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Neuroscience

Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

Published: August 27, 2017 doi: 10.3791/55359
* These authors contributed equally

Summary

Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.

Abstract

En culturas de rebanada hippocampal organotypic (OHSC), las características morfológicas y funcionales de neuronas y células gliales están bien conservadas. Este modelo es adecuado para abordar cuestiones de investigación que involucran estudios de neuroprotección, experimentos electrofisiológicos de neuronas, redes neuronales o invasión del tumor. La arquitectura hippocampal y la actividad neuronal en circuitos multisynaptic están bien conservados en OHSC, aunque el procedimiento de corte inicialmente lesiones y conduce a la formación de una cicatriz glial. La formación de la cicatriz presumiblemente altera las propiedades mecánicas y comportamiento difusivo de moléculas pequeñas, etcetera. Láminas permiten el monitoreo de procesos dependientes del tiempo después de la lesión cerebral sin cirugía animal y los estudios sobre las interacciones entre los diversos tipos de células cerebrales, es decir, astrocitos, microglía y neuronas en fisiológicas y patológicas condiciones. Un aspecto ambivalente de este modelo es la ausencia de flujo sanguíneo y las células inmunes de la sangre. Durante la progresión de la lesión neuronal, migración de células inmunes del juego un papel importante de la sangre. Como esas células faltan en rodajas, se pueden observar los procesos intrínsecos de la cultura sin interferencia externa. Por otra parte, en OHSC la composición del ambiente externo medio es precisamente controlada. Otra ventaja de este método es el menor número de animales sacrificados en comparación con las preparaciones estándar. Varios OHSC puede obtenerse de un animal, posibilitando estudios simultáneos con múltiples tratamientos en un animal. Por estas razones, OHSC son muy adecuadas para analizar los efectos de la nueva terapéutica protectora después de daño de tejido o invasión del tumor.

El protocolo presentado aquí se describe un método de preparación de OHSC que permite generar altamente reproducible, bien conservado láminas que pueden utilizarse para una variedad de investigaciones experimentales, como estudios de neuroprotección o tumor invasión.

Introduction

OHSC son un modelo bien caracterizado en vitro para el estudio de propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas, astrocitos y microglia1. Es fácil de controlar el ambiente extracelular y los cambios morfológicos y celulares después de varios estímulos. La organización de las neuronas de hipocampales y sus conexiones están bien conservadas después de preparación2,3. De varias ventajas, OHSC permiten monitoreo de invasión de la lesión y tumor del cerebro sin cirugía animal. Seis a ocho OHSC puede obtenerse de un solo cerebro de roedor. OHSC por lo tanto ayudar a significativamente a reducir el número de animales y realizar las pruebas de varias concentraciones de la droga, manipulación genética o lesión diferentes modelos en el mismo animal. En rebanada-ensayos, condiciones experimentales pueden ser precisamente controladas. Además, tiempo de desarrollo dependiente de condiciones patológicas como daños secundarios puede controlarse fácilmente por proyección de imagen de Time-lapse.

En el protocolo dado, establecido originalmente por Stoppini et al. 4, los pasos de preparación se describe y se destacan importantes hitos morfológicos para la selección de láminas adecuadas. Se recomienda la preparación del día postnatal 7-9 ratas o ratones de día postnatal 4-5. En estos períodos, OHSC muestran una sólida resistencia a traumas mecánicos y un alto potencial para la reorganización de los circuitos neuronales. Por el contrario, preparaciones de ratas adultas o embrionarias rápidamente cambian su estructura y pierden su morfología organotypic durante el cultivo y por lo tanto son menos convenientes para el estudio de procesos a largo plazo en investigación básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. otro punto crítico para la tasa de supervivencia de OHSC es el espesor de la rebanada de sí mismo como la difusión y suministro de nutrientes es limitada12,13,14.

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Protocol

experimentos con animales se realizaron conforme a la política de la ética y la política sobre el uso de animales en la investigación de la neurociencia aprobado por la Europea comunidades Consejo Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de la Unión Europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. preparación de instrumentos y medios de cultivo

  1. para la preparación de OHSC usan los siguientes instrumentos: dos pequeñas tijeras, dos pinzas curvas, una pinza con punta fina, tres láminas (dos de tamaño 11, uno de tamaño 15), alrededor de tres titulares de bisturí, papeles de filtro (diámetro: 35 mm), agar, una hoja de afeitar, uno sin modificar la pipeta Pasteur y una modificada pipeta Pasteur sin una punta. Esterilizar todos los materiales en autoclave antes de su uso ( figura 1).
  2. Pesar agar 5 g y disolver en 100 mL de agua destilada. Esterilizar la solución por 20 min a 121,7 º C en 210.8 kPa en un autoclave. Distribuir la solución de agar líquido de 3 mL en cajas Petri de 60 mm con una pipeta de vidrio estéril, deje que se solidifique para 5 h, cubra con película de plástico de la parafina para evitar la contaminación y almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior. Bloques de agar son necesarios para estabilizar el cerebro durante el procedimiento de corte.
  3. Media
    1. hacer 200 mL del medio de preparación (pH 7,35) que consiste en medio esencial mínimo (MEM) de 198 mL y 2 mL de solución de L-glutamina (concentración final de 2 mM). La solución en el día de la preparación de los medios de comunicación y almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar 100 mL de medio de cultivo que consiste en 49 mL MEM, madejas de 25 mL ' equilibrado de soluciones salinas (HBSS), suero de caballo normal 25 mL (v/v) (NHS), 1 mL solución de L-glutamina (concentración final de 2 mM), 100 μg insulina, glucosa 120 mg, estreptomicina 10 mg , 10.000 de U de penicilina y 800 μg de vitamina C, como se informó previamente. Caliente el medio (37 ° C), ajustar el pH a filtro de pH 7,4 y estéril (tamaño de poro de 0,2 μm). Repita el procedimiento (calentamiento, ajuste del pH, etcetera.) cada dos días antes de cambiar el medio. Utilizar el medio a lo más una semana cuando se almacena a 4 ° C.
  4. Llenar un plato de Petri de 35 mm con medio de preparación para almacenar el cerebro. Colocar dos placas de Petri vacía para recoger el tejido en un paquete de enfriamiento en el área de trabajo.

2. Preparación y corte con un Vibratome

  1. uso los cerebros de ratas de 7-9 días o 4-5 días ratones del viejo para la preparación de OHSC según Stoppini et al. 4 después de la decapitación de los animales, retirar la piel del cráneo con las tijeras.
  2. Introducir la hoja de una tijera fina en el foramen magnum y abrir el cráneo por el corte del eje caudal rostral (trasero) (delantero). Haga dos cortes perpendiculares al primero, para que la tijera apunte hacia la oreja izquierda y derecha, respectivamente (" incisión T ").
  3. Abrir el cráneo cuidadosamente con unas pinzas finas, prestando atención de no dañar el cerebro. Utilice un bisturí (tamaño de la hoja 11) para cortar la parte más rostral del polo frontal y el cerebelo.
  4. Por medio de una espátula, retirar el cerebro y colocarla cuidadosamente en la caja Petri con medio de la preparación ( figura 2). Colocar el cerebro en el sostenedor de la muestra y fijar con pegamento del cianocrilato médica. Utilizar los pedazos de agar para asegurar la estabilización mecánica.
  5. Disecar el tejido horizontal de 350 μm OHSC gruesa con un vibratome deslizante.
  6. Evaluar las rebanadas ópticamente usando un microscopio binocular. Deseche inmediatamente OHSC de baja calidad. Es importante tomar sólo las rebanadas con cytoarchitecture intacta aislada de la parte media del hipocampo (ver figuras 3 y 4) entre el dorsal y el ventral hipocampo.
  7. Separar la región del hipocampo y la corteza entorrinal con bisturí (hoja tamaño 15; redondo figura 3). La corteza entorrinal y de perforante debe ser preservada.
  8. OHSC de seis a ocho se obtienen de cada cerebro. Transferencia de 2-3 rebanadas en insertar la cultura de una célula (tamaño 0.4 μm de poro) y colocar en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos que contienen medio de cultivo 1 mL por pozo.
  9. Incubar los platos bien de 6 a 35 ° C en una atmósfera completamente humidificada con 5% (v/v) CO 2 y cambiar el medio de cultivo celular cada dos días.
    Nota: Llevar a cabo sus experimentos en el día 6 en vitro (div). Las reacciones inflamatorias asociadas con el procedimiento de corte desaparecen por día 6. En esta etapa, las células microgliales volver a mostrar una morfología ramificada y conexiones sinápticas han madurado.

3. Evaluación de la calidad del tejido

  1. fijación, etiquetado y visualización de neuronas en degeneración en OHSC
    1. después de realizar los experimentos, incubar OHSC con 5 μg/mL propidio (PI) por 2 h antes de la fijación, en orden para teñir los núcleos de neuronas en degeneración.
      PRECAUCIÓN: PI es un carcinógeno, use siempre equipo de protección personal (EPP) como guantes.
    2. Lavar la OHSC con tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4) y fijarlos con una solución al 4% (v/v) de paraformaldehido (PFA) para 24 h.
      PRECAUCIÓN: PFA es un carcinógeno tóxico y sospecha. Trabajar bajo campana y use PPE.
    3. Lave la OHSC insertos con 1 mL de PBS y use un cepillo de rigger para separar láminas de la membrana.
    4. Etiqueta OHSC con tinte de 4 IB en una placa de 24 pozos ( figura 5).
  2. Conducción de experimentos de invasión del tumor usando fluorescencia etiquetada células
    1. 24 h antes del comienzo de un experimento de la etiqueta las células del tumor usando el colorante fluorescente Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl Ester (CFDA SE).
    2. Separar y contar las células del tumor utilizando una cámara de Neubauer.
    3. Resuspender las células en el medio, tal que 10 μl de la suspensión contiene el número deseado de la célula (células normalmente 50.000 o 100.000).
    4. Aplicar 10 μl de la suspensión celular en el sector cultura y permitir que las células que invaden por 3 días.
    5. Al final del experimento, fijar las culturas rebanada con 4% (v/v) PFA por 24 h y etiqueta los co-cultivos con PI por otro 24 h para visualizar la Citoarquitectura.
      PRECAUCIÓN: PFA es un carcinógeno tóxico y sospecha. Trabajar bajo campana y use PPE.
    6. Monte co-cultivos sobre un cubreobjetos para su posterior análisis utilizando los medios de montaje.

4. Evaluación de los experimentos de OHSC

analizar el OHSC con un láser confocal de barrido (CLSM) del microscopio. Para la detección de PI etiquetado, degeneración de las neuronas o la PI etiquetada cytoarchitecture utiliza luz monocromática de longitud de onda λ = 543 nm y una banda de emisión pasan filtro para longitudes de onda λ = 615 585 nm. Para CFDA etiqueta las células tumorales o IB 4 microglia, utilizar una longitud de onda de excitación de λ = 488 nm. Para ambos tipos experimentales, grabar una pila de z con 2 μm optical rodajas y utilizado para la evaluación.

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Representative Results

Estudios de neuroprotección: Para determinar el daño neuronal, el número de núcleos positivos PI y IB4 positivo microglia en cada tercera sección óptica de la capa de la célula del gránulo (GCL) del giro dentado (DG) fue contado. Para los experimentos de la invasión del tumor, la z-proyección de intensidad máxima de la pila se utilizó para el cálculo del área cubierta por las células del tumor, como una medida de la invasión y visualizar patrones de invasión diferentes (figura 6).

En el control sin tratar OHSC (CTL), neuronas permanecían bien conservadas. En el GCL de la DG no se observaron casi PI positivo neuronales núcleos (figura 5A). En la capa molecular, la mayoría de las células microgliales se ramifican. En el GCL de la dirección general, sólo se detectaron muy pocos IB4 positivas las células microgliales (figura 5A). Tras la incubación con ácido de N-metil-D-aspártico de 50 μm (NMDA) un fuerte aumento del número de núcleos neuronales positivos de PI (figura 5B) y células de microglial positivas de4 IB (figura 5B) se detectó en comparación con control OHSC. Previamente dañado OHSC de menor calidad puede identificarse por un número mayor de ameboides microglia y las células positivas de la PI en la DG (figura 5) bajo condiciones de control. Tratamiento de rodajas previamente dañados con NMDA condujo a destrucción de DG cytoarchitecture y un número muy elevado de las células de la muerte positiva PI a la región CA3 (figura 5) y el hilio.

Estudios de invasión tumoral: Sectores fueron tratados con 50.000 células de las dos líneas de células de glioblastoma U138 (figura 6A) y LN229 (Figura 6B) durante tres días. En ambos casos la Citoarquitectura de las culturas de rebanada intacta y el ammonis cornu y la DG se conservaron. Además, ambas células mostraron invasión distinto comportamiento. Mientras que las células U138 formaron tumores redondos, claramente distintos (figura 6A), las células LN229 construcción una red de tumor dentro de esferoides de tumor único y eran a menudo difíciles de distinguir. Al mirar la cantidad de masa tumoral en las culturas de la rebanada, se encontró una mayor invasividad de las células LN229 en comparación con las células U138.

Figure 1
Figura 1: disección de herramientas y materiales. Para la preparación de las culturas de la rebanada, un conjunto adecuado de herramientas de disección y materiales es necesario como se muestra. El conjunto incluye tres escalpelos con pequeñas cuchillas intercambiables, una espátula, dos tijeras finas, tres pinzas, una pipeta de Pasteur normal, una pipeta de Pasteur sin punta, agar, platos de Petri, papel filtro, un paquete de refrigeración, preparación media y médica pegamento del cianocrilato. Las herramientas de disección deben ser esterilizadas antes de su uso y colocan en un envase de plástico para mantenerlo en un ambiente estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ubicación de la formación del hipocampo en el cerebro de la rata. La formación hipocámpica, demostrada por la línea punteada negra es una estructura bilateral, rodeada de la corteza cerebral y el tálamo. El hipocampo se bombea en el cuerno temporal del ventrículo lateral. El hipocampo es bilaminar, que consiste en el cornu ammonis (hipocampo apropiado) y el dentado cerebro (o fascia dentada), con una lámina enrollada dentro del otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: visualización de ratas OHSC. Una porción de todo el cerebro que contienen OHSC es visualizada por un binocular para evaluar la calidad del tejido. Rodajas se mantienen en una placa Petri con medio de preparación refrigerado (A, B). Ampliación de la rebanada del cerebro. El hipocampo intacto (HC) y la corteza del entorhinal son visibles en el lado izquierdo y derecho de la imagen (C). OHSC está separada del resto del cerebro. La capa de la célula del gránulo (GCL) de la dirección general, los subcampos de cornu ammonis CA1 y CA3, la región del hilio (HI), la corteza del entorhinal (EC) y la capa molecular (ML) son claramente distinguibles (D). C, D: barra de escala = 4 mm.

Figure 4
Figura 4: Tiempo de cambios dependientes de OHSC.
Directamente después de la preparación, microglia y astrocitos comienzan a formar una cicatriz glial. De 1 a 3 días en vitro (div) gliosis y edema formación se observan. La estratificación de la formación hippocampal y DG ya no es visible. A nivel celular, OHSC en 5 div mostrar una reducción en el número de células activadas. En div 6, casi no hay edema está presente, el segmento es más delgado y las áreas incluidas en los circuitos neuronales intrínsecos han sobrevivido. OHSC ahora puede ser utilizado para los experimentos. Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: evaluación de la calidad del tejido por CLSM. Según lo revelado por CLSM, se observa una buena preservación neuronal del control no lesionados OHSC (CTL). Prácticamente no hay núcleos neuronales positivos de la PI (rojo) y sólo unos pocos IB4 positivos células microgliales (verde) se encuentran en la capa de la célula del gránulo (GCL) de la dirección general de (A). En contraste con los no lesionados OHSC, un fuerte incremento en el número de células positivas de4 PI y IB es visible en el GCL de OHSC NMDA-lesionados (B). Tenga en cuenta la morfología de la dirección general, las células microgliales activadas y un gran número de núcleos positivos PI en OHSC previamente dañado (C, D). Bares = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: visualización de invasión tumoral por CLSM. PI (en rojo) había aplicada después de las etiquetas de fijación la Citoarquitectura de la OHSC, mientras que el CFDA (en verde) ilustra las células del tumor invade la rebanada. El proceso de invasión de células U138 se visualiza después de tres días de tiempo de la invasión. Esferoides solo tumorson claramente distinguibles (A). En cambio, la línea de celular del glioblastoma LN229 formó una red de tumor (B). Barras = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El presente Protocolo describe la preparación de OHSC. Este modelo permite realizar pruebas de capacidades intrínsecas y las reacciones de tejido cerebral después de la aplicación de estímulos fisiológicos y patológicos. Además de los análisis de los parámetros electrofisiológicos, OHSC puede ser lesionado y pueden determinar los efectos del daño en todos los tipos de la célula. Es posible el tratamiento con diferentes sustancias y la descripción detallada de procesos de lesiones o sanación en ausencia de linfocitos y macrófagos.

The Most pasos críticos para una exitosa preparación y cultivo son: 1) trabajar bajo condiciones estériles, 2) preparar los medios de comunicación, teniendo en cuenta temperatura y pH y 3) desarrollar la destreza manual necesaria durante la manipulación de OHSC.

Características de la OHSC

Debido a la morfología inalterada de las células neuronales y sus en vivo-como la organización, los sectores se denominan organotypic. El OHSC consisten en la capa granulosa pyramidale y estrato, compuesta de las células granulares DG y piramidal cornu ammonis (CA1, CA2, CA3). Partes del hipocampo están muy ordenadas y las proyecciones de fibras aferentes terminan en capas distintas en una manera no superpuestos. Las efferences entre la corteza entorrinal (vía perforante), DG, las neuronas CA3 y CA1 permanecen intactas después de la preparación y se comportan funcionalmente similares a ésos en vivo. Como ya se indica, desarrollo de árboles dendríticos, actividades de formación y red de sinapsis de las células granulares en OHSC son comparables a agudas rodajas de tiempo con controles14,15,16.

Oligodendrocitos y astrocitos han sido estudiados en OHSC por luz y microscopia electrónica. Oligodendrocitos muestran una distribución espacial organotypic, incluyendo diferentes subtipos morfológicos17,18. También, los axones se convierten en myelinated durante las primeras dos semanas in vitro. Algunos autores postulan que la localización específica de la capa de astrocitos es ausente en las culturas de la rebanada y creen que los astrocitos no lleguen a una maduración en vitro. Este aspecto no puede ser respondido plenamente, puesto que los marcadores específicos para todos los pasos de activación de astrocitos siguen desaparecidas1,19,20.

En los primeros 3 días después de la preparación, las células microgliales responden con proliferación y la migración y se acumulan en la superficie de la rebanada donde forman la cicatriz glial junto con astrocitos. Todas las células parecen estar en un estado altamente activa. Sin embargo, en las capas más internas de OHSC y entre 3 y 6 div, las células microgliales cambian su morfología ameboides hacia una forma ramificada, caracterizada por pequeños cuerpos celulares y larga ramificación finas protuberancias citoplasmáticas extendidas en todas direcciones21 ,22.

Similar expresión y distribución de los receptores de glutamato se han divulgado en tejido adulto y OHSC2,23. La frecuencia de las corrientes sinápticas, las corrientes sinápticas de la miniatura y la frecuencia de GABAérgico corrientes en OHSC (div. 7, 14 y 21) no son significativamente diferentes en comparación con preparaciones agudas en postnatales días 14 o 15 respectivamente. En contraste, la frecuencia de las señales glutamatérgica es mayor en OHSC que en rebanadas agudo15.

Comparación de métodos de preparación diferentes

La preparación del tejido embrionario y temprana postnatal es bastante fácil, debido a la buena célula supervivencia tarifas in vitro. Se debe considerar que en esta primera etapa, las células neuronales son todavía activa conduce a una pérdida de organización organotypic de rebanadas1y migratorias. Después de 7-9 días postnatales, se establecen algunas conexiones sinápticas en las ratas. Durante los próximos 2-3 semanas en vitro la sinapsis maduras13. Una de las ventajas del modelo presentado es su resistencia al trauma mecánico durante la preparación y su alta plasticidad debido a la edad de los animales (7-9 días)1,14,24. Debe ser mencionado que las rebanadas son muy sensibles a las manipulaciones mecánicas de instrumentos. Incluso el mal ángulo de corte puede causar inclinación corte de fibras neuronales responsables de anterógrada o retrógrada muerte neuronal. La preparación de las culturas de la rebanada de animales adultos fines a largo plazo es difícil y aún no establecida. Tan OHSC muestran una degeneración masiva poco después de la preparación probablemente debido a la pérdida de plasticidad1. Sin embargo, existe una fuerte necesidad de un método de preparación que permite trabajar con rebanadas de adultos.

Para varios métodos de preparación, el tejido recién suprimido se corta a un grosor de 300-400 μm, utilizando un helicóptero tejido para cortar el hipocampo aislado. Este método rápido con frecuencia puede resultar en daño tisular generalizado. Factores críticos para la calidad de OHSC son su espesor final y el tiempo que se mantienen en vitro. Los mejores resultados con las tasas más altas de supervivencia se han logrado para 300-400 μm rodajas gruesas. En rodajas más gruesas las capas superiores degeneran durante el tiempo de la cultura debido a limitaciones de difusión1. Dependiendo de las preguntas científicas formuladas, OHSC se utilizan directamente después de la preparación o después de varios días en la cultura. Por lo tanto, durante los años se establecieron varias técnicas de cultivo, como el tubo del rodillo técnica1,13 o rebanada estática técnicas4.

De métodos de preparación diferentes estamos convencidos de que mediante la técnica de interfaz con un vibratome es el procedimiento más preciso y menos perjudicial para la preparación de OHSC hasta la fecha. Este método se mejora aún más mediante el uso de membranas porosas. OHSC mantienen su estructura 3D permanecen morfológicamente y funcionalmente intacto durante meses y pueden ser evaluados visualmente durante el período de cultivo25.

Aplicaciones

OHSC puede ser preparado de tipo salvaje y animales transgénicos14,26. Sobrevivir durante meses y ofrecen opciones de12,de experimentos a largo plazo13. OHSC se utilizan para abordar cuestiones fisiológicas, farmacológicas, morfológicos y desarrollo14,27 bajo muy estándarparte de condiciones tales como la aplicación crónica de neurotherapeutics o células madre terapia26,27,28. La investigación de aspectos del desarrollo de la conectividad neuronal o procesos relacionados con la transmisión sináptica, la plasticidad sináptica, los efectos de la epilepsia crónica de espinas dendríticas de las células piramidales o neurogénesis todos representan campos adicionales 29,30,31,32.

Glutamato, principal neurotransmisor excitatorio los receptores de glutamato ionotrópicos juegan un papel central en la excitotoxicidad. Excitotóxicos lesiones se producen en enfermedades neurológicas como el accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, neurotoxicidad VIH, traumatismo craneoencefálico y reparación mecanismos14,24. Uso de agonistas del receptor de glutamato NMDA, el ácido α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic (AMPA) o Ácido kaínico OHSC imitadores selectiva y región específica de la célula neuronal muerte26,28,33 ,34. Además, respuesta de la célula glial por ejemplolesión neuronal, migración microglial y fagocitosis en OHSC han sido previamente analizadas3,35. La influencia de la microglia en la lesión puede predecirse por depleción farmacológica de estas células por el bisfosfonato clodronato36.

Otro uso importante surge mímico en vivo las condiciones para las investigaciones de invasión del tumor usando OHSC. Esferoides formados por líneas celulares de glioma fueron capaces de invadir las culturas de la rebanada, un fenómeno que era especie de superposición de37. El patrón de infiltración difuso de las líneas celulares usadas se asemejó al patrón observado en vivo37. Además, esferoides de glioblastoma primario implantados en OHSC mantuvieron su invasión potencial y carácter de la célula de vástago durante varios días en vitro38. Así, el modelo permite la observación de patrones de invasión y las interacciones entre el tejido neuronal y células tumorales que corresponden a los observados en vivo37,38. En comparación con colágeno o gel basado en modelos (por ejemplo)39, el uso de OHSC parece más beneficioso para los análisis de invasión de tumor y la metástasis en el cerebro. El medio fisiológico, incluyendo tipos neuronales y glial de la célula y matriz extracelular, se mantiene intacto.

Además, OHSC permiten estudiar las interacciones directas entre las células individuales del tumor y el tejido cerebral bajo condiciones controladas. Por ejemplo, las células microgliales fueron encontradas para mejorar las capacidades de las células tumorales a entrar en el cerebro formando estructuras guías para invasión35.

Además, puede analizarse el efecto de alteraciones celulares transitorias y permanentes en los procesos de invasión. Una expresión estable del gen de cáncer de colon metástasis asociada 1 (MACC1) en células de glioma se asoció con un aumento de la proliferación y la posterior invasión40. La alteración transitoria de la rigidez de la célula en líneas celulares de glioblastoma se correlacionó directamente con las propiedades invasoras de las líneas celulares del41. Co-cultivos OHSC y tumor de la célula pueden así utilizar para pruebas de drogas, reproducción de observaciones clínicas y de imagen y modelo de invasión tumoral bajo condiciones altamente controladas y estandarizadas.

Después de estudios en cultivos celulares primarios, OHSC son la opción siguiente lógica para realizar experimentos en un sistema más complejo para aproximar las condiciones en vivo . Otro campo de interés en rebanadas de cerebro es la proyección de posibles fármacos terapéuticos antes de la prueba en vivo. Rebanadas de cerebro permiten monitoreo y mímico de lesiones bajo control del observador y sin necesidad de cirugía animal. Puede obtenerse hasta 8 OHSC y el número de animales necesarios se reduce considerablemente. Es posible obtener resultados en el mismo animal en configuración similar pero con diferente o varias condiciones. Así, OHSC es una herramienta poderosa para observar entre otros cambios morfológicos, moleculares y celulares durante el periodo de lesión, el desarrollo de daño secundario y propagación del tumor.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Christine Auste por su apoyo con la grabación de vídeo y Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica. Urszula Grabiec fue apoyado por el Roux Programm FKZ 29/18.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales
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Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

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