Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging nervceller inom Tjocka hjärnsnitt Använda Golgi-Cox Method

Published: April 18, 2017 doi: 10.3791/55358

Summary

Vi presenterar ett protokoll för användning av Golgi-Cox färgningsmetoden i tjocka hjärnsektioner, för att visualisera neuroner med långa dendritiska träd som finns i enskilda vävnadsprover. Två varianter av detta protokoll presenteras också som innebär kresylviolett motfärgning och frysning av obearbetade hjärnor för långtidslagring.

Abstract

Golgi-Cox metod för neuron färgning har varit anställd i mer än två hundra år för att främja vår förståelse av neuron morfologi inom histologiska hjärnprover. Medan det är att föredra ur ett praktiskt perspektiv att förbereda hjärnsektioner vid den största tjockleken möjligt, för att öka sannolikheten för att identifiera färgade neuroner som fullständigt finns inom enskilda sektionerna, är begränsad ur ett tekniskt perspektiv av arbetsavståndet av hög detta tillvägagångssätt -magnification mikroskop mål. Vi rapporterar här ett protokoll för att färga neuroner med användning Golgi-Cox metoden i mus hjärnsektioner som skärs vid 500 | im tjocklek, och att visualisera nervceller genom hela djupet av dessa sektioner med användning av en upprätt mikroskop utrustat med en högupplöst 30X 1,05 NA silikon oljeimmersionsobjektiv som har en 800 um arbetsavstånd. Vi rapporterar också två användbara varianter av detta protokoll som kan användas för att Motfärga ytan avmonterade hjärnsektioner med kresylviolett Nissl fläck, eller att frysa hela hjärnan för långsiktig lagring före snittning och slutlig bearbetning. Huvudprotokoll och dess två varianter producerar färgade tjocka hjärnsektioner, hela vilka fullständiga neuron dendritiska träd och Dendrite ryggar kan tillförlitligt visualiseras och kvantifieras.

Introduction

Visualiseringen av enskilda nervceller i vävnadsprover möjliggör in situ analys av neuron morfologiska egenskaper, som avsevärt har avancerat vår förståelse av hjärnan och hur den kan påverkas av endogena sjukdom eller exogena miljöfaktorer. Golgi-Cox färgningsmetoden är ett kostnadseffektivt, relativt enkla medel för färgning av ett slumpmässigt urval av neuroner i hjärnan. Utvecklades först av Golgi 1 och modifierats av Cox 2 på 1800-talet, har forskare ytterligare förfinat denna teknik under åren för att producera klara, väl-färgade neuroner som kan användas för att visualisera och kvantifiera både dendritiska träd morfologi och ryggrad densitet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

En viktig teknisk vederlag för visualisering av färgade neuroner inom hjärnsektioner är den maximala skivtjockleken, som är begränsad av arbetsavståndet av tillgängliga hög förstoring mål / högupplösta mikroskop. Gemensamma mål olje nedsänkning i 60 - 100X range ger utmärkt upplösning, men begränsas av sin arbetstid avstånd som normalt inte är större än 200 nm. Hjärnsektioner skurna vid 200 | j, m intervall vara tillräcklig för att visualisera vissa neurontyper som kan förekomma bland snittjockleken, exempelvis pyramidala nervceller i grunda skikten av hjärnbarken 10, 11, 12, pyramidala neuroner i CA1-regionen av hippocampus 13, 14, och granulceller i gyrus dentatus i hippocampus 15. Nervceller med relativt längredendritiska träd, såsom pyramidala neuroner inom djupa lager av hjärnbarken att för mus kan sträcka sig mer än 800 ^ m från cellkroppen 16, ger en större utmaning eftersom hjärnor skulle behöva sektionerad på en perfekt vinkel för att innehålla hela dendrit trädet inom 200 | im skivor. Detta kanske inte ens vara möjlig om en dendrit eller någon av dess grenar sträcker sig i rostralt eller caudal riktning. Även om det är möjligt att ta itu med denna begränsning genom att spåra en neuron över flera angränsande hjärnsektioner, introducerar denna metod en stor teknisk utmaning att anpassa avsnitten noggrant för att spåra 17. Ett mer praktiskt tillvägagångssätt skulle vara att visualisera hela neuroner som finns i hjärnan sektioner som skärs vid en större tjocklek.

Vi rapporterar här en teknik för att färga nervceller inom 400-500 um tjockt hjärnan sektioner av möss med användning av Golgi-Cox-metoden, och att visualisera sin morphology med användning av en hög upplösning silikonolja-immersionsobjektiv som har en 800 um arbetsavstånd. Golgi-Cox impregnering och bearbetning protokoll som vi beskriver är modifierad från en av de mest citerade moderna protokoll i litteraturen 6. Vårt tillvägagångssätt med tjocka hjärnsektioner ger fördelen av att öka sannolikheten för att identifiera neuroner av någon typ som är helt innesluten i den sektionen. I tillägg till den huvudsakliga protokollet, även vi närvarande två varianter som ger unika fördelar: (1) Golgi-Cox-färgning med kresylviolett motfärg på ytan av monterade sektioner, för att definiera gränserna för hjärnregioner och för att identifiera skikten av hjärnbarken, och (2) Golgi-Cox färgning med ett mellanliggande frysningssteg för långtidslagring av impregnerade hela hjärnorna före snittning och slutlig bearbetning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vuxen hona CD1-stammen möss användes i denna studie. Liknande färgning kan åstadkommas med hjälp av båda könen vid olika åldrar. Försöksdjur var omhändertagna enligt de principer och riktlinjer för den kanadensiska rådet om Animal Care och experimentella protokoll godkändes av University of Guelph Animal Care kommittén.

1. Golgi-Cox Färgning

  1. Golgi-Cox Impregnering av Brains
    1. Göra Golgi-Cox lösning av 1% (vikt / volym) kaliumdikromat, 0,8% (vikt / volym) kaliumkromat och 1% (vikt / volym) kvicksilverklorid genom upplösning av kaliumdikromat och kaliumkromat i vatten av hög kvalitet separat . Blanda lösningarna, tillsätt kvicksilverklorid och filtrera den slutliga lösningen med användning av klass 1 filterpapper. Förvara lösningen i mörker i upp till en månad.
    2. Söva musen med 5% isofluran.
    3. Euthanize musen genom halshuggning och snabbt ta bort hjärnan.
    4. Placera hjärnan in i en 20 mL glass skintillationsflaska innehållande 17 ml Golgi-Cox-lösning och inkubera i mörker vid RT i 25 d.
    5. Cryoprotect hjärnan genom att placera den i en 50 ml koniskt rör innehållande 40 ml sackaros kryoskyddsmedel (30% (vikt / volym) sackaros i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4) i mörker vid 4 ° C under 24 h.
      OBS: Följande valfria tre steg kan användas som ett alternativ till den huvudsakliga protokollet, för frysning av hjärnan i detta skede för långtidslagring.
    6. Frysa hela hjärnan genom att sänka ned den i 200 ml isopentan som har förkylts på torris.
    7. Placera den frysta hjärnan in i ett 50 ml koniskt rör och lagra i mörker vid -80 ° C.
    8. När de är färdiga att gå vidare, tina hjärnan genom att placera den i en 50 ml koniskt rör innehållande 40 ml sackaros kryoskyddande i mörker vid 4 ° C under 24 h.
  2. Brain Sektione
    1. Ta bort hjärnan från sackaros och blockk det för sektione genom att skära av lillhjärnan med användning av ett rakblad och lämnar en platt kant vid den återstående kaudala änden av hjärnan.
    2. Värme agar (3% (vikt / volym) i vatten) tills det har smält och låt svalna tills det är något över dess smältpunkt.
    3. Placera hjärnan i en liten engångs väga skålen med sin svansslutsidan nedåt och tillsätt en tillräcklig mängd smält agar för att täcka hjärnan.
    4. När ägarn har stelnat, trimma överskotts agar lämnar ungefär till 2 - 4 mm som omger hjärnan och limma hjärnan till det stadium av en vibratom med sin kaudala änden sidan nedåt med användning av en liten mängd av etyl-cyanoakrylatlim.
    5. Fylla scenområdet av vibratome med en tillräcklig mängd sackaros kryoskyddsmedel för att täcka hjärnan, och avsnitt hjärnan vid en skivtjocklek av 400-500 ^ m (beroende på hjärnregion som skall undersökas) med användning av en vibrationsfrekvens på 86 Hz och en bladmatningshastighet av 0,125 mm / s.
    6. Med hjälp av en liten pensel, Plats hjärnsektioner till en brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta innehållande kommersiellt tillgängliga mesh-botten skär och förfylld med 10 ml 6% (vikt / volym) sackaros i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4.
    7. Inkubera avsnitt i mörker vid 4 ° CO / N.
  3. Utveckla hjärnsektioner
    1. Med användning av de mesh-botten skär, överföra hjärnsektioner till en ny brunn innehållande 5 ml av 2% (vikt / volym) paraformaldehyd (PBD) i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4. Inkubera på en rocker rör sig med låg hastighet i mörker vid RT i 15 min.
    2. Tvätta sektioner två gånger genom att överföra dem till nya brunnar innehållande 5 ml vatten. Tvätta på en rocker rör sig med en måttlig hastighet i mörker vid RT i 5 min.
    3. Överföringssektioner i en ny brunn innehållande 5 ml 2,7% (volym / volym) ammoniumhydroxid. Inkubera på en rocker rör sig med låg hastighet i mörker vid RT i 15 min.
    4. Tvätta sektioner två gånger genom att överföra dem till nya brunnar innehållande 5 ml vatten. Tvätta ona rocker rör sig med en måttlig hastighet i mörker vid RT i 5 min.
    5. Överföringssektioner i en ny brunn innehållande 5 ml Fixative A (se Material tabell) som har spätts i vatten 10x från dess ursprungliga köpt koncentration. Inkubera på en rocker rör sig med låg hastighet i mörker vid RT i 25 min.
    6. Tvätta sektioner två gånger genom att överföra dem till nya brunnar innehållande 5 ml vatten. Tvätta på en rocker rör sig med en måttlig hastighet i mörker vid RT i 5 min.
  4. Montering hjärnsektioner
    1. Med hjälp av en liten pensel, montera sektionerna på objektglas. Ta bort överflödigt vatten och agar med en pincett och en liten vävnad. Se till att all agar avlägsnas innan man fortsätter med uttorkning.
    2. Tillåta sektionerna lufttorka vid RT under cirka 45 min (400 | j, m sektioner) eller 90 min (500 | j, m sektioner).
      OBS: Tidpunkten och rätt nivå av torrhet är kritisk, och kan behöva bestämmas i varjelaboratorium beroende på omgivningens temperatur och fuktighetsnivå. Alltför kort torktid leder till sektioner faller bort av diabilder under efterföljande uttorkning steg och alltför lång torktid leder till sektioner sprickbildning. Avsnitten kommer fortfarande verkar vara blank på lämplig nivå av torrhet.
    3. Fläck sektioner med kresylviolett genom att placera glider in Coplin färgningskärl såsom anges.
      OBS: Detta valfria steg kan användas för sektioner som aldrig hade varit fryst, för att färga neuronala kärnor med kresylviolett. Vi har funnit att rensa och återfuktande avsnitt före inkubation i kresylviolett leder till ännu färgning och låg bakgrund över sektioner.
      1. Placera i clearing agent för 5 min. Upprepa en gång.
      2. Placera i 100% etanol under 5 min. Upprepa en gång.
      3. Placera i 95% etanol i vatten, därefter 75% etanol i vatten, och därefter 50% etanol i vatten för 2 min vardera.
      4. Placera i vatten under 5 min.
      5. Placera i 0,5% (vikt / volym) cresyl violett i vatten under 7 min.
      6. Placera i vatten under 2 min. Upprepa en gång.
    4. Dehydrera sektioner genom att placera glider in Coplin färgningskärl såsom anges.
      1. Placera i 50% etanol i vatten, därefter 75% etanol i vatten, och därefter 95% etanol i vatten för 2 min vardera.
      2. Placera i 100% etanol under 5 min. Upprepa en gång.
      3. Placera i clearing agent för 5 min. Upprepa en gång.
        OBS: Dessa dehydratiserings- och clearingtider är tillräckliga för att behandla mushjärnor som beskrivs i detta manuskript. Vi har dock observerat för andra arter, inklusive råtta och cowbird, att den slutliga clearing steg kan behöva förlängas upp till 15 min totalt.
    5. Täckglas sektioner med hjälp av en vattenfri monteringsmedium.
    6. Tillåta objektglasen torka horisontellt i mörker vid RT under minst 5 d.

2. Imaging Stained Neuroner inom Tjocka hjärnsektioner

  1. Fånga bildstaplar
  2. Slå på mikroskop glödlampan, kamera, och scenen controller.
  3. Öppna mikroskop programvara (t.ex. Neurolucida).
  4. Placera en bild på mikroskop scenen.
  5. Fånga en 2D bred-view bild av hjärnan sektionen med användning av en låg förstoring mål såsom 1,25X 0,4 NA PlanAPO eller 4X 0,16 NA
    1. Fokus bild och justera kamerainställningarna, inklusive exponeringstiden och vitbalans.
    2. Skapa en referenspunkt genom att vänsterklicka någonstans på sträckan
    3. Ta bilden genom att välja "skaffa en bild" i bilden förvärvet fönstret.
  6. Fånga mitten upplösta bild staplar av det område som innehåller de nervceller (er) av intresse, med användning av ett 10X 0,3 NA UPlan FL N mål.
    1. Fokusera bilden och justera kamerainställningarna, inklusive exponering och vitbalans.
    2. Ställ in övre och nedre gränser för bildstapel genom att fokusera på toppen av sektionen and välja "set" bredvid "top of stack" i bildförvärvs fönstret och sedan fokusera på botten av sektionen och välja "set" bredvid "botten stack" i bilden förvärvet fönstret.
    3. Ställ in steg avståndet till 5 pm genom att ange "5 pm" bredvid "avståndet mellan bilderna" i bilden förvärvet fönstret.
    4. Ta bilden stacken genom att välja "förvärva bildstapel" i bildförvärvsfönstret.
    5. Upprepa ovanstående steg för att fånga hela området av intresse, att se till att alla bild högar överlappar med minst 10% i X- och Y-axlarna.
  7. Fånga högupplösta bilder för staplar av det område som innehåller neuron av intresse, med användning av ett 30X 1,05 NA silikonolja-immersionsobjektiv.
    1. Applicera 3 - 4 droppar silikonimmersionsolja till bilden och placera målet över bilden, se till att få kontakt mellan målet och oil.
    2. Fokusera bilden och justera kamerainställningarna, inklusive exponering och vitbalans.
    3. Ställ in övre och nedre gränser för bildstapel genom att fokusera på toppen av sektionen och välja "set" bredvid "top of stack" i bildförvärvs fönstret och sedan fokusera på botten av sektionen och välja "set" bredvid "botten stack" i bilden förvärvet fönstret.
    4. Ställ in steg avståndet till 1 pm genom att ange "1 pm" bredvid "avståndet mellan bilderna" i bilden förvärvet fönstret.
    5. Ta bilden stacken genom att välja "förvärva bildstapel" i bildförvärvsfönstret.
    6. Upprepa ovanstående steg för att fånga hela området av intresse, att se till att alla bild högar överlappar med minst 10% i X- och Y-axlarna.
  8. Spara datafilen och spara alla bildfiler i TIFF-format för extern behandling.
</ Li>
  • Skapa Z-projektion bilder och bildmontage
    1. Skapa Z-projektionsbilder i ImageJ
      1. Open ImageJ programvara som har Bio-Formats plugin installerad.
      2. Välj "Plugins" -> "Bio-format" -> "Bio-format Importör".
      3. Markera bilden stack fil som ska öppnas.
      4. När filen öppnas, ändra formatet till RGB genom att välja "Bild" -> "Typ" -> "RGB Color".
      5. Skapa Z-projektion genom att välja "Bild" -> "Stacks" -> "Z Project ...".
      6. Spara tvådimensionell Z-projektion bilden som en TIFF-fil.
    2. Skapa en tvådimensionell bild montage av hela området av intresse.
      1. Öppna programvaran (t.ex. Adobe Photoshop).
      2. Välj "File" -> "Automatisera" -> "Photomerge".
      3. Välj "Browse" och sedan lägga till alla images filer som ska slås samman.
      4. Se till att "Blend Images Together" är valt och välj sedan "OK".
      5. Spara den resulterande montage bilden av hela området av intresse som en TIFF-fil.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Denna Golgi-Cox färgningsprotokollet och dess två beskrivna valfria varianter kan användas för att visualisera enskilda nervceller inom 400 - 500 | im tjocka hjärnsektioner. Representativa bild montage av två-dimensionella Z-projektioner tagna med användning av ett 10X objektiv och 5 ^ m steg i Z-axeln visas i figur 1: A1 - C1 för ett stort område av koronala hjärnsektioner som innefattar den främre cingulum cortex område 1 och sekundära motoriska cortex 18. Sektioner skars vid 500 um. Notera att protokollvariant som inkluderar kresylviolett färgning tillåter för identifiering av kortikala cellskikt, exempelvis såsom ses för kortikal Layer 1 längs pial ytan av sektionerna i fig 1B1. Noterar också den liknande utseendet hos färgade snitt vid användning av huvudprotokoll som använder all-färsk vävnad (figur 1A1) och protokollet variant i vilkenhjärnor fryses halvvägs för långtidslagring (Figur 1C1).

    Användningen av en högupplöst 30X 1,05 NA silikonolja-immersionsobjektiv möjliggör infångandet av bildstaplar som är större i X- och Y-axlarna än de som tagits med en högre förstoring mål, vilket kräver färre totala stackar till bilden en given intresseområde. Särskilt med sikte som används har en 800 um arbetsavstånd, vilket är mer än tillräckligt för att bild tjocka hjärnsektioner. Bild montage av två-dimensionella Z-projektioner tagits med detta mål och 1 ^ m steg i Z-axeln visas i figur 1 (A2-C2) i den främre cingulum cortex området 1, och tvådimensionella Z-projektioner av tracings för indikerade neuroner visas i figur 1: A3 - C3. Notera högupplösta bilder som möjliggör visualisering av nervceller och deras dendriter genomdjupet av varje bildstapel. Protokollet variant med hjälp av kresylviolett lägger lila Nissl färgning över skiva, men med de parametrar som används denna cellulära färgning endast observerats nära den övre delen av segmentet. Protokollvariant som inkluderar det valfria frysningssteget producerar neuron färgning som liknar huvud protokoll, men det införs också en diffus bakgrundsfärgning som skapar uppkomsten av Ijusdiffusion genom brytande ljus under ytan av skivan. Denna grumling är mest uppenbar vid avbildning djupare in i skiva och framgår i Z-projektionsbilden i figur 1C2. Bilder som tagits med hjälp av 30X mål kan också användas för att visualisera och kvantifiera fina neuronala strukturer såsom Dendritutskotten. Enkelplans bilder visas i figur 2 för dendriter som färgats med huvudprotokoll och dess två varianter, med en bild tagen nära toppen av sektionen och en bild tagen nära botten av sektionen. Notera PURPLe kresylviolett färgning av Nissl-substans inom enskilda neuronala kärnor nära toppen av sektionen i figur 2B1, som ses som diffus purpurfärgad bakgrund / spritt ljus nära botten av sektionen i figur 2B2. Observera också att även om dendriter och deras ryggar är väl-färgas med användning av protokollet med frysningssteget, den tidigare nämnda bakgrunden haze som är uppenbart nära bottnen av den del i fig 2C2 gör det svårare att visualisera ryggar genom att begränsa kontrasten mellan dem och den intilliggande bakgrund. Högre förstoring mål kan också användas för att karaktärisera dendritiska ryggraden morfologi, såsom visa i figur 2: A3 - C3 där ryggar av olika typer är klart synliga i snitt färgade med användning av var och en av de tre protokollen. Här var en 60X 1,42 NA oljeimmersionsobjektiv används. Vi använde också denna färgningsprotokollet och dess varianter att färga nervceller i hippocAmpus av sektioner skärs vid 400 um. Såsom visas i fig 3, kan neuron dendriter och ryggar visualiseras både mot de mer-mediala områden av sektionen (t.ex. hippocampus dentate gyrus-regionen i figur 3: A2 - C2) och de mer-sidoområdena av sektionen (t.ex. , hippocampus CA3-regionen i figur 3: A3 - C3). Det bör också noteras att varje färgningstillstånd gav liknande resultat, fördelar och nackdelar som de som visas i figurerna 1 och 2 för hjärnbarken.

    Den slutliga tjockleken av bearbetade hjärnsektioner beror på det specifika protokollet variant användes. Såsom visas i fig 4A för sektioner innehållande hjärnbarken och skärs vid 500 | im, det fanns en signifikant effekt av protokollvariant på den uppmätta tjockleken av bearbetade och monterade / täckglas sektioner (envägs ANOVA, p <0,0001). Här, tjockleken av sektioner göras med hjälp av huvud protokollet (251,0 ± 12,5 (SEM) um (n = 6)) och protokollvariant involverar kresylviolett (219,3 ± 8,5 ^ m (n = 6)) var mindre än tjockleken av sektioner gjort med användning av protokollet varianten involverar fryssteget (340,6 ± 17,1 ^ m (n = 6)) (Bonferroni post hoc-test, varje jämförelse p ≤ 0,0006). Mycket liknande effekter av protokoll variant observerades för sektioner som innehåller hippocampus och skärs vid 400 | j, m (Figur 4B, envägs ANOVA, p <0,0001). Här, tjockleken av sektioner göras med hjälp av huvud protokollet (217,6 ± 19,2 ^ m (n = 6)) och protokollvariant involverar kresylviolett (198,0 ± 14,8 ^ m (n = 6)) var mindre än tjockleken av sektioner framställd med användning av protokollvariant involverar fryssteget (313,5 ± 8,4 ^ m (n = 6)) (Bonferroni post hoc-test, varje jämförelse p ≤ 0,001).


    Figur 1. Exempel Mikrofotografier av Stained Neuroner i främre cingulum Område 1. A1 - C1, slås samman Z-projektioner av bildstaplar förvärvade med användning av en 10X objektiv visas för en hemisfär av hjärnbarken som inkluderar den främre cingulum cortex område 1 och sekundär motoriska cortex vid approximativt Bregma 1,18 mm 18. Dessa sektioner skars vid 500 um. Mikrofotografier visas med huvud all-färskt protokoll (A1), för den färska protokollvarianten med kresylviolett färgning (B1) och för det protokoll variant där hjärnor fryses efter Golgi-Cox impregnering (C1). Skalstrecken är 500 um. Högre upplösning fusione Z-projektionsbildstaplar förvärvade med användning av en 30X silikonolja-immersionsobjektiv visas i A2 - C2 för varje område indikeras av den röda square i mikrofotografierna i A1 - C1. Skalstrecken är 100 um. 2D Z-projektioner av neuron tracings visas i A3 - C3 för neuronema som indikeras av den röda pilen i mikrofotografierna i A2 - C2. Diametern av alla dendriter var inställda på 2 um för att underlätta illustrationen. Skalstrecken är 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2. Exempel Mikrofotografier av Dendritutskotten för Stained Neuroner. Mikrofotografier tagna med användning av ett 30X silikonolja-immersionsobjektiv är visade i ett fokalplan för neuron dendriter belägna inom skiktet 1 av den främre cingulatecortexen område 1. Dessa sektioner skars vid 500 um. Neuroner färgades med användning av f resh protokoll (A1, A2), protokollvarianten med kresylviolett färgning (B1, B2) och för det protokoll variant där hjärnor fryses efter Golgi-Cox impregnering (C1, C2). Mikrofotografier togs nära toppen av den del (A1 - C1) och nära botten av skivan intill objektglas (A2 - C2). Skala barer för A1-2, B1-2 och C1-2 är 50 nm. Mikrofotografier visas i A3, B3 och C3 för en fokalplan användning av en högre-förstoring 60X oljeimmersionsobjektiv, för att identifiera olika ryggradstyper. Skal barer för A3, B3 och C3 är 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    55.358 / 55358fig3.jpg"/>
    Figur 3. Exempel Mikrofotografier av Stained Neuroner i Hippocampus. Mikrofotografier tagna med användning av en 4X objektiv visas i ett fokalplan för neuroner som färgats med användning av färskt protokoll (A1), protokollvarianten med kresylviolett färgning (B1) och för det protokoll variant där hjärnor fryses efter Golgi-Cox impregnering (C1 ). Sektioner skars vid 400 um och är visade vid approximativt Bregma -2,18 mm 18. Skala barer är 500 nm för A1 - C1. Högre förstoring mikrofotografier fångades med användning av en 30X silikonolja-immersionsobjektiv och visas i ett fokalplan för neuron dendriter ligger inom dentate gyrus-regionen av hippocampus (A2 - C2) och CA3-regionen av hippocampus (A3 - C3). Skal barer är 50 um för A2 - C2och A3 - C3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4. Tjocklek på Monterade Sektioner. Den uppmätta tjockleken av monterade sektioner visas i A för sektioner innehållande hjärnbarken vid approximativt Bregma 1,18 mm 18 och skärs vid 500 | im tjocklek, och i B för sektioner som innehåller hippocampus vid approximativt Bregma -2,18 mm 18 och skärs vid 400 | j, m tjocklek. Uppmätta sektioner färgades med användning av antingen färskt protokoll, protokollvarianten med kresylviolett färgning, eller det protokoll variant där hjärnor fryses efter Golgi-Cox impregnering. För båda hjärnregioner, fanns en signifikant effekt av behandling protokoll(Envägs ANOVA, p <0,0001), där sektioner från hjärnor som var frysta delvis genom det protokoll som var betydligt tjockare än de som inte frystes (Bonferroni post hoc-test, allt p <0,001). Data visas som medelvärde ± SEM för sex sektioner i varje grupp, och datauppsättningar med olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi beskriver här en Golgi-Cox färgningsprotokollet tillsammans med två användbara varianter för att visualisera nervceller i tjocka hjärnan sektioner. Såsom visas i de representativa resultat, användning av en högupplösande objektiv som har en lång 800 um arbetsavstånd möjliggör tillförlitlig visualisering av hela neuroner i hela djupet av hjärnsektioner skurna vid 500 um. Denna studie av relativt tjocka hjärnsektioner ökar sannolikheten att färgade neuroner av någon typ är helt innesluten i skiva, vilket är särskilt viktigt för pyramidala neuroner med långa och komplicerade apikala Dendrite träd. Till exempel, i koronala sektioner av hjärna från gnagare, ger detta för införande av neuroner som sträcker sig längre i den rostrala eller kaudala riktningen och ökar också utrymme för misstag när blockering hjärnan hållet vid sektionesteget. Även om vi beskriver hjärnan sektionering i coronal planet endast kan detta protokoll anpassas för sektionering i andra planes som krävs för att fullständigt innehåller märkta neuroner inom enskilda sektionerna. Planet för sektione som används kommer att bero på de morfologiska egenskaperna hos neuronpopulation som undersöks. Dendritutskotten kan visualiseras och kvantifieras med användning av detta protokoll, även om högre förstorings mål krävs för att bedöma ryggraden typ / morfologi såsom 60X oljeimmersionsobjektiv användes för att producera mikrofotografierna i fig 2: A3 - C3. Detta kan användas i tjocka sektioner men är begränsad till toppen av den del inom arbetsavståndet av målet. Detta protokoll kan också anpassas för användning i olika arter av liknande hjärnstorlek, som vi har funnit att en vanlig 25-dagars impregnering period fullt färgar nervceller hela mus, råtta och cowbird hjärnan utan att leda till överskott av icke-specifik färgning eller bakgrunds som kan uppstå med impregneringsperioder utanför en månad. Kortare impregneringsperioder kan vara tillräckliga för arter med sMaller hjärnor eller i dissekerade prover av hjärnor från ovannämnda arter, som kan optimeras av den enskilde utredaren.

    Av de tre varianter som presenteras för denna färgningsprotokollet, huvud protokoll med färska hjärnprover som inte motfärgas ger de bästa resultaten. Mikrofotografier i figur 2 A visar att denna huvud protokoll producerar väl märkta dendriter och ryggar som är väl synliga nära toppen och botten av monterade tjocka sektioner. Sätta kresylviolett motfärg har fördelen av att underlätta definitionen av hjärnregioner och cerebrala cortexskikt, men också lagt till en diffus purpurfärgad bakgrund när visualisera djupt in tjocka sektioner. Emellertid, eftersom detta protokoll variant endast färgar ytan av monterade tjocka sektioner med kresylviolett, dendriter och deras ryggar var klart synliga nära bottnen av sektioner (fig 2 B). Det verkar också produce en tydligare mönster av Nissl-färgning nära ytan av tjocka sektioner än den som visas i tidigare rapporter, även vid användning av mycket tunnare sektionerna 19, 20, 21. Protokoll variant som innefattar frysningssteget ger acceptabla resultat för analys av dendritiska träd morfologi. Emellertid är bakgrundsfärgning mycket mörkare än i färsk vävnad, som är mest märkbar när avbildning djupare in i utloppsmunstyckes vilket gör det svårare att visualisera och kvantifiera Dendrite ryggar (figur 2 C). Vi försökte kresylviolett motfärg i sektioner från hjärnor som hade frysta, och detta gav en jämn mörkare lila bakgrund haze som gjorde det mycket svårt att visualisera och kvantifiera ryggar nära botten av sektionen (data visas ej). Annan misslyckat protokollvariant som bedömdes inkluderade frysning mushjärnor före Golgi-Cox impregnation. Detta resulterade i färgning av cellulära föremål som kan ha varit glia, men färgade inte någon typ av neuron (data visas ej).

    Det finns två viktiga steg i detta protokoll som måste följas för att få goda resultat. (1) Det är kritiskt att kontrollera torktiden av sektioner inom varje laboratorium, eftersom detta är mycket beroende av temperatur och luftfuktighet. Om torktiden är för kort, kommer delar falla bilderna under uttorkning process; Om torktiden är för lång, kommer sektioner spricka. Det skulle vara fördelaktigt att kontrollera torktiden i en uppsättning av "test" hjärnor strax före förformning en forskningsstudie, eftersom detta kan variera efter säsong även med samma laboratorium. (2) Allt överskott agar måste avlägsnas från sektionen och objektglas före uttorkning stegen. Om detta inte görs kommer agar deformeras och kan dra sektionen bort från bilden.

    En annan viktig faktor för histologiskaal analys av biologiska prover är vävnadskrympning. Vi fann att efter bearbetning, montering, dehydratisering och täckglas hjärnsektioner med huvud Golgi-Cox-protokoll att den slutliga snittjocklek reducerades med ungefär hälften av den ursprungliga skära värdet (Figur 4). Noterar också att sektionerna bearbetas med användning av protokollet variant som inkluderade frysningssteget var signifikant tjockare än de färska sektioner som bearbetades via huvud protokollet (Figur 4). Detta var både intressant och oväntat eftersom båda protokollen inblandade samma kryoskydd och processteg, och endast skilde av den faktiska frysning av hjärnan. Det är därför viktigt att ta hänsyn till eventuella skillnader i protokoll när man jämför neuron morfologi data som genererats med hjälp av Golgi-Cox färgning från olika studier eller från olika laboratorier. Även om vi inte kunde hitta uppgifter för slut snittjocklek i litteraturen, skulle det vara fördelaktigtför utredarna att rapportera dessa data och / eller korrigera för vävnads krympning vid rapportering åtgärder neuron morfologi. Det bör också noteras att även om den slutliga tjockleken av> 200 nm för sektioner skurna vid 500 nm är större än arbetsavstånd från de flesta hög förstoring mål, är detta fortfarande väl inom arbetsavstånd 30X objektiv som används i vårt laboratorium. Eftersom dendriter och ryggar är klart synliga nära botten av dessa skivor med användning av huvud Golgi-Cox-protokollet, kan det vara möjligt att visualisera neuroner som finns i sektioner skurna vid en mycket större tjocklek upp till och med den 1 mm intervall.

    Även om detta protokoll erbjuder ett antal fördelar inklusive möjligheten att spåra långa dendritiska hållare inom enskilda sektionerna, till alternativet fördröja skivning och bearbetning av impregnerade hjärnor, och möjligheten att motfärgning med kresylviolett för att bättre identifiera hjärnstrukturer, finns det några nackdelar som skallvägas. Den 25 dagar långa inkubationstiden kan vara för lång för vissa forskare. Förmågan att bilden djupt in monterade sektioner beror på tillgång till högupplösta immersionsobjektiv med en lång arbetsavstånd, vilket är relativt dyrt. Dessutom, förmågan att visualisera fina strukturer med hög upplösning minskar när ett bilder nära botten av den monterade skivan. Genomförandet av detta protokoll beror därför på de morfologiska egenskaperna hos nervceller och hjärnregion som ska studeras och tillgänglig utrustning för utredaren. Vi rekommenderar användning av "test" prover för att optimera protokollvariabler innan du kör en forskningsstudie, såsom Golgi-Cox impregneringstiden för storleken på hjärnan och området av intresse, och planet och tjockleken hos sektione för den dendritiska arbor till visualiseras.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Detta arbete stöddes av ett Discovery Grant till CDCB från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC), John R. Evans ledare fonden bidrag forskningsinfrastruktur till CDCB från Kanada Foundation for Innovation (CFI projektnummer 30381), och en Discovery Grant till NJM från NSERC. ELL stöddes av en Ontario Graduate Scholarship och en OVC stipendium från Ontario Veterinary College vid University of Guelph. CDS stöddes av en doktorand Research assistent från NSERC. ALM stöddes av en Alexander Graham Bell stipendium från NSERC och en OVC stipendium från Ontario Veterinary College vid University of Guelph.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    potassium dichromate Fisher Scientific P188-100 Hazardous
    potassium chromate Fisher Scientific P220-100 Hazardous
    mercuric chloride Fisher Scientific S25423 Hazardous
    Whatman grade 1 filter paper Fisher Scientific 1001-185
    isoflurane Pharmaceutical Partners of Canada CP0406V2
    20 mL scintillation vial Fisher Scientific 03-337-4
    sucrose Bioshop Canada SUC700.1
    sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S5011-500G
    sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9390-500G
    50 mL conical tube Fisher Scientific 12-565-271
    isopentane Fisher Scientific AC126470010 Also known as 2-methylbutane; hazardous
    agar Sigma Aldrich A1296-100G
    small weigh dish Fisher Scientific 02-202-100
    vibratome Leica VT1000 S
    6-well tissue culture plates Fisher Scientific 08-772-1b
    mesh bottom tissue culture inserts Fisher Scientific 07-200-214
    paraformadelhyde (PFA), 16% Electron Microscope Sciences 15710-S Hazardous
    ammonium hydroxide Fisher Scientific A669S-500 Hazardous
    Kodak Fixative A Sigma Aldrich P7542
    superfrost plus slides Fisher Scientific 12-550-15
    CitroSolv clearing agent Fisher Scientific 22-143-975
    anhydrous ethyl alcohol Commercial Alcohols N/A
    cresyl violet Sigma Aldrich C1791
    permount Fisher Scientific SP15-100
    upright microscope Olympus BX53 model
    colour camera, 12 bit MBF Biosciences DV-47d QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
    3D motorized microscope stage, controller and enoders MBF Biosciences N/A Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
    4X microscope objective Olympus 4x 0.16 N.A. UplanSApo
    10X microscope objective Olympus 10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
    30X microscope objective Olympus 30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
    60X microscope objective Olympus 60x 1.42 N.A. PlanAPO N
    silicone immersion oil Olympus Z-81114
    Neurolucida software MBF Biosciences Version 10
    ImageJ software U. S. National Institutes of Health Current version With the OME Bio-Formats plugin installed
    Photoshop software Adobe version CS6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
    2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
    3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
    4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
    5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
    6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
    7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
    8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
    9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
    10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
    11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
    12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
    13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
    14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
    15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
    16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
    17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
    18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
    19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
    20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
    21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

    Tags

    Neuroscience neuron morfologi histologi Golgi-Cox färgning cerebral cortex hippocampus dendrit ryggar pyramidal neuron
    Imaging nervceller inom Tjocka hjärnsnitt Använda Golgi-Cox Method
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Louth, E. L., Sutton, C. D.,More

    Louth, E. L., Sutton, C. D., Mendell, A. L., MacLusky, N. J., Bailey, C. D. C. Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (122), e55358, doi:10.3791/55358 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter