Summary
Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.
Abstract
Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.
Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.
Introduction
OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.
In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.
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Protocol
Tierversuche wurden gemäß der Ethik-Politik und die Politik auf den Einsatz von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung durchgeführt, wie von der Europäischen Gemeinschaften Rat Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments genehmigt und des Rates der Europäischen Union über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
- für die Vorbereitung der OHSC verwenden die folgenden Instrumente: zwei kleine Schere, zwei gebogene Pinzetten, eine Pinzette mit einer feinen Spitze drei Klingen (zwei der Größe 11, einer der Größe 15), Inhaber von drei Skalpell Runde Filterpapiere (Durchmesser: 35 mm), Agar, einer Rasierklinge, einer unveränderten Pasteurpipette und eine geändert Pasteurpipette ohne ein Trinkgeld. Sterilisieren Sie alle Materialien in einem Autoklaven vor Verwendung ( Abbildung 1).
- Wiegen 5 g Agar und in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Die Lösung für 20 min bei 121,7 ° C 210,8 kPa im Autoklav zu sterilisieren. Verteilen Sie 3 mL flüssigen Agar Lösung in 60 mm Petrischalen mit einer sterilen Glaspipette zu, lassen Sie es für 5 h zu festigen, Deckel mit plastischen Paraffin Film Kontamination zu vermeiden und bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern. Agar-Blöcke sind notwendig, um das Gehirn während des slicing Verfahrens stabilisieren.
- Media
- machen 200 mL des Mediums Vorbereitung (pH 7,35) bestehend aus 198 mL minimal wesentliche Medium (MEM) und 2 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM). Bereiten Sie die Lösung am Tag der Medien Vorbereitung und speichern Sie es auf 4 ° c
- Vorbereiten 100 mL Kulturmedium bestehend aus 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' ausgewogen Salzlösungen (HBSS), 25 mL (V/V) normales Pferd Serum (NHS), 1 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM), 100 µg Insulin, Glukose 120 mg, 10 mg Streptomycin , 10.000 U Penicillin und 800 µg Vitamin C wie bereits berichtet. Das Medium (37 ° C) warm, stellen Sie den pH-Wert auf pH 7,4 und steriler Filter (0,2 µm Porengröße). Wiederholen Sie den Vorgang (Aufwärmen, pH-Anpassung, etc..) jeden zweiten Tag vor dem Ändern des Mediums. Verwenden Sie das Medium höchstens eine Woche lang bei Lagerung bei 4 ° c
- Füllen einen 35-mm-Petrischale mit Vorbereitung Medium, das Gehirn zu speichern. Legen Sie zwei leere Petrischalen für das Gewebe auf eine Kühlpackung im Arbeitsbereich sammeln.
2. Vorbereitung und Slicing mit einem Vibratome
- Verwendung Gehirne von 7-9 Tage alten Ratten oder 4-5 Tage alte Mäuse für die OHSC Zubereitung nach Stoppini Et Al. 4 nach der Enthauptung von Tieren, die Haut abziehen vom Schädel mit einer Schere.
- Die Klinge von einer feinen Schere in das Foramen Magnum einführen und Öffnen des Schädels durch Schneiden entlang der kaudalen (wieder) rostral (vorderen) Achse. Machen zwei schneidet senkrecht zur ersten, so dass die Schere in Richtung der linken und rechten Ohr bzw. zeigen (" T-Schnitt ").
- Den Schädel öffnen Sie vorsichtig mit feinen Zangen, die Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn zu verletzen. Ein Skalpell (Klingengröße 11) verwenden, um die meisten rostral Teil der vorderen Pole und das Kleinhirn abgeschnitten.
- Mittels Spatel, entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie es vorsichtig in der Petrischale gefüllt mit Vorbereitung Medium ( Abbildung 2). Das Gehirn auf Probenhalter und fixieren Sie es mit medizinischen Cyanacrylat-Klebstoff. Verwenden Sie die Stücke des Nährbodens zur mechanischen Stabilisierung versichern.
- Sezieren des Gewebes horizontal in 350 µm dicken OHSC mit einer gleitenden Vibratome.
- Bewerten die Scheiben optisch unter Verwendung eines binokularen Mikroskops. OHSC von geringer Qualität sofort zu verwerfen. Es ist wichtig, nur diese Segmente mit intakten Cytoarchitecture isoliert aus dem mittleren Teil des Hippocampus (siehe Abbildungen 3 und 4) zwischen den dorsalen und ventralen Hippocampus.
- Zu trennen, der hippocampal Region und dem entorhinalen Kortex mit einem Skalpell (Runde Klingengröße 15; ( Abbildung 3). Die Perforant Weg und entorhinalen Kortex muss bewahrt werden.
- Werden sechs bis acht OHSC aus jedem Gehirn gewonnen. 2-3 Scheiben in einer Zelle Kultur einfügen (Pore Größe 0,4 µm) und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 6-Well Kulturschale mit 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.
- 6-wohlen Teller bei 35 ° C in einer voll feuchte Atmosphäre mit 5 % (V/V) CO 2 brüten und ändern das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag.
Hinweis: Führen Sie Ihre Experimente an 6 Tagen in Vitro (Div). Entzündliche Reaktionen im Zusammenhang mit dem slicing Verfahren verschwinden von Tag 6. In diesem Stadium Mikroglia-Zellen zeigen eine verzweigte Morphologie wieder und synaptische Verbindungen gereift.
3. Bewertung der Qualität der Gewebe
- Fixierung, Kennzeichnung und Visualisierung von degenerierenden Neuronen im OHSC
- nach der Durchführung der Experimente, brüten die OHSC mit 5 µg/mL Propidium Jodid (PI) für 2 h vor der Fixierung, in zu die Kernen der degenerierenden Neuronen beflecken.
Achtung: PI ist karzinogenverdächtig, immer tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe. - Waschen der OHSC mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und befestigen Sie sie mit einer 4 % (V/V) Lösung von Paraformaldehyd (PFA) für 24 h
Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen. - Der OHSC in Einsätzen mit 1 mL PBS waschen und mit einem Ausleger Pinsel, um Scheiben von der Membran zu trennen.
- Kennzeichnen die OHSC mit IB 4 Farbstoff in einer 24-Well-Platte ( Abbildung 5).
- nach der Durchführung der Experimente, brüten die OHSC mit 5 µg/mL Propidium Jodid (PI) für 2 h vor der Fixierung, in zu die Kernen der degenerierenden Neuronen beflecken.
- Durchführung von Tumor Invasion Experimente mit Gewebekulturen beschriftet Einzelzellen
- 24 h vor dem Start eines Experiments, beschriften Sie die Tumorzellen mithilfe der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFDA SE).
- Trennen und zählen die Tumorzellen mit einer Neubauer Kammer.
- Aufschwemmen der Zellen im Medium, 10 µL der Aussetzung der gewünschten Zelle Nummer (normalerweise 50.000 oder 100.000 Zellen) enthält.
- Auftragen 10 µL Zellsuspension auf die Slice-Kultur und die Zellen, für 3 Tage zu erobern.
- Am Ende des Experiments, die Slice-Kulturen mit 4 % (V/V) PFA für 24 h zu beheben, und beschriften Sie die Ko-Kulturen mit PI für ein weiteres 24 h die Cytoarchitecture visualisieren.
Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen. - Ko-Kulturen auf einem Deckglas für weitere Analysen mit Hilfe der Medien Montage montieren.
4. Auswertung der OHSC Experimente
der OHSC mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) zu analysieren. Zur Erkennung von PI beschriftet, degeneriert Neuronen oder die PI mit der Bezeichnung Cytoarchitecture verwenden monochromatisches Licht der Wellenlänge λ = 543 nm und eine Emission Band pass Filter für Wellenlängen λ = 585-615 nm. Für CFDA Tumorzellen oder IB 4 Mikroglia gekennzeichnet, verwenden eine Erregung Wellenlänge von λ = 488 nm. Für beide experimentelle Arten erfassen einen Z-Stapel mit 2 µm Dicke optische Scheiben und für die Auswertung verwendet.
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Representative Results
Neuroprotektion Studien: Zur Bestimmung der neuronalen Schaden, die Anzahl der positiven Kerne PI und IB4 positive Mikroglia in jeder dritten optischen Teil des Granulat-Zellschicht (GCL) von den dentate Gyrus (DG) gezählt wurde. Für Tumor Invasion Experimente wurde die maximale Intensität Z-Projektion des Stapels verwendet für die Berechnung der Fläche von Tumorzellen, als Maßnahme der Invasion und verschiedenen Invasion Muster (Abbildung 6) zu visualisieren.
In der unbehandelten Kontrolle OHSC (CTL) blieben die Neuronen gut erhaltene. In der GCL der DG wurden fast keine PI positiven neuronalen Kernen (Abb. 5A) beobachtet. Auf der molekularen Ebene waren die Mehrheit der Mikroglia-Zellen verzweigt. In der GCL der GD, nur sehr wenige IB4 positive Microglial Zellen (Abb. 5A) erkannt wurden. Nach der Inkubation mit 50 µM N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA) einen starken Anstieg der Zahl PI positiven neuronalen Kerne (Abb. 5 b) und IB4 positive Mikroglia-Zellen (Abb. 5 b) im Vergleich zur Kontrolle OHSC erkannt wurde. Vorgeschädigten OHSC von geringerer Qualität kann durch eine höhere Anzahl von amöboiden Mikroglia und PI positive Zellen in der DG (Abbildung 5) unter Kontrolle Bedingungen identifiziert werden. Behandlung von vorgeschädigten Scheiben mit NMDA führte zur Zerstörung der DG Cytoarchitecture und eine sehr hohe Anzahl von PI positive Todeszellen Übergreifen auf das Hilum und CA3 Region (Abbildung 5).
Tumor Invasion Studien: Scheiben wurden behandelt mit 50.000 Zellen zwei Glioblastom-Zell-Linien U138 (Abb. 6A) und LN229 (Abb. 6 b) für drei Tage. In beiden Fällen die Cytoarchitecture der Scheibe Kulturen blieb intakt und der GD und Cornu Ammonis blieben erhalten. Darüber hinaus Zellinien beide zeigten deutliche Invasion Verhalten. Während U138 Zellen Runde, klar getrennte Tumoren (Abb. 6A) gebildet, LN229 Zellen ein Tumor-Netzwerk innerhalb einzelner Tumor Sphäroide gebaut und waren oft schwer zu unterscheiden. Bei der Betrachtung der Menge der Tumor Masse in Scheibe Kulturen ergab einen höheren Invasivität für LN229 Zellen im Vergleich zu U138 Zellen.
Abbildung 1: Dissektion Werkzeuge und Materialien. Für die Vorbereitung der Slice-Kulturen ist ein passendes Set Dissektion Werkzeuge und Materialien erforderlich, wie gezeigt. Das Set beinhaltet drei Skalpelle mit kleine auswechselbare klingen, einem Spachtel, zwei feine Schere, drei Zangen, einen normalen Pasteurpipette, einer Pasteurpipette ohne Spitze, Agar, Petrischalen, Filterpapier, Kühlpackung, Vorbereitung Medium, und medizinische Cyanacrylat-Klebstoff. Die Dissektion Werkzeuge müssen vor Gebrauch autoklaviert werden und in eine Kunststoff-Paket in einer sterilen Atmosphäre zu halten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Lage der hippocampalen Bildung in der Rattengehirn. Die Hippokampus Formation, gezeigt durch die schwarz gestrichelte Linie ist eine bilaterale Struktur der Hirnrinde und im Thalamus umgeben. Der Hippocampus wölbt sich in das zeitliche Horn des seitlichen Ventrikels. Der Hippocampus ist Bilaminar, bestehend aus Cornu Ammonis (Hippocampus richtige) und die dentate Gyrus (oder dentate Faszie), mit einer Lamina aufgerollt im Inneren des anderen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Visualisierung der Ratte OHSC. Eine ganze Gehirn-Scheibe mit OHSC wird durch ein Fernglas zur Bewertung der Qualität des Gewebes visualisiert. Scheiben werden in eine Petrischale gefüllt mit gekühlten Vorbereitung Medium (A, B) aufbewahrt. Vergrößerung des Gehirns Slice. Die intakte Hippocampus (HC) und entorhinalen Kortex sind sichtbar auf der linken und rechten Seite des Bildes (C). OHSC ist getrennt vom Rest des Gehirns. Das Granulat Zellschicht (GCL) der GD, Cornu Ammonis Unterfeldern CA1 und CA3, der Hilus-Region (HI), dem entorhinalen Kortex (EG) und die molekulare Schicht (ML) sind deutlich zu unterscheiden (D). C, D: Maßstabsleiste = 4 mm.
Abbildung 4: Zeit abhängige Änderungen in OHSC.
Direkt nach der Zubereitung beginnen Mikroglia und Astrozyten glial Narbe zu bilden. Von 1-3 Tage in Vitro (Div) Gliosis und Ödem Bildung beobachtet. Die Schichtung der hippocampal Anordnung und DG ist nicht mehr sichtbar. Auf zellulärer Ebene OHSC auf 5 Div eine Reduktion in der Anzahl der aktivierten Zellen anzeigen. Bei 6 Div fast kein Ödem vorliegt, die Slice ist dünner und Bereiche in der intrinsischen neuronale Schaltkreise haben überlebt. OHSC kann nun für die Experimente verwendet werden. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bewertung der Qualität der Gewebe durch CLSM. CLSM ergab, wird eine gute neuronale Erhaltung in der nicht-lesioned Steuerung OHSC (CTL) beobachtet. Praktisch keine PI positiven neuronalen Kernen (rot) und nur ein paar IB4 positive Mikroglia-Zellen (grün) in das Granulat Zellschicht (GCL) der GD (A) befinden. Im Gegensatz zu nicht-lesioned OHSC ist eine starke Zunahme der Zahl PI und IB4 positive Zellen in die GCL NMDA-lesioned OHSC (B) sichtbar. Bitte beachten Sie die Morphologie der GD, aktivierte Mikroglia-Zellen und eine große Anzahl von PI positive Kerne in vorgeschädigten OHSC (C, D). Balken = 50 µM. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Visualisierung der Tumorinvasion durch CLSM. PI (in rot) angewendet nach der Fixierung Etiketten die Cytoarchitecture OHSC, während CFDA (in grün) die Tumorzellen, die Invasion der Scheibe zeigt. Die Invasion-Prozess der U138 Zellen wird nach drei Tagen der Invasion Zeit visualisiert. Einzelnen Tumor Sphäroidesind deutlich zu unterscheiden (A). Im Gegensatz dazu bildeten Glioblastom-Zelllinie LN229 ein Tumor-Netzwerk (B). Balken = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich.
The most wichtige Schritte für eine erfolgreiche Vorbereitung und Kultivierung sind: (1) arbeiten unter sterilen Bedingungen, (2) bereiten Sie die Medien korrekt, unter Berücksichtigung von Temperatur und pH-Wert, und (3) die notwendige manuelle Geschicklichkeit bei der Handhabung der OHSC entwickeln.
Merkmale der OHSC
Wegen der unveränderten Morphologie der neuronalen Zellen und ihre in Vivo-wie Organisation, sind die Scheiben organotypischen berufen. Die OHSC bestehen aus dem Stratum Pyramidale und Stratum Granulosum, bestehend aus pyramidenförmigen Cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3) und DG körnigen Zellen. Teile des Hippocampus sind höchst bestellt und die afferenten Faser Projektionen kündigen in getrennten Schichten nicht überlappende gewissermaßen. Die Efferences zwischen entorhinalen Kortex (der Perforant Weg), DG, CA3 und CA1 Neuronen intakt bleiben nach der Zubereitung und funktionell ähnlich jenen in Vivozu Verhalten. Wie bereits gezeigt, Entwicklung von dendritischen Bäume Synapse Bildung und Netzwerk-Aktivitäten der körnigen Zellen in OHSC sind vergleichbar mit akuten Scheiben gewonnenen Zeit abgestimmt Kontrollen14,15,16.
Oligodendrozyten und Astrozyten wurden in OHSC von Licht- und Elektronenmikroskopie untersucht. Oligodendrozyten zeigen eine organotypischen räumliche Verteilung, einschließlich der morphologischen Subtypen17,18. Außerdem werden die Axone Markhaltige während der ersten zwei Wochen in Vitro. Einige Autoren postuliert, dass die Schicht bestimmte Lokalisierung von Astrozyten ist abwesend im Slice-Kulturen und glauben, dass die Astrozyten keine vollständige Reifung in Vitroerreichen. Dieser Aspekt kann nicht vollständig beantwortet werden, da spezifische Marker für alle Schritte der Aktivierung der Astrozyten noch1,19,20 fehlt.
In den ersten 3 Tagen nach der Zubereitung Mikroglia-Zellen reagieren mit Migration und Proliferation und sammeln sich an der Scheibe-Oberfläche, wo sie die glial Narbe zusammen mit Astrozyten bilden. Alle Zellen scheinen in einem Zustand stark aktiviert werden. Jedoch in den inneren Schichten der OHSC und zwischen 3 und 6 Div ändern Mikroglia-Zellen ihrer amöboiden Morphologie zu einer weit verzweigten, gekennzeichnet durch zelluläre Kleinkörper und langen verzweigten feinen zytoplasmatischen Vorsprünge verlängert in alle Richtungen21 ,22.
Ähnlichen Ausdruck und Verteilung von Glutamat-Rezeptoren wurden in adulten Geweben und OHSC2,23berichtet. Die Häufigkeit der synaptischen Ströme, die Miniatur synaptische Ströme und die Häufigkeit der GABAergen Strömungen in OHSC (7, 14 und 21 Div) nicht signifikant verschieden im Vergleich zu akuten Vorbereitungen an postnatalen Tagen 14 oder 15 bzw. sind. Im Gegensatz dazu ist die Frequenz der glutamatergen Signale in OHSC als akute Scheiben15höher.
Vergleich der verschiedenen Zubereitungsmethoden
Die Vorbereitung der embryonalen und frühe postnatale Gewebe ist ganz einfach, weil gute Zelle Überleben Rate in Vitro. Dabei ist zu berücksichtigen, dass in diesem frühen Stadium der neuronalen Zellen noch wandernde und aktiv, was zu einem Verlust des organotypischen Organisation der Scheiben1sind. Nach postnatale 7-9 Tagen sind einige synaptischen Verbindungen bei Ratten gegründet. Während der nächsten 2 bis 3 Wochen in Vitro Reifen die Synapsen13. Einer der Vorteile des vorgestellten Modells ist seine Beständigkeit gegen mechanische Trauma bei der Vorbereitung und seine hohe Plastizität aufgrund des Alters der Tiere (7-9 Tage)1,14,24. Es muss erwähnt werden, dass die Scheiben sehr empfindlich auf mechanische Manipulationen sind durch Instrumente. Sogar der falsche Winkel des Schneidens verursachen Steigung Schneiden von neuronalen Fasern für Anterograde oder retrograde neuronalen Tod verantwortlich. Die Vorbereitung der Slice-Kulturen von erwachsenen Tieren für langfristige Zwecke ist anspruchsvoll und noch nicht etabliert. Diese OHSC zeigen eine massive Degeneration kurz nach der Herstellung vermutlich durch den Verlust der Plastizität1. Dennoch gibt es eine starke Notwendigkeit eine Vorbereitung Methode, für die Arbeit mit Erwachsenen Scheiben.
Für verschiedene Zubereitungsmethoden wird das frisch ausgeschnittene Gewebe bis zu einer Dicke von 300-400 µm, mit einem Gewebe Chopper isoliert Hippocampus geschnitten. Diese schnelle Methode kann häufig weit verbreitete Gewebeschäden führen. Entscheidend für die Qualität der OHSC sind ihre Enddicke und die Zeit, die sie in Vitrogehalten werden. Die besten Ergebnisse mit der höchsten Überlebensraten wurden für 300-400 µm dicke Scheiben erzielt. In dickere Scheiben degenerieren die oberen Schichten während der Kulturzeit wegen Verbreitung Einschränkungen1. Je nach der wissenschaftlichen Fragen OHSC eingesetzt werden, entweder direkt nach der Zubereitung oder nach einigen Tagen in Kultur. Daher wurden im Laufe der Jahre mehrere Anbautechniken, wie die Tuchwelle Technik1,13 oder statische Slice Techniken4gegründet.
Aus verschiedenen Zubereitungsmethoden sind wir überzeugt, dass mit Hilfe der Schnittstelle Technik zusammen mit einem Vibratome das präziseste und zuletzt schädlich Verfahren ist für die Zubereitung von OHSC bis heute. Diese Methode wird weiter verbessert durch den Einsatz von porösen Membranen. OHSC halten ihre 3D-Struktur, monatelang morphologisch und funktionell intakt bleiben und während der Kultivierung Zeitraum25visuell ausgewertet werden können.
Anwendungen
OHSC kann aus Wildtyp und transgenen Tieren14,26vorbereitet werden. Sie monatelang überleben und bieten Optionen für langfristige Experimente12,13. OHSC werden verwendet, um physiologische, pharmakologische, morphologische und entwicklungspolitische Fragen14,27 unter Adresse hoch standardten Erkrankungen wie chronische Anwendung von Neurotherapeutics oder Stammzell-Therapie26,27,28. Die Untersuchung der Entwicklungsaspekte der neuronalen Verbindungen oder Prozesse im Zusammenhang mit synaptischen Übertragung, synaptische Plastizität, Auswirkungen von chronischen Epilepsie der dendritischen Dornen der Pyramidenzellen oder Neurogenese alle darstellen zusätzliche Felder 29,30,31,32.
Die primäre exzitatorische Neurotransmitter Glutamat und dem Ionotropic Glutamat-Rezeptoren spielen eine zentrale Rolle im Excitotoxizität. Excitotoxic Läsionen auftreten, bei neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Erkrankung, HIV Neurotoxizität, Schädel-Hirn-Verletzungen und Reparatur Mechanismen14,24. Anwendung der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) oder Kainic Säure zu selektiven OHSC Mimik und Region bestimmte neuronale Zelle Tod26,28,33 ,34. Darüber hinaus Gliazelle Reaktion auf neuronalen Verletzungen z.B., Mikroglia Migration und Phagozytose in OHSC bisher analysierten3,35. Der Einfluss der Mikroglia während der Läsion kann durch pharmakologische Depletion dieser Zellen durch das Bisphosphonat Clodronat36vorhergesagt werden.
Eine weitere wichtige Anwendung entsteht imitiert in Vivo Bedingungen für Untersuchungen der Tumorinvasion OHSC verwenden. Sphäroide von Gliom Zelllinien gebildet waren in der Lage, Invasion der Slice-Kulturen, ein Phänomen, das überlappende37Arten war. Die diffusen Infiltration Muster der verwendeten Zelllinien ähnelte die beobachteten Muster in Vivo37. Darüber hinaus primären Glioblastom Sphäroide OHSC eingepflanzt gehalten ihre Invasion potenzielle und Stammzellen Charakter über mehrere Tage in-vitro-38. Das Modell ermöglicht die Beobachtung der Invasion Muster und Interaktionen zwischen neuronalen Gewebe und Tumorzellen, die denen in Vivo37,38entsprechen. Im Vergleich zu Kollagen oder Gel scheint auf der Grundlage Modelle (z.B.)39, die Verwendung von OHSC günstiger für Analysen zur Metastasierung und Tumor Invasion im Gehirn. Das physiologische Milieu, einschließlich der neuronalen und glialer Zelltypen und extrazelluläre Matrix bleibt intakt.
Darüber hinaus OHSC ermöglichen direkte Interaktionen zwischen einzelnen Tumorzellen und Hirngewebe unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Beispielsweise fanden sich zur Verbesserung der Funktionen von Tumorzellen, das Gehirn zu betreten, durch die Bildung von leitender Strukturen für Invasion35Microglial Zellen.
Darüber hinaus kann die Wirkung der vorübergehende und dauerhafte zellulären Veränderungen auf Invasion Prozesse analysiert werden. Eine stabile Expression der Metastasierung assoziiert Doppelpunkt Krebs-Gen 1 (MACC1) in Gliom Zellen wurde eine erhöhte Proliferation und anschließende Invasion40zugeordnet. Die vorübergehende Änderung der Zelle Steifheit in Glioblastom Zelllinien wurde in direktem Zusammenhang mit der invasiven Eigenschaften der Zelle Linien41. OHSC und Tumor Co Zellkulturen können somit potenziell für Drogentests, Reproduktion von klinischen Beobachtungen und Modell und Bild Tumorinvasion unter sehr kontrollierten und standardisierten Bedingungen verwendet werden.
Nach Studium der primären Zellkulturen OHSC sind die logische nächste Wahl für die Durchführung von Experimenten in ein komplexes System, in-Vivo -Bedingungen anzugleichen. Ein weiteres ist Interesse an Hirnschnitten das Screening von möglichen therapeutischen Drogen vor der Prüfung in Vivo. Gehirnscheiben ermöglichen Überwachung und Verletzungen unter Beobachter Kontrolle und ohne tierische Operation imitiert. Bis zu 8 OHSC erzielt werden und die Anzahl der notwendigen Tiere wird deutlich reduziert. Es ist möglich, die Ergebnisse in das gleiche Tier unter ähnlichen Einstellungen jedoch mit verschiedenen oder mehrere Bedingungen zu erhalten. OHSC ist so ein mächtiges Werkzeug, um unter anderem morphologische, zelluläre und molekularen Veränderungen beobachten während der Verletzung Zeit, Entwicklung von Folgeschäden und Tumor Verbreitung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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