Summary
Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.
Abstract
Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC), sinir hücreleri ve gliyal hücreler morfolojik ve fonksiyonel özellikleri iyi korunmuş. Bu model dahil çalışmaları nöronlar, nöronal ağlar veya tümör işgali üzerinde Elektrofizyolojik deneyler neuroprotection üzerinde farklı araştırma soruları ele almak için uygundur. Hipokampal mimarisi ve multisynaptic devrelerde nöronal aktivite iyi OHSC, düz-se bile Dilimleme yordam başlangıçta lezyonlar ve gliyal yara oluşumuna yol açar korunmuş. Yara oluşumu muhtemelen mekanik özellikleri ve küçük moleküller, vbdiffusive davranışını değiştirir. Dilimleri Saat bağımlı süreçlerinin beyin hasarı hayvan cerrahi ve çeşitli beyin türetilmiş hücre tipleri, yani astrocytes, microglia ve fizyolojik ve patolojik altında nöronlar arasındaki etkileşimler çalışmaları olmadan sonra izleme izin koşullar. Bu model kararsız bir yönünü kan akımı ve bağışıklık kan hücreleri olmaması. Nöronal yaralanma ilerleme sırasında bağışıklık hücreleri kan oynamak önemli bir rol geçirme. Bu hücreleri dilimler halinde eksik olduğundan, içsel süreçleri kültür dış müdahale gözlenen. Ayrıca, OHSC orta-dış ortam bileşimi tam olarak kontrol edilir. Bu yöntem bir başka kurban hayvanların standart hazırlıkları için karşılaştırıldığında daha düşük sayıda avantajdır. Birkaç OHSC birden çok tedavileri ile eşzamanlı çalışmalar bir hayvan edinerek bir hayvandan elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı OHSC sonra doku hasarı veya tümör işgali sırasında yeni koruyucu tedavi etkilerini çözümlemek için uygundur.
Sunulan Protokolü burada üreten son derece tekrarlanabilir sağlar OHSC hazırlama yöntemi açıklar, iyi korunmuş deneysel araştırma, neuroprotection veya tümör işgali çalışmalar gibi çeşitli için kullanılan dilimler.
Introduction
OHSC nöronlar, astrocytes ve microglia1fizyolojik ve patolojik özelliklerini incelemek için iyi karakterize vitro modeli vardır. Hücre dışı ortam kontrol etmek ve hücresel ve morfolojik değişiklikler sonra çeşitli uyaranlara izlemek kolaydır. Hipokampal nöronlar organizasyonu ve bağlantıları sonra hazırlık2,3iyi korunmuş. Çeşitli yararları dışarı OHSC izin hayvan ameliyat olmadan beyin hasarı ve tümör işgalinin izleme. Altı ya da sekiz OHSC tek bir kemirgen beyinden elde edilebilir. OHSC bu nedenle önemli ölçüde hayvan sayısını azaltmak ve birden fazla ilaç konsantrasyonları, genetik manipülasyon veya farklı lezyon modelleri aynı hayvan test izin vermek için yardımcı olur. Dilim tabanlı deneyleri içinde deneysel koşullar tam olarak kontrol edilebilir. Ayrıca, ikincil hasar gibi patolojik durumlardan zaman bağımlı geliştirme kolayca zaman hata görüntüleme tarafından izlenebilir.
Başlangıçta Stoppini ve ark. tarafından kurulan belirli iletişim kuralı 4, hazırlık adımları açıklanmıştır ve uygun dilimleri seçimi için önemli morfolojik yerler vurgulanır. Doğum sonrası gün 7-9 fareler veya doğum sonrası 4-5 gün fareler hazırlanması tavsiye ediyoruz. Bu dönemlerde OHSC mekanik travmalar ve nöronal devreler yeniden yapılanma yüksek bir potansiyel güçlü bir direnç gösteriyor. Buna ek olarak, ürünleri embriyonik veya yetişkin fareler üzerinden hızla yapılarını değiştirmek ve onların organotypic Morfoloji ekimi sırasında kaybetmek ve bu nedenle temel araştırma5,6 ' uzun vadeli işlemler çalışmak için daha az uygun , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Difüzyon ve böylece besin kaynağı sınırlı12,13,14OHSC hayatta kalma oranı için başka bir kritik nokta dilim kalınlığı 's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan deneyleri gerçekleştirilen etik ilke ve nörolojik araştırma hayvanlara kullanım ilkesi doğrultusunda Avrupa Toplulukları Konseyi yönergesi 2010/63/AB tarafından Avrupa Parlamentosu onaylanmış ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması üzerinde Avrupa Birliği Konseyi.
1. Kültür ortam ve aygıtlar hazırlık
- OHSC hazırlanması için aşağıdaki araç kümesi, kullanın: iki küçük makas, iki eğri cımbız, iyi bir ipucu ile bir cımbız üç Bıçaklar (iki boyutu 11, mevcudu 15 biri), Üç neşter sahipleri, yuvarlak filtre kağıtları (çapı: 35 mm), agar, bir tıraş bıçağı, biri Pasteur pipet değiştirilmemiş ve biri Pasteur pipet bir ipucu olmadan değiştirilebilir. Kullanım ( şekil 1) önce bir otoklav içinde tüm malzemeleri sterilize.
- 5 g agar tartmak ve 100 mL distile suda çözülür. Bir otoklav içinde 210.8 kPa, 121.7 ° C'de 20 dk için çözüm sterilize. 3 mL sıvı agar çözüm 60 mm Petri yemeklerinde steril cam pipet kullanarak dağıtmak, 5 h için kuvvetlendirmek, kirlenmesini önlemek ve 4 ° C'de daha fazla kullanmak kadar saklamak için plastik parafin film ile karşılamak izin. Agar blok Dilimleme işlemi sırasında beyin stabilize etmek için gereklidir. 198 mL en az gerekli orta (MEM) ve 2 mL L-glutamin çözüm
- medya
- yapmak 200 mL hazırlık orta (pH 7,35) oluşan (son konsantrasyonu 2 mM). Çözüm medyası hazırlama gününde hazırlamak ve 4'te saklayın ° C.
- 100 mL 49 mL MEM, 25 mL Hanks oluşan kültür ortamının hazırlamak ' dengeli tuz Çözümleri (HBSS), 25 mL (v/v) normal at serum (NHS), 1 mL L-glutamin çözüm (son konsantrasyonu 2 mM), 100 µg insülin, 120 mg glikoz, 10 mg streptomisin , 10.000 U penisilin ve 800 µg daha önce bildirildiği gibi C vitamini. Orta (37 ° C) sıcak, pH 7.4 ve steril filtre (0.2 µm gözenek boyutu) pH değerine ayarlayın. Orta değiştirmeden önce her iki günde (ısınma pH ayarlama, vb,) yordamı yineleyin. Orta en bir hafta boyunca kullanmak saat 4'te saklandığında ° C.
- Bir 35 mm Petri kabına beyin depolamak için hazırlık orta ile doldurun. Doku üzerinde bir soğutma paketi çalışma alanı içinde toplamak için iki boş Petri tabağı yere.
2. Hazırlık ve dilimleme bir Vibratome ile
- Kullanım beyin 7-9 gün eski fareler veya 4-5 gün Stoppini ve ark göre OHSC hazırlık için eski fareler. 4 sonra işten çıkarma hayvanların, deri kafatasından makasla kaldırmak.
- İyi makas bıçak deliği magnum tanıtmak ve kafatası Kaudal (geri) rostral (açık) ekseni boyunca keserek açın. Yapmak iki makas sırasıyla sol ve sağ kulak doğru işaret böylece ilki için dik keser (" T-kesi ").
- Kafatası beyin zarar değil dikkat iyi Forseps ile dikkatlice açın. Bir neşter (bıçak büyüklüğüne 11) ön direğe ve beyincik en rostral parçası kesmek için kullanın.
- Tarafından bir spatula ile beyin kaldırmak ve hazırlık orta ( Şekil 2) ile dolu Petri kabına dikkatle yer anlamına gelir. Beyin numune tutucu üzerinde konumlandırın ve tıbbi siyanoakrilat yapıştırıcı ile düzeltebilirim. Mekanik stabilizasyon temin için agar parçaları kullanın.
- Yatay olarak 350 µm doku teşrih sürgülü vibratome kullanarak kalın OHSC.
- Optik Binoküler mikroskop kullanma dilim değerlendirin. OHSC düşük kalite hemen atın. Hipokampüs orta kısmından izole olduğu gibi cytoarchitecture ile yalnızca bu dilimleri almak önemlidir (bkz. Şekil 3 ve 4) arasında dorsal ve ventral Hipokampus. Hipokampal bölgeyi ve neşter (yuvarlak bıçak büyüklüğüne 15; kullanarak entorhinal korteks
- ayrı şekil 3). Perforant yolu ve entorhinal korteks korunmalıdır.
- 6-8 OHSC her beyin elde edilir. 2-3 dilim içine bir hücre kültür ekleme (gözenek boyutu 0.4 µm) aktarmak ve 1 mL kültür orta iyi ücret içeren bir 6-şey kültür yemeğin bir şey yerleştirebilirsiniz.
- 6-iyi yemekler %5 (v/v) CO 2 ile tam olarak oksijen bir ortamda 35 ° C'de kuluçkaya ve hücre kültür orta iki günde değiştirin.
Not: 6 gün vitro (div), senin deney. İnflamatuar reaksiyonları Dilimleme yordamı ile ilişkili gün 6 tarafından yok olur. Bu aşamada, mikroglial hücre ramified Morfoloji yeniden göstermek ve sinaptik bağlantıları olgunlaştı.
3. Doku niteliğinin
- fiksasyon, etiketleme ve görsel olarak yozlaşıyor nöronların OHSC
- deneyler gerçekleştirdikten sonra fiksasyon önce 2 h 5 µg/mL propidium iyodür (PI) ile OHSC içinde kuluçkaya nöronların oluşan bozucu çekirdekleri leke için sipariş.
Dikkat: PI şüpheli bir kanserojen, her zaman kişisel koruyucu ekipman (PPE) gibi eldiven giymek. - 0.1 M fosfat tampon (pH 7,4) ile OHSC yıkama ve paraformaldehyde (PFA) 24 h için %4 (v/v) çözeltisi ile tamir
Dikkat: PFA şüpheli ve zehirli kanserojen olduğu. İş duman başlık altında ve KKE giymek. - OHSC ekler 1 mL PBS ile yıkayın ve membran dilimleri ayırmak için bir de fırça kullanın.
- Etiket OHSC IB 4 boya 24-şey plaka ( şekil 5).
- deneyler gerçekleştirdikten sonra fiksasyon önce 2 h 5 µg/mL propidium iyodür (PI) ile OHSC içinde kuluçkaya nöronların oluşan bozucu çekirdekleri leke için sipariş.
- Tek hücreleri iletim tümör işgali deneyler fluorescently kullanarak etiketli
- bir deney başlamadan önce 24 h etiket tümör hücreleri floresan boya Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl kullanarak Ester (CFDA SE).
- Ayır ve Neubauer odası kullanarak tümör hücreleri saymak.
- Süspansiyon 10 µL istenen cep numarasını (normalde 50.000 veya 100.000 hücreleri) içerir öyle ki Orta, hücrelerde resuspend.
- Hücre süspansiyon dilim kültür üzerine 10 µL uygulayın ve 3 gün boyunca işgal hücrelere izin.
- Deneme sonunda %4 (v/v) İngiltere'de yılın 24 h için kullanma dilim kültürler düzeltmek ve PI başka bir 24 h için cytoarchitecture görselleştirmek için yardımcı kültürlerle etiket.
Dikkat: PFA şüpheli ve zehirli kanserojen olduğu. İş duman başlık altında ve KKE giymek. - Üzerine bir kapak notu montaj medya kullanarak daha ayrıntılı bir çözümleme için ortak kültürler mount.
4. OHSC deneyler değerlendirilmesi
OHSC confocal lazer mikroskop (CLSM) tarama bir analiz. 543 PI tespiti etiketli, nöronların oluşan bozucu veya cytoarchitecture etiketli PI kullanın monokromatik ışık dalga boyu λ = nm ve emisyon grubu pass filtre dalga boyu λ için 585-615 nm =. Tümör hücreleri veya IB 4 microglia CFDA etiketli, bir uyarma dalga boyu λ kullanmak 488 = nm. Deneysel her iki türü için bir z-yığın 2 µm kalınlığında optik dilim ile kayıt ve değerlendirme için kullanılan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuroprotection çalışmaları: Nöronal hasar, PI olumlu çekirdek ve IB4 microglia dentat gyrus (DG) granül hücre Katmanı (un) her üçüncü optik bölümünde sayılan olumlu sayısını belirlemek için. Tümör işgali deneyler için maksimum yoğunluk z-projeksiyon yığının tümör hücreleri tarafından işgali ve farklı işgali desenleri (şekil 6) görselleştirmek için bir tedbir olarak bölgeyi hesaplamak için kullanıldı.
Tedavi edilmezse denetimde OHSC (CTL), nöronlar iyi korunmuş kaldı. DG un içinde neredeyse hiç PI olumlu nöronal hücre çekirdeği (şekil 5A) tespit edildi. Moleküler katmanında, mikroglial hücreleri çoğunluğu ramified. DG, sadece un içinde çok az IB4 olumlu mikroglial hücreleri (şekil 5A) tespit edildi. 50 µM N-metil-D-aspartik asit (NMDA) güçlü bir kuluçka sonra PI olumlu nöronal hücre çekirdeği (şekil 5B) sayısında artış ve IB4 olumlu mikroglial hücreleri (şekil 5B) denetim OHSC karşılaştırıldığında algılandı. Daha düşük kalitede önceden bozuk OHSC protozlar microglia ve denetim koşullar altında (şekil 5C) DG PI pozitif hücrelerinin daha yüksek sayıda belirlenebilir. Önceden hasarlı dilimleri NMDA ile tedavi imha DG cytoarchitecture ve PI olumlu ölüm hücreleri hilus ve CA3 bölge (şekil 5 d) yayılan çok sayıda yol açtı.
Tümör işgal çalışmaları: Dilimleri 50.000 hücreleri (şekil 6A) iki glioblastoma hücre satır U138 ile tedavi ve LN229 (şekil 6B) üç gündür. Her iki durumda da cytoarchitecture dilim kültürlerin sağlam kalmış ve cornu ammonis ve DG korunduğu görülmüştür. Ayrıca, her ikisi de ayrı işgal davranış gösterdi satırları hücre. U138 hücreleri yuvarlak, açıkça farklı Tümörleri (şekil 6A) oluşan, LN229 hücreleri tek tümör pulcuklarının içinde tümör ağ inşa ve sık sık ayırt etmek zor. Dilim kültürlerde tümör kitle miktarda bakıldığı zaman, LN229 hücreler için daha yüksek bir invasiveness U138 hücreleri ile karşılaştırıldığında bulundu.
Şekil 1: diseksiyon araç ve Gereçleri. Dilim kültürlerinin hazırlanması, diseksiyon araç ve Gereçleri uygun bir dizi gösterildiği gibi gereklidir. Küçük değiştirilebilir bıçaklar, bir spatula, iki iyi makas, üç forseps, bir normal Pasteur pipet, bir Pasteur pipet ucu olmadan, agar, Petri yemekler, filtre kağıdı, bir soğutma paketi, hazırlık orta ve tıp ile üç neşter içerir Cyanoacrylate tutkal. Diseksiyon araçlar önce kullanımı autoclaved olmalı ve steril bir ortamda tutmak için plastik bir paketin içine yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sıçan beyin Hipokampal oluşumunda konumunu. Siyah noktalı çizgiyle gösterilen Hipokampal oluşumu, serebral korteks ve talamus içine ikili bir yapıdır. Hipokampüs lateral ventrikül temporal boynuz çıkıntı. Hipokampüs cornu ammonis (Hipokampus uygun) ve dentat gyrus (veya fasya dentat), bir lamina yerleştirilmiştir ile oluşan bilaminar, diğer içinde olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: görselleştirme sıçan OHSC. OHSC içeren tüm beyin dilim doku kalitesi değerlendirmek için dürbün tarafından görüntülenmiştir. Dilimleri ile soğutmalı hazırlık orta (A, B) dolu bir petri tutulur. Beyin dilim büyütme. Entorhinal korteks ve bozulmamış hippocampus (HC) sol ve sağ tarafında görüntü (C) görülebilir. OHSC beyin diğerlerinden ayrılır. DG, cornu ammonis alt dallar CA1 ve CA3, hilus bölge (hı), entorhinal korteks (EC) ve moleküler Katmanı (ML) granül hücre Katmanı (un) açıkça ayırt (D) vardır. C, D: ölçek çubuğu = 4 mm.
Resim 4: OHSC zaman bağımlı değişimler.
Doğrudan sonra hazırlık, gliyal yara oluşturmak microglia ve astrocytes başlar. 1-3 gün vitro (div) gliosis ve ödem oluşumu gözlenir. Hipokampal oluşumu ve DG stratifikasyon artık görünür değil. Hücresel düzeyde, OHSC 5 div üzerinde aktif hücre sayısında bir azalma görüntüler. 6 div, neredeyse ödem mevcuttur, dilimi incedir ve alan alanlarda iç nöronal devreler içerisinde kalmıştır. OHSC şimdi deneyler için kullanılabilir. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: doku niteliğinin tarafından CLSM. CLSM tarafından ortaya gibi iyi bir nöronal koruma lesioned denetimde OHSC (CTL) görülmektedir. Hemen hemen hiçbir PI olumlu nöronal hücre çekirdeği (kırmızı) ve yalnızca birkaç IB4 olumlu mikroglial hücreleri (yeşil)(a)DG granül hücre katmanda (un) bulunur. Lesioned OHSC aksine, PI ve IB4 pozitif hücre sayısı güçlü bir artış NMDA lesioned OHSC (B) un içinde görünür. DG, aktif mikroglial hücreleri ve çok sayıda önceden bozuk OHSC (C, D) PI olumlu çekirdek morfolojisi unutmayın. Barlar 50 µM. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: görselleştirme CLSM tümör istilası. CFDA (yeşil içinde) dilimi istila tümör hücreleri gösterir iken PI (kırmızı), OHSC, cytoarchitecture sonra fiksasyon etiketleri uygulanan. U138 hücreleri istila sürecinin işgali süresi üç gün sonra görüntülenir. Tek tümör pulcuklarınınaçıkça ayırt (A) vardır. Buna ek olarak, glioblastoma hücre kültürünü LN229 bir tümör ağ (B) kurdu. Barlar 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolünü OHSC hazırlanması açıklar. Bu model iç yetenekleri ve beyin dokusu reaksiyonları fizyolojik ve patolojik bir çekim gücü uygulamadan sonra test sağlar. Elektrofizyolojik parametrelerinin analizler, yanı sıra OHSC lesioned olabilir ve hasar etkisi tüm hücre türleri belirlenebilir. Farklı maddeler ve lesioning işlemler veya makrofajlar ve lenfositler yokluğunda şifa ayrıntılı açıklaması ile tedavi mümkündür.
The Most kritik adımlar için bir başarılı Hazırlık ve kodlamayla için: 1) işe steril koşullarda, 2) medya doğru sıcaklık ve pH, göz önünde bulundurarak hazırlamak ve geliştirmek 3) gerekli el becerisi OHSC işlenmesi sırasında.
OHSC özellikleri
Nedeniyle nöronal hücre değiştirilmemiş morfolojisi ve onların vivo-organizasyon gibi dilimleri organotypic adı verilir. OHSC piramit cornu ammonis (CA2, CA1, CA3) ve DG taneli hücreleri oluşur stratum pyramidale ve stratum granulosum, oluşur. Hipokampüs bölümlerini çok sipariş edilen ve afferent fiber projeksiyonlar ayrı katmanlar halinde üst üste bir biçimde sonlandırılmasını. Efferences arasında entorhinal korteks (perforant yolu), DG, CA3 ve CA1 nöronlar sonra hazırlık korunacak ve işlevsel olarak o içinde vivoiçin benzer davranır. Daha önce gösterilen, dendritik ağaçlar, gelişimi OHSC granüler hücrelerde synapse oluşumu ve ağ faaliyetleri akut dilimleri eşleşen zaman denetimleri14,15,16elde edilen karşılaştırılabilir.
Oligodendrocytes ve astrocytes OHSC içinde ışık ve elektron mikroskobu tarafından incelenmiştir. Oligodendrocytes farklı morfolojik alt türlerinden17,18de dahil olmak üzere bir organotypic mekansal dağılım gösterir. Ayrıca, akson sırasında ilk iki hafta içinde in vitromyelinated haline. Bazı yazarlar ve katman belirli yerelleştirme astrocytes sahip olduğunu öne yok dilim kültürlerde ve astrocytes tam olgunlaşma vitroulaşmak olmayan inanıyorum. Astrocytes tüm etkinleştirme adımları için belirli işaretleri hala1,19,20eksik beri bu yönü tam olarak yanıtlanamaz.
İlk 3 gün sonra hazırlık mikroglial hücreleri geçiş ve yayılması ile yanıt ve nerede onlar gliyal yara astrocytes birlikte formu dilim yüzeyde birikir. Tüm hücreleri son derece aktif bir durumda görünmektedir. Ancak, iç Katmanlar OHSC arasında 3 ve 6 div, küçük hücresel bedenler ve uzun dallanma iyi sitoplazmik çıkıntılar her yöne21 genişletilmiş ile karakterize bir ramified formu doğru protozlar onların morfolojisi mikroglial hücreleri değiştirme ,22.
Benzer ifade ve dağıtım Glutamat reseptörlerinin yetişkin doku ve OHSC2,23bildirilmiştir. Sinaptik akımları, minyatür sinaptik akımları ve OHSC (7, 14 ve 21 sayı) akımlar için akut hazırlıkları doğum sonrası günlerde 14 veya 15 sırasıyla karşılaştırıldığında farklı olmamasını GABAergic frekans frekans. Buna ek olarak, glutamatergic sinyalleri sıklığı akut dilimleri15dakika içinde OHSC da yüksektir.
Farklı hazırlık yöntemlerinin karşılaştırılması
Embriyonik ve erken postnatal doku hazırlanması nedeniyle iyi hücre sağkalım oranları içinde vitroçok kolaydır. Bu erken aşamada hala göçmen ve aktif önde gelen dilimler1organotypic organizasyonu için bir kayıp nöronal hücre düşünülmelidir. Doğum sonrası 7-9 gün sonra Sıçanlarda bazı sinaptik bağlantılar kurulur. Sırasında sonraki 2-3 hafta vitro sinapslarda13olgun. Sunulan modelin avantajları, dayanıklılığı, mekanik travma sırasında hazırlık ve onun yüksek plastisite hayvanlar (7-9 gün)1,14,24yaş nedeniyle biridir. Bu dilimleri için mekanik işlemler son derece hassas aletleri tarafından belirtilen gerekir. Dilimleme bile yanlış açı eğik kesme nöronal liflerinin anterograd veya retrograd nöronal ölümünden sorumlu neden olabilir. Yetişkin hayvanlardan dilim kültürlerin uzun vadeli amaçlar için zorlu ve hala değil kurulan hazırlıktır. Böyle OHSC kaybı nedeniyle muhtemelen hazırlanması plastisite1kısa bir süre sonra büyük bir dejenerasyon göster. Yine de, işte güçlü bir yetişkin dilimleri ile çalışmaları için izin veren bir hazırlama yöntemi için gerekir.
Birkaç hazırlık yöntem için taze çıkarılan doku izole Hipokampus kesmek için bir doku helikopter kullanarak 300-400 µm kalınlık için dilimlenmiş. Bu hızlı yöntem sık yaygın doku zarar görmesine neden. Onların son kalınlığı ve vitrotutulur zaman OHSC kalitesi için kritik faktörlerdir. En iyi sonuçları en yüksek hayatta kalma oranları ile 300-400 µm kalınlığında dilimler için elde ettik. Daha kalın dilimler halinde üst katmanları Difüzyon sınırlamalar1nedeniyle kültür zaman sırasında dejenere. Bilimsel sorular bağlı olarak OHSC hazırlık hemen sonra veya kültür birkaç gün sonra kullanılır. Bu nedenle, yıl içinde çeşitli yetiştirme teknikleri, silindir-tüp tekniği1,13 veya statik dilim teknikleri4gibi kuruldu.
Farklı hazırlama yöntemleri dışında biz arayüzü tekniği ile birlikte bir vibratome kullanarak OHSC bugüne kadar hazırlanması için en doğru ve en az zarar veren yordamı eminiz. Bu yöntem daha fazla geçirgen membranlar kullanılarak geliştirildi. OHSC 3D onların yapısını korumak, aylardır morfolojik ve fonksiyonel olarak bozulmamış kalmak ve sırasında ekimi dönem25görsel olarak değerlendirilebilir.
Uygulamalar
OHSC vahşi türü ve Transjenik hayvanlar14,26hazırlanabilir. Onlar ay için hayatta kalmak ve uzun vadeli deneyler12,13için seçenekler sunar. OHSC fizyolojik, farmakolojik, morfolojik ve gelişimsel soru14,27 altında adres için kullanılan son derece çiftize koşulları neurotherapeutics veya kök hücre terapisi26,27,28kronik uygulaması gibi. Sinaptik iletimi, sinaptik plastisite, piramit hücre dendritik dikenleri kronik epilepsi etkileri için nöronal bağlantısının kesilmiş olması veya işlemler gelişimsel açıdan incelenmesi ile ilgili veya neurogenesis tüm temsil ek alanlar 29,30,31,32.
Glutamat, birincil eksitatör nörotransmitter ve ionotropic Glutamat reseptörlerinin excitotoxicity içinde merkezi bir rol oynamaktadır. Excitotoxic lezyonlar kaynak felç, Alzheimer hastalığı, HIV nörotoksisite, travmatik beyin hasarı ve tamir mekanizmaları14,24gibi nörolojik hastalıklar sırasında ortaya çikmaktadir. Glutamat reseptör agonistleri NMDA uygulanması, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) veya kainic asit OHSC taklit eder seçici ve bölge belirli nöronal hücre ölüm26,28,33 için ,34. Ayrıca, nöronal yaralanma örneğin, mikroglial geçiş ve fagositoz OHSC içinde gliyal hücreye yanıt daha önce yapılmış analiz3,35. Microglia lezyon sırasında etkisi bu hücreler farmakolojik tükenmesi bifosfonat clodronate36tarafından öngörülen.
Bir daha da önemli uygulama OHSC kullanarak tümör işgalinin araştırmalar için taklit eden vivo içinde koşullar ortaya çıkar. Tümörü hücre hatları ile kurulan pulcuklarının dilim kültürler,37örtüşen türler olduğunu bir fenomen istila yeteneğine sahip olduğu. Kullanılan hücre çizgiler diffüz infiltrasyon desen gözlenen desen vivo içinde37andıran. Buna ek olarak, birincil glioblastoma pulcuklarının OHSC implante istilaya potansiyel tutulur ve kök hücre üzerinde birkaç gün vitro38karakter. Böylece, model işgal desenleri ve nöronal doku ve in vivo37,38gözlenen bu karşılık gelen tümör hücreleri arasındaki etkileşimler gözlem sağlar. Kollajen veya jel ile karşılaştırıldığında tabanlı modeller (örneğin)39, OHSC kullanımı analizlere beyinde metastaz ve tümör işgali için daha yararlı gibi görünüyor. Nöronal ve gliyal hücre tipleri ve hücre dışı matriks gibi fizyolojik ortam değişmeden kalır.
Ayrıca, OHSC izin tek tümör hücreleri ve beyin dokusu kontrollü şartlar altında doğrudan Hofstede okuyor. Örneğin, mikroglial hücreleri istila35için yol gösterici yapıları oluşturan beyin girmeye yeteneklerini tümör hücrelerinin bulunmuştur.
Ayrıca, geçici ve kalıcı hücresel değişiklikler işgali süreçleri etkisini analiz edilebilir. Tümörü hücrelerdeki ilişkili metastaz kolon kanser gen 1 (MACC1) istikrarlı bir ifade bir artan yayılması ve sonraki işgali40ile ilişkili idi. Hücre sertlik glioblastoma hücre hatlarında geçici İLETİMLERİNİZE doğrudan hücre hatları41invaziv özellikleri ile ilişkili. OHSC ve tümör hücre ortak kültürleri böylece potansiyel olarak uyuşturucu testi, üreme klinik gözlemler ve son derece kontrollü ve standart koşullar altında model ve görüntü tümör işgal için kullanılabilir.
Birincil hücre kültürlerinde çalışmalar sonra OHSC vivo içinde koşullar yaklaşık deneyler daha karmaşık bir sistem yerine getirmek için kullanılan mantıksal sonraki seçim için vardır. Başka bir beyin dilimleri ilgi içinde vivotest önce tarama potansiyel terapötik ilaçların alandır. Beyin dilimleri izleme ve yaralanma gözlemci kontrol altında ve hayvan ameliyat olmadan taklit sağlar. En çok 8 OHSC elde edilebilir ve gerekli hayvan sayısı önemli ölçüde azalır. Benzer ayarları'nın altında ama farklı ile aynı hayvan veya birden çok koşul sonuçları elde etmek mümkündür. Böylece, OHSC lezyon dönemi, ikincil hasar ve yayılan tümör gelişimi sırasında diğerleri arasında morfolojik, hücresel, moleküler değişiklikleri gözlemlemek için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Yazarlar Christine Auste onun desteğiyle video kayıt ve stadyum Ghadban onun mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Urszula Grabiec, Roux Programm FKZ 29/18 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
