Summary
器官海马切片培养 (OHSC) 代表一个体外模型, 它能很好地模拟体内的情况。在这里, 我们描述一个 vibratome-based 改进的切片协议, 以获得高质量的切片, 用于评估新物质的神经保护潜能或肿瘤细胞的生物学行为。
Abstract
在器官海马切片培养 (OHSC) 中, 神经元和胶质细胞的形态和功能特征得到了很好的保存。该模型适用于处理不同的研究问题, 涉及神经保护、神经元电生理实验、神经元网络或肿瘤侵袭等研究。multisynaptic 回路中的海马结构和神经元活动在 OHSC 中很好保存, 尽管切片程序本身最初会损伤并导致胶质瘢痕的形成。瘢痕的形成可能改变了小分子的力学性质和扩散行为,等。切片允许在没有动物手术的情况下监测脑损伤后的时间依赖性过程, 并研究各种脑源性细胞类型的相互作用, 即在生理和病理上条件.这个模型的一个矛盾的方面是缺乏血流和免疫血细胞。在神经元损伤过程中, 从血液中迁移免疫细胞起着重要作用。当这些细胞在切片中丢失时, 就可以观察到文化中的内在过程, 而不受外界干扰。此外, 在 OHSC 中, 中外部环境的组成是精确控制的。这个方法的一个进一步好处是被牺牲的动物的数量比标准准备更低。几个 OHSC 可以获得从一个动物做同时研究与多个治疗在一个动物可能。由于这些原因, OHSC 很适合分析新的保护疗法在组织损伤或肿瘤侵袭过程中的作用。
这里介绍的协议描述了一种 OHSC 的制备方法, 它允许产生高重复性的、保存完好的切片, 可用于各种实验研究, 如神经保护或肿瘤侵袭研究。
Introduction
OHSC 是一个良好的体外模型, 研究神经元、星形胶质细胞和小鼠的生理和病理性质,1。对细胞外环境进行控制, 对各种刺激后的细胞学和形态学变化进行监测是很容易的。在准备2,3之后, 海马神经元的组织及其连接保存完好。在一些优势, OHSC 允许监测脑损伤和肿瘤侵袭没有动物手术。六至八 OHSC 可从单个啮齿动物的大脑中获得。因此, OHSC 有助于显著减少动物数量, 并允许在同一动物体内检测多种药物浓度、基因操纵或不同的损伤模型。在 slice-based 测定中, 可以精确控制实验条件。此外, 时间依赖性发展的病理条件, 如次生损害, 可以很容易地监测的延时成像。
在给定的协议中, 最初由 Stoppini et al.建立4, 描述了准备步骤, 并突出显示了选择适当切片的重要形态学标志。我们建议在后天准备7-9 大鼠或产后日4-5 只小鼠。在这些时期, OHSC 表现出对机械创伤的强大抵抗力和神经元回路重组的高电位。相比之下, 从胚胎或成年大鼠的准备工作迅速改变其结构, 并失去其器官形态学在种植期间, 因此更不适合研究长期的过程中的基础研究5,6,7,8,9,10,11. OHSC 生存率的另一个关键点是切片本身的厚度, 作为扩散, 因而养分供应是有限的12,13,14。
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Protocol
动物实验是按照欧洲共同体理事会 2010/63/欧共体欧洲议会指令批准的《关于在神经科学研究中使用动物的政策和政策》进行的。欧洲联盟理事会关于保护用于科学目的的动物的问题.
1. 准备仪器和培养基
- 准备 OHSC 使用以下工具集: 两个小剪刀, 两个弯曲的镊子, 一个镊子与罚款提示, 三刀片 (两个大小 11, 一个大小 15),三手术刀夹, 圆形滤纸 (直径:35 毫米), 琼脂, 一刀片, 一个未修改的巴斯德吸管, 和一个没有小费的改良巴斯德吸管。使用前灭菌釜中的所有物料 ( 图 1 ).
- 称5克琼脂, 在100毫升蒸馏水中溶解。在20分钟的121.7 和 #176 消毒解决方案; C 在210.8 人民军在一个高压釜。使用无菌玻璃吸管将3毫升液体琼脂溶液分布在 60 mm 的培养皿中, 使其固化5小时, 用塑料石蜡膜覆盖, 以避免污染并贮存在4和 #176; C 直到进一步使用。在切片过程中, 需要用琼脂块来稳定大脑.
- 媒体
- 使200毫升的制备介质 (pH 7.35) 由198毫升极小必需介质 (记忆) 和2毫升 l-谷氨酰胺溶液 (最终浓度 2 mM) 组成。在媒体准备的当天准备解决方案, 并将其存储在4和 #176; C.
- 准备100毫升的培养基由49毫升的记忆, 25 毫升汉克斯和 #39; 平衡盐溶液 (HBSS), 25 毫升 (v/v) 正常马血清 (NHS), 1 毫升 l-谷氨酰胺溶液 (最终浓度2毫米), 100 和 #181; g 胰岛素, 120 毫克葡萄糖, 10 毫克链霉素, 1万 U 青霉素, 800 和 #181; g 维生素 C 以前报告。加热介质 (37 和 #176; C), 将 ph 值调整为 ph 7.4 和无菌过滤器 (0.2 和 #181; m 孔径大小)。在更改介质之前, 重复该过程 (升温、pH 值调整、 等 ) 每第二天。存储在4和 #176 时最多使用一个星期的介质; C.
- 用准备介质填充一个 35 mm 的培养皿来存储大脑。放置两个空的培养皿, 用于在工作区的冷却包上收集组织.
2。准备和切片用 Vibratome
- 使用7-9 天大鼠或4-5 天老老鼠的大脑进行 OHSC 准备, 根据 Stoppini et al 。4 动物斩首后, 用剪刀从头骨上取下皮肤.
- 将一根细剪刀的刀片引入孔内, 并通过沿尾 (后) 侧 (前) 轴切割来打开颅骨。垂直于第一个切口, 使剪刀指向左右耳, 分别 (#34; T 形切口和 #34;).
- 小心地用细钳打开颅骨, 注意不要伤害大脑。使用手术刀 (刀片大小 11), 以削减最侧的部分额杆和小脑.
- 通过刮刀, 移除大脑并将其小心放置在填充有准备介质的培养皿中 ( 图 2 )。将大脑放置在标本架上, 用医用氰胶水固定。使用琼脂片确保机械稳定.
- 在350和 #181 中横向解剖组织, 使用滑动 vibratome OHSC.
- 使用双目显微镜对切片进行光学评估。立即丢弃低质量的 OHSC。这是很重要的, 只有那些完整的细胞从海马体的中间部分分离 (见图3和 4) 之间的背部和腹海马.
- 用手术刀分离海马区和嗅皮质 (圆刀片大小 15; 图 3 )。必须保留 perforant 通路和嗅皮质.
- 六到八 OHSC 从每个大脑中获得。将2-3 切片转换为一个单元格区域性插入 (孔径0.4 和 #181; m), 并将其放置在一个6井培养皿中, 每井含有1毫升培养基.
- 在35和 #176 中孵育6个以上的菜; C 在完全湿润的气氛中, 5% (v/v) CO 2 并每隔一天更改单元培养基.
注意: 在6天的 体外 (div) 中进行实验。与切片程序相关的炎症反应在6天消失。在这个阶段, 胶质细胞再次显示出分支形态, 突触连接已经成熟.
3。组织质量的评价
- OHSC 中变性神经元的固定、标记和可视化
- 在执行实验后, 用5和 #181 孵化 OHSC; 碘碘 (PI) 在固定前2小时, 在为了使退化神经元的细胞核染色.
注意: PI 是一种疑似致癌物, 总是穿戴个人防护用品 (PPE) 如手套. - 用0.1 米磷酸缓冲液 (pH 7.4) 清洗 OHSC, 并用 4% (v/v) 溶液将其固定在 24 h 的甲醛 (粉煤灰) 中.
警告: 粉煤灰是一种有毒和可疑的致癌物质。工作在油烟罩和穿戴 PPE. - 用1毫升 PBS 清洗 OHSC, 使用工刷将切片与膜分开.
- 用 IB 标记 OHSC 4 在24个井板上染色 ( 图 5 ).
警告: 粉煤灰是一种有毒和可疑的致癌物质。工作在油烟罩和穿戴 PPE.
4。OHSC 实验的评价
使用共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 对 OHSC 进行分析。用于检测 pi 标记, 变性神经元或 pi 标记细胞使用波长和 #955 的单色光; = 543 nm 和一个发射带通滤波器的波长和 #955; = 585-615 nm。对于 CFDA 标记的肿瘤细胞或 IB 4 小胶质瘤, 使用 #955 的激发波长; = 488 nm。对于这两种实验类型, 记录一个 z 堆栈与2和 #181; m 厚的光学切片, 并用于评估.
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Representative Results
神经保护研究:为了确定神经元损伤, 计数的 PI 阳性核和 IB4阳性小胶质细胞在每三个光学部分的颗粒胞层 (协鑫) 的齿状回 (DG) 的数量。对于肿瘤侵袭实验, 采用最大强度 z 投影法计算肿瘤细胞覆盖面积, 作为入侵的测量手段, 并对不同的入侵模式进行可视化 (图 6)。
在未经治疗的控制 OHSC (CTL), 神经元保持保存完好。在 DG 几乎没有 PI 正神经元核 (图 5A) 被观察。在分子层中, 大多数胶质细胞是分支的。在 DG 的协鑫, 只有极少数 IB4正胶质单元 (图 5A) 被检测到。在孵化后与50µM n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 的 PI 阳性神经元核 (图 5B) 和 IB4阳性胶质细胞 (图 5B) 的数量在与控制 OHSC 进行比较时检测到的强增加。在控制条件下, DG (图 5C) 中的变形小胶质细胞和 PI 阳性胞的数量越多, 就可以识别出质量较低的前 OHSC。治疗 pre-damaged 片与 NMDA 导致的 DG 细胞和大量的 PI 阳性死亡细胞蔓延到脐和 CA3 地区 (图 5D)。
肿瘤侵袭研究:切片处理5万细胞的两个胶质瘤细胞线 U138 (图 6A) 和 LN229 (图 6B) 三天。在这两种情况下, 切片培养物的细胞保持完好, 角海马和 DG 被保存。此外, 两种细胞株均表现出明显的侵袭行为。虽然 U138 细胞形成圆形, 明显不同的肿瘤 (图 6A), LN229 细胞建立一个肿瘤网络在单一肿瘤椭球, 往往很难区分。当观察切片培养物中肿块的数量时, 与 U138 细胞比较, 发现 LN229 细胞具有较高的侵袭力。
图 1: 解剖工具和材料.为了准备切片培养, 需要一组合适的解剖工具和材料, 如图所示。该套包括三手术刀与小可更换刀片, 一铲, 两个罚款剪刀, 三镊子, 一个正常的巴斯德吸管, 一个没有尖端的巴斯德吸管, 琼脂, 培养皿, 滤纸, 冷却包, 制备培养基, 和医疗氰胶水解剖工具必须在使用前蒸气, 并放置在一个塑料包装, 以保持它在一个无菌的气氛。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 大鼠脑内海马形成的位置.由黑色虚线显示的海马形成是由大脑皮层和丘脑所包围的双侧结构。海马突起进入侧脑室的颞角。海马是双, 包括角海马 (海马适当) 和齿状回 (或筋膜具牙齿), 与一个叶片在另一个卷。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 大鼠 OHSC 的可视化.一个完整的大脑切片包含 OHSC 是可视化的望远镜, 以评估组织质量。切片保存在填充有冷却准备介质的培养皿中 (a, B)。放大的大脑切片。完整的海马体 (HC) 和嗅皮层在图像的左侧和右侧可见 (C)。OHSC 与大脑的其他部分分开了。DG、角海马子 CA1 和 CA3、门区 (HI)、嗅皮层 (EC) 和分子层 (ML) 的颗粒细胞层 (协鑫) 显然是可区分的 (D)。C, D: 缩放条 = 4 mm。
图 4: OHSC 中的时间依赖变化。
在制备后, 小胶质细胞和星形胶质细胞开始形成胶质瘢痕。从1-3 天的体外(div) 胶质和水肿形成观察。海马形成和 DG 的分层不再可见。在细胞水平上, OHSC 在 5 div 上显示了激活细胞数量的减少。在 6 div, 几乎没有水肿是存在的, 切片是较薄的, 并包括在内在神经元回路中的区域幸存下来。OHSC 现在可以用于实验。缩放条 = 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: CLSM 对组织质量的评价.正如 CLSM 所揭示的, 在 non-lesioned 控制 OHSC (CTL) 中观察到了良好的神经元保存。几乎没有 PI 阳性神经元核 (红色), 只有少数 IB4阳性胶质细胞 (绿色) 在 DG (a) 的颗粒细胞层 (协鑫) 中被发现。与 non-lesioned OHSC 相比, 在损伤 OHSC (B) 中, PI 和 IB4阳性细胞的数量明显增加。请注意 pre-damaged OHSC (C, D) 中 DG、活化胶质细胞和大量 PI 正核的形态学。条形 = 50 µM.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: CLSM 肿瘤侵袭的可视化.PI (红色) 应用后的固定标签的细胞的 OHSC, 而 CFDA (在绿色) 说明肿瘤细胞侵入切片。经过三天的入侵时间, U138 细胞的侵入过程是可视化的。单肿瘤椭球显然是可区分的 (A)。相比之下, 胶质瘤细胞系 LN229 形成了一个肿瘤网络 (B)。条形 = 400 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本议定书描述了 OHSC 的准备工作。这个模型允许测试的内在能力和脑组织的反应后, 应用的生理和病理刺激。除了对电生理参数的分析外, OHSC 可以损伤, 并可确定损伤对所有细胞类型的影响。治疗与不同的物质和详细描述毁损过程或愈合在没有巨噬细胞和淋巴细胞是可能的。
成功的准备和培养的最关键的步骤是: 1) 在无菌条件下工作, 2) 正确准备介质, 考虑温度和 pH 值, 和 3) 在处理 OHSC 的过程中发展必要的人工灵巧。
OHSC 的特点
由于神经元细胞的形态学不变和它们的在体内类似的组织, 切片称为器官。OHSC 包括地层 pyramidale 和地层颗粒, 由锥体角海马 (CA1、CA2、CA3) 和 DG 颗粒细胞组成。海马的部分是高度有序的, 传入纤维投射以不重叠的方式以不同的层终止。嗅皮层 (perforant 通路)、DG、CA3 和 CA1 神经元的 efferences 在准备后保持完好, 并且在功能上与那些体内的行为类似。如前所示, OHSC 中颗粒细胞的树突树、突触形成和网络活动的发展可与从时间匹配控制14、15、16中获得的急性切片相媲美。
突和星形胶质细胞在 OHSC 的光和电镜下进行了研究。突显示一个器官的空间分布, 包括不同的形态学子类型17,18。此外, 轴突成为髓在前两个星期体外。一些作者推测, 在切片培养中, 星形胶质细胞的层位定位缺失, 并认为星形胶质细胞在体外未达到完全成熟。由于星形胶质细胞所有激活步骤的特定标记仍缺少1、19、20, 因此无法完全回答此方面的问题。
在制备后的前3天内, 胶质细胞以迁移和增殖反应, 在切片表面积聚, 形成胶质瘢痕, 与星形细胞结合。所有的细胞似乎都处于高度活化状态。然而, 在 OHSC 的内部层和在3和 6 div 之间, 胶质细胞改变他们的变形形态学对分支形式, 特点是小细胞体和长的分支细细胞质突起延伸在所有方向21 ,22。
类似的表达和分布的谷氨酸受体已报告成人组织和 OHSC2,23。在 OHSC (7、14和 21 div) 中, 突触电流的频率、微型突触电流和 gaba 电流的频率与产后14或15的急性制剂没有显著差异。相比之下, OHSC 中谷氨酸信号的频率高于急性切片15。
不同制备方法的比较
胚胎和早期产后组织的制备是很容易的, 因为良好的细胞存活率在体外。应该认为, 在这个早期阶段, 神经元细胞仍然是迁移和活跃的, 导致了切片1的器官组织丢失。产后7-9 天, 建立了一些突触连接的大鼠。在接下来的2-3 周内在体外突触成熟的13。所提出的模型的优点之一是它的抗机械损伤在准备期间和它的高可塑性由于动物的年龄 (7-9 天)1,14,24。必须提到的是, 切片是高度敏感的机械操纵的仪器。即使是错误的切片角度, 也可能导致顺或逆行神经元死亡的神经纤维的倾斜切割。从成年动物为长期目的制备切片培养物具有挑战性, 但仍未建立。这类 OHSC 在准备工作后不久就出现了大量的退化, 这大概是由于塑性的损失1。然而, 有一个强烈的需要的准备方法, 允许工作与成人切片。
对于几种制备方法, 新切除的组织切片的厚度为300-400 µm, 使用组织菜刀切割孤立海马。这种快速的方法可能经常导致广泛的组织损伤。OHSC 质量的关键因素是它们的最终厚度和保存时间在体外。在300-400 µm 厚切片中, 存活率最高的结果达到最佳效果。在较厚的切片中, 上层层在培养时间内退化, 这是由于扩散限制1。根据被要求的科学问题, OHSC 在准备以后使用或者在几天以后在文化。因此, 多年来建立了几种栽培技术, 如滚筒管技术1、13或静态切片技术4。
在不同的制备方法中, 我们确信, 将接口技术与 vibratome 结合使用, 是制备 OHSC 的最精确和最有害的程序。该方法通过多孔膜进一步改进。OHSC 保持他们的3D 结构, 保持形态和功能完整的几个月, 并可以直观地评估在耕种期间25。
应用程序
OHSC 可从野生型和转基因动物中制备14,26。它们存活数月, 并提供长期实验的选项12,13。OHSC 用于处理生理, 药理, 形态学和发育问题14,27在高度标准如慢性应用 neurotherapeutics 或干细胞治疗的情况26,27,28。研究神经元连接性或与突触传递相关的过程, 突触可塑性, 锥体细胞树突棘的慢性癫痫的影响, 或神经再生都代表其他字段29,30,31,32。
谷氨酸是主要的兴奋性神经递质, 离子谷氨酸受体在兴奋中起着重要作用。兴奋病变发生在神经系统疾病如中风, 阿尔茨海默病, HIV 神经毒性, 创伤性脑损伤和修复机制14,24。谷氨酸受体激动剂 NMDA、α-氨基-3-羟基-5-甲-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 或人酸对 OHSC 模拟选择性和区域特异性神经元细胞死亡的应用26,28,33 ,34。此外, 神经胶质细胞对神经元损伤的反应例如, 胶质迁移和吞噬在 OHSC 以前已被分析3,35。小胶质细胞在病变中的影响可以通过双氯36的药理学耗竭来预测。
一个进一步重要应用出现模仿在体内条件为肿瘤入侵的调查使用 OHSC。胶质瘤细胞株形成的椭球能侵入切片培养物, 这种现象是物种重叠的37。所使用的细胞线的漫渗模式类似于观察到的模式在体内37。此外, 椭球移植到 OHSC 的原发性胶质母细胞瘤的侵袭电位和干细胞特征在几天内体外38。因此, 模型允许观察的入侵模式和神经元组织和肿瘤细胞之间的相互作用对应于那些观察到的在体内37,38。与胶原蛋白或凝胶基模型 (例如) 的39相比, OHSC 的使用似乎更有利于对脑转移和肿瘤侵袭的分析。生理环境, 包括神经元和胶质细胞类型和细胞外基质, 仍然完好无损。
此外, OHSC 允许研究单肿瘤细胞与脑组织在受控条件下的直接相互作用。例如, 通过形成入侵35的引导结构, 胶质细胞被发现可以增强肿瘤细胞进入大脑的能力。
此外, 还可以分析瞬态和永久性细胞改变对入侵过程的影响。一个稳定的表达转移相关的结肠癌基因 1 (MACC1) 在胶质瘤细胞与增加增殖和随后入侵40。细胞系的瞬态变化与细胞系的浸润性有直接关系41。因此, OHSC 和肿瘤细胞 co-cultures 可用于药物检测、临床观察的复制, 以及在高度控制和标准化条件下对肿瘤侵袭进行模型和图像分析。
在主要细胞培养物的研究之后, OHSC 是在更复杂的系统中进行实验的合乎逻辑的下一个选择, 以近似于体内条件。大脑切片的另一个兴趣领域是在测试体内之前对潜在的治疗药物进行筛选。脑切片允许监测和模仿的伤害下观察者的控制和没有动物手术。可获得 8 OHSC, 必要的动物数量显著减少。同样的动物在相同的环境下, 有可能获得结果, 但有不同或多个条件。因此, OHSC 是一个强有力的工具, 观察其他人的形态学, 细胞, 分子在病变期间的变化, 发展的次生损伤和肿瘤传播。
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Disclosures
作者没有透露
Acknowledgments
作者想感谢克里斯汀· Auste 的支持, 她的视频录音和 Chalid Ghadban 为他的出色技术援助。Urszula Grabiec 是支持 FKZ 29/18。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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