sección y portaobjetos de microscopio antes de las etapas de deshidratación. Si esto no se hace, el agar se deformará y puede tirar de la sección fuera de la diapositiva.
Otro factor importante para el histológicoal análisis de muestras biológicas es la contracción del tejido. Se encontró que después de la elaboración, el montaje, la deshidratación y montaje de las secciones del cerebro usando el protocolo principal Golgi-Cox que el espesor sección final se redujo en aproximadamente la mitad del valor original del corte (Figura 4). Tenga en cuenta también que las secciones procesadas utilizando la variante de protocolo que incluye la etapa de congelación fueron significativamente más gruesas que las secciones frescas que se procesaron a través del protocolo principal (Figura 4). Esto fue interesante e inesperado porque ambos protocolos involucrados los mismos Crioprotección y procesamiento de los pasos, y sólo difieren por la congelación real de cerebros. Por lo tanto, es fundamental para tener en cuenta las posibles diferencias en los protocolos cuando se comparan datos de morfología de las neuronas generadas mediante la tinción de Golgi-Cox de diferentes estudios o de diferentes laboratorios. Aunque no hemos podido encontrar datos para el espesor de la sección final en la literatura, sería beneficiosopara los investigadores para informar de esta de datos y / o correcto para la contracción del tejido cuando se informa medidas de la morfología neuronal. También hay que señalar que, aunque el espesor final de> 200 m para las secciones cortadas a 500 m es mayor que la distancia de trabajo de la mayoría de los objetivos de gran aumento, esto sigue siendo así dentro de la distancia de trabajo del objetivo 30X utilizado en nuestro laboratorio. Desde dendritas y espinas son claramente visibles en la parte inferior de estas rebanadas utilizando el protocolo principal Golgi-Cox, puede ser posible visualizar las neuronas contenidas dentro de las secciones cortadas a un espesor mucho mayor hasta e incluyendo el rango de 1 mm.
Aunque este protocolo ofrece un número de ventajas incluyendo la capacidad de rastrear cenadores dendríticas largas dentro de las secciones individuales, la opción de retrasar el corte en lonchas y el procesamiento de los cerebros impregnados, y la opción de la contratinción con violeta de cresilo para identificar mejor las estructuras cerebrales, hay algunas desventajas que deberíaser considerado. El período de incubación de 25 días puede ser considerado demasiado largo para algunos investigadores. La capacidad de imagen profundamente en secciones montadas depende del acceso a un objetivo de inmersión de alta resolución con una distancia de trabajo, que es relativamente caro. Además, la capacidad de visualizar estructuras finas con alta resolución disminuye a medida que uno imágenes cerca de la parte inferior de la rebanada montado. La implementación de este protocolo depende por tanto de las propiedades morfológicas de las neuronas y la región del cerebro que ser estudiado, y los equipos disponibles para el investigador. Se recomienda el uso de muestras de "prueba" para optimizar las variables de protocolo antes de ejecutar un estudio de investigación, tales como el tiempo de impregnación de Golgi-Cox para el tamaño del cerebro y la región de interés, y el plano y el espesor de seccionamiento para el árbol dendrítico a ser visualizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del descubrimiento de CDCB de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC), un Fondo Líderes concesión de infraestructuras de investigación John R. Evans a CDCB desde Canadá Fundación para la Innovación (CFI proyecto número 30381), y por Descubrimiento de una subvención a MNJ de CRSNG. ELL fue apoyado por una beca de Graduados de Ontario y por una beca de la OVC de la Facultad de Veterinaria de Ontario de la Universidad de Guelph. CDS con el apoyo de una Ayudantía de Investigación de Pregrado Estudiantes de CRSNG. ALM fue apoyado por una beca de Alexander Graham Bell de CRSNG y por una beca de la OVC de la Facultad de Veterinaria de Ontario de la Universidad de Guelph.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | Also known as 2-methylbutane; hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6-well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA), 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| 3D motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4X microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30X microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60X microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
