Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

doi: 10.3791/55362 Published: March 1, 2017

Summary

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Abstract

Microfabricated cellulaire microarrays, die bestaan ​​uit contact gedrukt combinaties van biomoleculen op een elastisch hydrogel oppervlak te strak, high-throughput systeem ontworpen om het effect van array biochemische signalen op celdifferentiatie. Recente inspanningen met behulp van mobiele microarrays hebben hun nut voor combinatorische studies waarin veel micro-omgeving factoren worden gepresenteerd in parallel aangetoond. Echter, deze pogingen voornamelijk gericht op het onderzoeken van de effecten van biochemische signalen op cel reacties. Hier presenteren we een cel microarray platform met instelbare materiaaleigenschappen gaan zowel celdifferentiatie door immunofluorescentie en biomechanische cel substraatinteracties door trekkracht microscopie. Hiervoor hebben we twee verschillende formaten gebruikmaking polyacrylamide hydrogels variërende elasticiteitsmodulus vervaardigd aan beide microscoopglaasjes of glazen bodem petrischalen ontwikkeld. Wij bieden best praktijken en het oplossen van problemen voor de fabricage van microarrays op deze hydrogel substraten, de daaropvolgende celcultuur op microarrays, en de overname van gegevens. Dit platform is zeer geschikt voor toepassing bij onderzoek naar biologische processen die zowel biochemische (bijvoorbeeld extracellulaire matrix compositie) en biofysische (bijvoorbeeld substraat stijfheid) signalen kunnen aanzienlijke spelen, snijdende rollen.

Introduction

Interacties tussen cellen en micro-omgeving rondom factoren mediëren een grote verscheidenheid van biologische processen in ontwikkeling, homeostase en ziekte pathogenese 1, 2, 3, 4. Deze micro-omgeving interacties omvatten afgifte van oplosbare factoren aan cellen, cel-matrix binding en cel-cel interacties via ligand-receptorbinding. Naast bovengenoemde biochemische overwegingen biofysische parameters, zoals substraat mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld modulus, porositeit) en celvorm en bijbehorende downstream mechanotransductie steeds erkenning gekregen als belangrijke mediatoren van celdifferentiatie 5, 6, 7, 8, 9 10. Signalen als gevolg van deze micro-omgeving interacties dienen als input voor gen-netwerken en signaalwegen. Bovendien zijn deze cel-intrinsieke componenten ook feedback aan de micro-omgeving door factoren en matrix-afbrekende enzymen, het invullen van een complex mederegulerende loop tussen cel-intrinsieke genetische programma en cel-extrinsieke factoren micromilieu 5, 11, 12.

Het gebruik van technische systemen voor gecontroleerde weergave van micro-omgeving factoren is nuttig gebleken in een aantal verschillende contexten 13, 14, 15. Microfabricated systemen hebben vooral nauwkeurige ruimtelijke patronen van eiwitten en cellen evenals zeer parallel verlopende analyse vergemakkelijkt via miniaturisatie 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cel microarrays vertegenwoordigen zo'n microfabricated systeem waarin combinaties van biomoleculen contact gedrukt op een elastische polyacrylamide hydrogel substraat 23, 24, 25. De opname van cel-hechtende componenten (namelijk matrixeiwitten) maakt aanhoudende celadhesie en cultuur microarrays, die vaak gevolgd wordt door stroomafwaartse analyses via immunocytochemie en fluorescerende reporters. Cel microarrays zijn productief gericht op het bereiken van een beter begrip van de levercel fenotype 23, 26, neurale voorloper differentiatie 27, Mammary progenitor lot besluiten 28, embryonale stamcel onderhoud / differentiatie 23, 29, 30, 31 longkanker metastase en therapeutische respons in 32 melanoom. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van mobiele microarrays voor de rol van extracellulaire matrix (ECM) eiwitsamenstelling in endoderm specificatie 33, leverprogenitor- differentiatie 34, 35 en longtumorcellijnen geneesmiddelrespons 36. In deze werken, hebben we ons gericht op de uitbreiding van de combinatorische mogelijkheden van de array-platform en het verkennen van de snijpunten van de cel-intrinsieke signalering met extracellulaire matrix compositie en biomechanica. Daarnaast hebben we biofysische uitlezingen uitgevoerd in deze array platform de mogelijkheid bieden om kwantitatief karakterize de rol van de cel contractiliteit in differentiatie verwerkt 35. Om dit te doen, geïntegreerd we trekkracht microscopie (TFM) met een mobiele microarrays om high-throughput evaluatie van de cel gegenereerd tractie mogelijk te maken. TFM is een algemeen gebruikte methode om cellen gegenereerde aandrijfkrachten meten en heeft belangrijke inzichten over de coördinatie van eencellige en weefsel functie op de samenstelling en biomechanica van de lokale micro-omgeving 37, 38, 39, 40 voorzien. Zo, een combinatie van TFM met mobiele microarrays zorgt voor een high-throughput-systeem voor het meten van de belangrijkste, fysiologisch relevante biofysische parameters.

De cel microarrayplatform hier beschreven bestaat uit vier delen: vervaardiging van polyacrylamide substraten fabricage van arrays, celkweek en assay uitlezen en analyseren van gegevens. ZienFiguur 1 een schematische samenvatting van de eerste drie experimentele punten; zie figuur 2 voor een schematisch overzicht van het laatste deel met een focus op de analyse van immunofluorescentie gegevens. Om de cel microarrayplatform studies van biomechanische cel- substraatinteracties passen, gebruikten we polyacrylamide substraten afstembare Young's modulus maar vergelijkbaar porositeit, per Wen et al. 41. Om TFM metingen van krachten uitgeoefend door cellen op hun substraat mogelijk voerden we een glazen bodem petrischaal format naast de dikke objectglaasjes vaak gebruikt door andere groepen. Zo, deze cel microarray platform is in staat om parallelle metingen van celdifferentiatie via immunofluorescentie op microscoopglaasjes en cel gegenereerde krachten via TFM op aparte glazen bodem gerechten. We hebben ook verschillende verbeteringen aangebracht op de analytische courante methode met een mobiele microarrays. specifically, in plaats van parametrische Z-scoring van de totale eiland intensiteit, meten we eencellige intensiteit en toe te passen kwantiel normalisatie om rekening te houden met niet-normale verdelingen en meer nauwkeurig te beschrijven cellulaire gedrag. Wij geloven dat deze verbeteringen te verstrekken bijzonder nut in de richting van onderzoek naar biologische processen waarin zowel biochemische en biofysische signalen spelen significant, snijdende rollen. Verder onze analytische verbeteringen maken de toepassing van cel microarrays studies van diverse cellulaire functies waarvoor eencellige en populatie niveau gedrag verschillen.

Protocol

1. Fabricage van Polyacrylamide Substrates

  1. Clean glassubstraten - hetzij standaard microscoop dia's voor endpoint immunofluorescentie of glas-bodem 35 mm petrischaaltjes voor TFM - met het oog op een optimale polyacrylamide hydrogel fabricage en integriteit te waarborgen tijdens de celcultuur. Als alternatief gebruik pre-gereinigd glassubstraten.
    1. Dompel glassubstraten in% v 0.25 / v Triton X-100 in gedestilleerd water (dH 2 O). Plaats substraten op een orbitale schudder gedurende 30 min.
    2. Verwijder Triton X-100-oplossing en spoel substraten 5 keer met dH 2 O. Laat substraten ondergedompeld in de laatste spoeling en leg ze op een orbitale schudder gedurende 30 min.
    3. Verwijderen dH 2 O en dompel substraten in aceton. Plaats substraten op een orbitale schudder gedurende 30 min.
    4. Verwijderen aceton en dompel substraten in methanol. Plaats substraten op een orbitale schudder gedurende 30 min.
    5. Verwijderen methanol en spoel substraten 5 maal met dH <sub> 2 O. Dompel substraten in 0,05 N NaOH en leg ze op een orbitale schudder gedurende 1 uur.
      LET OP: NaOH is zeer bijtend en kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.
    6. Verwijderen NaOH en spoel substraten 5 maal met dH 2 O. Met gefilterde perslucht substraten drogen en bakken bij 110 ° C op een hete plaat tot het droog (5 - 15 min). Gereinigde substraten kan onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur.
  2. Silaniseren schone glassubstraten met het oog op bevestiging van de polyacrylamide hydrogel te waarborgen.
    1. Dompel schone glazen substraten in vers bereide 2% v / v 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylaat (3-TPM) in ethanol. Plaats substraten op een orbitale schudder gedurende 30 min.
      LET OP: 3-TPM is een brandbare vloeistof. Verwijderd houden van warmte, vonken, open vuur en hete oppervlakken en alleen te gebruiken in een zuurkast.
    2. Verwijder 3-TPM-oplossing en dompel substraten in Ethanol. Plaats substraten op een orbitale schudder gedurende 5 min.
    3. Gebruik gefilterde perslucht op de substraten drogen en bakken bij 110 ° C op een hete plaat tot het droog (5-15 min). Gesilaniseerde substraten kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 maand.
  3. Optie 1: Fabriceer polyacrylamide hydrogels op gesilaniseerde microscoop dia's voor endpoint immunofluorescentie.
    1. Bereid een pre-polymeeroplossing in dH 2 O het gewenste acrylamide / bisacrylamide percentage (w / v) verhouding om substraten te vervaardigen met moduli van 4 kPa (4% acrylamide, 0,4% bisacrylamide), 13 kPa (6% acrylamide, 0,45 Young % bisacrylamide) of 30 kPa (8% acrylamide, 0,55% bisacrylamide) en dergelijke porositeit, per Wen et al. 41. Vortex oplossing totdat helder en filter met een 0,2 um spuit. Prepolymeer oplossingen gedurende 3 maanden bewaard bij 4 ° C.
      LET OP: Blootstelling aan acrylamide of bisacrylamide kan leiden tot acute toxiciteit, Neurotoxicity, en irritatie. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.
    2. Bereid een fotoinitiator oplossing van 20% w / v Irgacure 2959 in methanol. Deze foto-initiator oplossing kan niet worden opgeslagen en worden vers bereid telkens.
    3. Meng de pre-polymeer en fotoinitiator oplossingen in een 9: 1 (prepolymeer: ​​fotoinitiator) ratio. Optioneel ontgassen met een vacuümkamer gedurende 15 minuten te bellen te verwijderen.
    4. Plaats gesilaniseerde dia's in een glas drogen dienblad en pipet 100 pi van 9: 1 pre-polymeer: ​​foto-initiator oplossing op elke dia. Voorzichtig bedekken elk glaasje met een mm dekglaasje 22 × 60 terwijl het vermijden van het ontstaan ​​van zeepbellen. Merk op dat het dekglaasje verhindert remming van de polymerisatiereactie door zuurstof.
    5. Plaats droogkamer plaatst in een UV crosslinker en bloot objectglaasjes 365 nm UV A gedurende 10 minuten (4 W / m 2). Optimaliseer polymerisatietijd als nodig. Langere blootstelling risico moeite verwijderen van het dekglaasje te wijten aan overpolymerization. Kortere blootstelling risk underpolymerization en lage hydrogel stabiliteit.
    6. Dompel hydrogels in dH 2 O 5 min. Verwijder dekglaasjes met een scheermes, het verzorgen van de gepolymeriseerde hydrogels niet te beschadigen.
    7. Laat hydrogels in dH 2 O bij kamertemperatuur gedurende 1-3 d, veranderen dH 2 O dag. Dehydrateren hydrogels bij 50 ° C op een hete plaat tot het droog (15-30 min) en bewaar bij kamertemperatuur maximaal 3 maanden.
  4. Optie 2: Fabriceer TL-bead bevattende polyacrylamide hydrogels op gesilaniseerde 35 mm glazen bodem petrischaaltjes voor live-evaluatie van de cel-substraat interacties met behulp van TFM.
    1. Ultrasone trillingen een voorraadoplossing van 1 urn fluorescerende kralen voor 15 min dispergeren.
    2. Bereid een pre-polymeeroplossing in dH 2 O het gewenste acrylamide / bisacrylamide percentage (w / v) verhouding om substraten te vervaardigen met moduli van 4 kPa (4% acrylamide, 0,4% bisacrylamide), 13 kPa (6% acrylamide, 0 Young0,45% bisacrylamide) of 30 kPa (8% acrylamide, 0,55% bisacrylamide) en dergelijke porositeit, per Wen et al. 41. Vortex oplossing totdat helder en filter met een 0,2 um spuit. Prepolymeer oplossingen gedurende 3 maanden bewaard bij 4 ° C.
      LET OP: Blootstelling aan acrylamide of bisacrylamide kan leiden tot acute toxiciteit, neurotoxiciteit, en irritatie. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.
    3. Voeg fluorescerende kralen om de prepolymeer oplossing bij een eindconcentratie van 0,2% v / v en vortex te mengen.
    4. Bereid een fotoinitiator oplossing van 20% w / v Irgacure 2959 in methanol. Deze foto-initiator oplossing kan niet worden opgeslagen en worden vers bereid telkens.
    5. Meng het voorpolymeer / bead fotoinitiator en oplossingen in een 9: 1 (prepolymeer / bead: fotoinitiator) ratio. Optioneel ontgassen met een vacuümkamer gedurende 15 minuten te bellen te verwijderen.
    6. Plaats gesilaniseerde 35 mm glazen bodem petrischalen in een glas drogen dienblad en pipet 20 pi van 9: 1 prepolymeer / bead: fotoinitiator oplossing op het midden van elke schaaltje. Voorzichtig bedekken elke dia met een 12 mm ronde dekglaasje terwijl het vermijden van het ontstaan ​​van zeepbellen. Merk op dat het dekglaasje verhindert remming van de polymerisatiereactie door zuurstof.
    7. Om de fluorescerende korrels te verdelen op het oppervlak van de hydrogel, keren de schotels en verlaat deze bij kamertemperatuur gedurende 20 min, per Knoll et al. 42.
    8. Terwijl omgekeerd, bloot gerechten tot 365 nm UV A gedurende 10 minuten (4 W / m 2). Optimaliseer polymerisatietijd als nodig. Langere blootstelling risico moeite verwijderen van het dekglaasje te wijten aan overpolymerization. Kortere blootstelling risico underpolymerization en lage hydrogel stabiliteit.
    9. Hydrogels onderdompelen in 0,1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer en laat bij kamertemperatuur in het donker overnacht. dekglaasjes verwijder voorzichtig met een scheermes, zorg ervoor dat u de polyme beschadigenrized hydrogels.
    10. Dehydrateren hydrogels bij 50 ° C op een hete plaat tot het droog (15-30 min). Hydrogels kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur in het donker gedurende 3 maanden.

2. Fabricage van Arrays

  1. Bereid buffers biomoleculen drukken. Gebruik de grafische buffer geschikt is voor de biomoleculen van belang. Groeifactor (GF) afdrukken buffer algemeen geschikt voor andere klassen van moleculen, zoals cel-cel liganden.
    1. Tot 2 x ECM eiwit printing buffer te bereiden, voeg 164 mg natriumacetaat en 37,2 mg van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aan 6 ml dH 2 O. Vortex en incubeer bij 37 ° C grondig te solubiliseren. Na solubilisatie voeg 50 ul voorverwarmde Triton X-100 en 4 ml glycerol. Vortex en incubeer bij 37 ° C opnieuw solubiliseren. Voeg 40-80 ul ijsazijn, titreren om de pH op 4,8. 2 × ECM eiwitten printing buffer kan worden opgeslagen bij 4° C gedurende 1 maand.
      LET OP: Azijnzuur is ontvlambaar en bijtend. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.
    2. Tot 2 × GF printing buffer te bereiden, voeg 105,5 mg natriumacetaat en 37,2 mg EDTA tot 6 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex en incubeer bij 37 ° C grondig te solubiliseren. Na solubilisatie voeg 100 mg 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS) en 4 ml glycerol. 2 × GF eiwit printing buffer gedurende 1 maand opgeslagen bij 4 ° C.
  2. Bereid bron plaat.
    1. In een 384-well V-bodem microplaat, combineren gelijke volumes van 2 x printing buffer elk biomolecuul oplossing dubbele doelconcentratie.
      Opmerking: Een geschikte doelconcentratie voor de meest voorkomende ECM eiwitten is 250 ug / ml terwijl doelconcentraties voor andere array factoren variëren afhankelijk van retentie in de hydrogel en biologische functie. Het totale volume in elk putje kan wordenzo laag als 5 pi en hoeven niet meer dan 15 pi. Naast het biomolecuul combinaties van belang omvatten een fluorescente merker bekleed teneinde stroomafwaartse beeldanalyse vergemakkelijken. Met rhodamine geconjugeerd dextran (2,5 mg / ml).
    2. Meng elk putje grondig door pipetteren, zorg ervoor dat u bellen te genereren. Centrifugeer de bron microplaat gedurende 1 min bij 100 xg. Fabriceren microarrays gebruikt bronplaten bereid op dezelfde dag en bewaard bij 4 ° C totdat microarray fabricage.
  3. Clean pennen volgens de instructies van de fabrikant voor elke microarray fabricage run. Laad schoon pins direct in de printkop van de microarrayprinter.
  4. Bereid microarrayprinter en programma via software van de fabrikant. Hoewel de onderstaande stappen zijn deels het concrete microarrayprinter hier gebruikt, de werking van de meeste microarrayers vergelijkbaar.
    1. Schakel de bevochtiger, past het setpoint tot 65% RV (niet-condensing), en wacht tot de rheometer overeenkomt met het setpoint. Plaats de bron plaat in de juiste adapter.
    2. Dehydrateren hydrogel substraten bij 50 ° C gedurende 15 minuten en plaats in de betreffende adapter. De microarrayprinter heeft adapters voor zowel de microscoop dia's en microplaten. Voor arraying glazen bodem 35 mm petrischaaltjes, laadt de gerechten in een 6-well microplaat en plaats de microplaat in de microplaat adapter op de Arrayer.
    3. Pas de parameters van het programma om nauwkeurig de layout van de bronplaat, array ontwerp, en de gewenste vorm (bijvoorbeeld microscoopglaasje of microplaat met 35 mm petrischalen). Omvatten wassen stappen met behulp van water en dimethylsulfoxide (DMSO) tussen elke voorwaarde om carry-over en kruisbesmetting te voorkomen.
    4. Start serie fabricage, het controleren van niet minder vaak dan een keer per uur dat de luchtvochtigheid niet minder dan 65% RH (zonder condensatie) is gedaald en dat de pennen niet verstopt zijn. Als de humidity onverwacht gedaald, pauzeren rangschikken van de luchtbevochtiger te vullen en duidelijk bijbehorende pijpen van condensatie. Als de pennen verstopt, pauzeren rangschikken van de pennen reinigen of anderszins vervangen voorgereinigd pins. Merk op dat het mogelijk array meerdere soorten biomoleculen sequentieel op dezelfde substraten voldoende droogtijd (dwz 4 uur tot 's nachts).
    5. Zodra het programma is voltooid, plaatst gefabriceerd arrays in een dia doos of microplaat afgedekt met aluminiumfolie bij kamertemperatuur en 65% RH (zonder condensatie) gedurende de nacht. Merk op dat het nodig kan zijn array kwaliteit en behoud evalueren middels algemene eiwitvlekken of immunofluorescentie; zie Brafman et al. voor meer informatie 25.

3. Cel Cultuur en Assay uitlezing

  1. De dag na de fabricage, plaatst gekleed substraten in 4-chambered gerechten (microscoop slides) of 6-well microplaten (petrischalen) en onder te dompelen in 1%v / v penicilline / streptomycine in PBS; gebruik maken van 4 ml voor dia's en 3 ml voor gerechten. Blootstellen aan UV C gedurende 30 minuten. Exchange penicilline / streptomycine oplossing voor celkweek media.
  2. Verzamelen en tellen cellen. Zaad op arrays bij 500 × 3-2 oktober x 10 6 cellen / matrix op 4 ml per microscoop glijbaan en 3 ml per 35 mm petrischaal. Incubeer matrix kweken bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 - 24 h of tot de vorming van goed bevolkte cel eilanden. Pas zowel zaaien dichtheid en de tijd die nodig is voor uw cellen en specifieke toepassing. Underseeding (dat wil zeggen, lage dichtheid of zaaien tijd) kan leiden tot een slechte reeks bevolking en scheef biologische uitkomsten. Doorzaaien (dat wil zeggen, een hoge dichtheid of zaaien tijd) kan leiden tot een verminderde reeks integriteit te wijten aan het eiland onthechting.
  3. Na aftrek voor de vorming van cel-eilanden, wassen reeks culturen tweemaal met voorverwarmd media voor celkweek; weer gebruik maken van 4 ml voor dia's en 3 ml voor gerechten. optionally passende controles en behandelingen (bijvoorbeeld kleinmoleculige remmers, groeifactoren, enz.) van belang zijn voor de biologische systeem te installeren. Verander het medium van de arrays elke 1-2 d om de concentratie van elke behandeling handhaven. Evalueer cel marker expressie en celfunctie door immunofluorescentie of cel-substraat interacties door TFM binnen 1-5 d initiëren reeks culturen - zie Optie 1 en Optie 2 hieronder.
  4. Optie 1: Voer eindpunt immunofluorescentie. Merk op dat immunofluorescentie van sommige eiwitten strengere permeabilisatie nodig toepassing van methanol, ethanol of HCl. Vanwege mogelijke schade aan arrays, evalueren en optimaliseren elke permeabilisatie protocol voor gebruik in grotere schaal experimenten.
    1. Aspiraat celkweekmedia van matrix objectglaasjes in 4-chambered gerechten en voeg 4 mL / slide vers bereide 4% v / v paraformaldehyde (PFA) in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: Exposure aan PFA kan leiden tot acute toxiciteit en kan ook irriteren of roesten huid op contact. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming en alleen te gebruiken in een zuurkast.
    2. Aspireren PFA oplossing en was elke dia 3 keer met 4 ml PBS. Op dit punt kunnen de gefixeerde glaasjes gedurende 1 week bewaard bij 4 ° C. Het is echter raadzaam om ze verder immunokleuring en montage op dezelfde dag als de vaststelling teneinde matrix integriteit te waarborgen.
    3. Aspireren PBS en voeg 4 mL / dia van 0,25% v / v Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Aspiraat Triton X-100 oplossing en was elke dia 3 keer met 4 ml PBS. Voeg 4 mL / dia van 5% v / v serum afgestemd op de soort van het secundaire antilichaam (bijvoorbeeld ezel serum ezel secundaire antilichamen) in PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    5. Verwijder zorgvuldig de blokkerende oplossing van elke dia. Voeg 500 ul / dia van primair antilichaam verdund in 5% v / v in PBS. Deze hoeveelheid is voldoende om arrays zowel 1 uur incubatie bij kamertemperatuur en overnacht incubaties betrekking op 4 ° C.
    6. Was elke reeks slide 3 keer met 4 ml PBS. Verwijder zorgvuldig de laatste wassing en voeg 500 ul / dia van het geschikte secundaire antilichaam verdund in 5% v / v in PBS.
    7. Was elke reeks slide 3 keer met 4 ml PBS. Was kort met dH 2 O voordat zorgvuldig te verwijderen serie dia's uit de oplossing behulp van een tang. Gebruik een laboratorium tissue naar Wick of droge resterende dH 2 O.
    8. Pipetteer 100 ul van montage oplossing met DAPI over de glijbaan, terwijl visueel de bevestiging van een volledige dekking van de gehele array.
    9. Plaats een 22 × 60 mm dekglaasje over de glijbaan te monteren. Sluit de randen van het dekglaasje met duidelijke nagellak. Bewaren in het donker bij 4 ° C tot beeldvorming, niet eerder dan de volgende dag.
    10. Afbeelding hele arrays met behulp van een microarray scanner of omgekeerde fluorescentiemicroscoop equipped met een robot stadium. Microarray scanners bieden een snellere uitlezing, maar kan Cy3- of Cy5-compatibele fluoroforen nodig en zijn vaak van beperkte resolutie aan de orde van enkele cellen (dat wil zeggen, 1-10 pm). Fluorescerende microscopen bieden de mogelijkheid om een ​​verscheidenheid aan fluorescerende kanalen en hogere resolutie (<1 urn, 100 x ~ totale vergroting) maar geven langzamer uitlezing afhankelijk van de kwaliteit van de robot podium en vergroting / doel.
    11. Vastgelegde beelden opslaan van hele arrays van beide methoden als TIFF-bestanden om data compressie of verlies in verband met andere bestandsformaten (bijv, JPG) te voorkomen.
  5. Optie 2: Live optreden evaluatie van cel-substraat interacties met behulp van TFM.
    1. Bereid een oplossing van 1% v / v runderserumalbumine (BSA) en 1% v / v natriumdodecylsulfaat (SDS) in PBS aan cellen van substraten scheiden tijdens TFM.
    2. Verplaats 35 mm petrischaaltjes met matrix culturenEen geïncubeerd (37 ° C, 5% CO2), omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een robot podium voor TFM metingen.
      1. In een gerecht, markeer de posities (X-coördinaat, Y-coördinaat) en focus vlakken (Z-coördinaat) van de individuele cel eilanden met fase contrast microscopie.
      2. Overschakelen naar ver rood fluorescentie microscopie om de kralen te visualiseren. Terugkeer naar elk van de functies opgeslagen in de vorige stap en corrigeer de Z-coördinaat van de focus vlak zodat alleen de eerste laag van beads onder de cel eiland is scherpgesteld. Sla de nieuwe coördinaten en overgaan tot geautomatiseerde beeldvorming van alle cel eilanden pre-dissociatie fase contrast en ver rode fluorescerende beelden vast te leggen.
    3. Voeg voorzichtig 150 ul van BSA / SDS-oplossing om de schotel en wacht 5 min mogelijk te maken voor volledige cel dissociatie van substraat; monitoren cel dissociatie met behulp van fase contrast microscopie.
    4. Nadat de cel eilanden zijn losgemaakt van het substraat, terug naar tHij gemarkeerde plaatsen en controleer of de eerste laag van kralen zijn nog steeds in focus. Als deze kralen zijn buiten het vlak door deformatie geïnduceerd door cellen geproduceerde tractie, corrigeer de Z-coördinaat van de focus vliegtuig zodat ze weer scherp. Sla het gecorrigeerde Z-coördinaten en herhaal geautomatiseerde beeldvorming van alle eilanden post-dissociatie ver rood fluorescerende beelden vast te leggen.
    5. Herhaal stap 3.5.1 - 3.5.4 voor de overige gerechten.

4. Analyse van Data

  1. Analyse van immunofluorescentie gegevens.
    1. Proces verworven serie beelden. Split samengestelde reeks afbeeldingen in bestanden met afzonderlijke kanalen (dat wil zeggen, rood, blauw of groen) en om te zetten in 8-bits TIFF-afbeeldingen 43, 44. Solliciteer binning (bv 2 × 2 of 4 × 4) om de afbeelding te verkleinen tot ~ 32 megapixels per kanaal in het geheugen eisen tijdens downstream single-cell analyse van enti verminderenre serie beelden. Zie Aanvullende Code File getiteld "array_processing.ijm" voor een ImageJ macro uitvoering van deze reeks bewerkingsstappen.
    2. Let op de coördinaten in pixels van de linkerbovenhoek, linksonder en rechtsonder rhodamine geconjugeerde dextran markers of gekleed omstandigheden. Gebruik deze coördinaten aan de 8-bits TIFF-afbeeldingen te roteren om perfect verticaal zijn en, later, de output aantekeningen uit de single-cell analyse met specifieke voorwaarden opgesteld. Zie Aanvullende codebestanden getiteld "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm" en "array_gridding.ijm" voor implementaties van deze reeks roterende en gridding stappen.
    3. Voer single-cell analyse van weggegooid, gedraaid 8-bits TIFF-afbeeldingen in CellProfiler (versie 2.1.1) 45 met behulp van de volgende modules: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects en MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects identificeert kernen, IdentifySecondaryObjects identificeert immunolabels in verband met elke celkern en MeasureObjectIntensity biedt kwantificering voor zowel nucleaire labels en immunolabels.
      1. Output single-cell gegevens van alle drie modules als een CSV-bestand per kanaal met behulp van de ExportToSpreadsheet module om later downstream-analyse te vergemakkelijken. Zie Aanvullende Code Files getiteld "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe" en "rgb_array_image_analysis.cppipe" voor CellProfiler pijpleidingen de uitvoering van deze stappen voor het sets met rood, groen of blauw kanalen.
    4. Als u gegevens om rekening te houden voor experimentele variabiliteit en non-Gauss single-cell-distributies te transformeren, gelden kwantiel normalisatie door biologische repliceren 46. Dit proces genereert een gedeelde verdeling over replica's en maakt onpartijdige vergelijkingen van veranderingen in immunolabel intensiteit. Bovendien unlike Z-scores en andere parametrische methoden, quantile normalisering non-parametrische en neemt geen een speciale verspreiding van gegevens, waardoor meer representatieve analyses van eencellige als functie van de array staat.
    5. Plot data en interpreteren. Afhankelijk van het biologische systeem en hypothesen, berekenen en plotten één of meer van de volgende maatregelen ensemble per opgesteld staat:
      1. Bereken en plot cellen per eiland als een gecombineerde maat voor adhesie en overleving in de loop van het experiment.
      2. Bereken en plot de quantile-genormaliseerd immunolabel intensiteit als een maatregel die het lot of functie.
      3. Bereken plot en het percentage cellen positief voor een immunolabel zoals bepaald door de intensiteit boven een drempelwaarde consistente, gewoonlijk 2 SD boven de gemiddelde intensiteit van een negatieve controle.
      4. Als alternatief plot verdelingen van immunolabel intensiteit om na te gaan en te categoriseren eencellige gedragals functie van de array staat. Deze uitkeringen kunnen verder worden gekarakteriseerd met behulp van maatregelen van centrale tendens (gemiddelde, de mediaan, modus) en variatie (variantie, variatiecoëfficiënt, Fano factor) en de hypothese testmethoden zoals de Kolmogorov-Smirnov-test.
  2. Analyse van TFM data. Hier wordt beschreven een aanpak waarin een eerder ontwikkelde algoritme door Butler et al. en Wang et al. 40, 47.
    1. Gebruik ImageJ bekeerling de afbeeldingen om 8-bits TIFF-bestanden. Toepassen pixels gemiddeld binning (bijvoorbeeld 2 x 2) de rekentijd en de tijd van analyse downstream verminderen. Algoritmen voor TFM zijn grotendeels gericht op single-cell analyse de grote cel-substraat grensvlak van de eilanden (~ 17,5 x 10 3 2 micrometer) in vergelijking met de cel-substraat grensvlak van een enkele cel (75 um 2) necessitates de binning stap.
    2. Voer de gevangen fasecontrast en veel fluorescerende beelden (zowel vóór dissociatie en na dissociatie) in een wetenschappelijke programmeeromgeving zoals MATLAB en werkwijze met de eerder ontwikkelde algoritmes van Butler et al. en Wang et al. 40, 47.
      1. Selecteer drie regio's ver van de cel eiland. Deze regio's worden gebruikt om rekening te houden met verplaatsingen als gevolg van beeld of sample drift.
      2. Over een factor converteren van pixels tot micrometers (bijvoorbeeld 0,454 pixels / um), de Young's modulus van het substraat (bv, 13 kPa) en de Poisson verhouding (bijvoorbeeld 0,48 voor polyacrylamidegels beschreven).
      3. Voor elk eiland, trek een grens rond de periferie naar de geometrische beperkingen te definiëren; alle krachten buiten deze grens worden op nul gezet. Dit beperkt systeem is redelijk gezien de grote distaNVU (dat wil zeggen, 450 pm) tussen de eilanden.
    3. Bereken de wortel van het gemiddelde kwadraat traction stress en samentrekkende moment voor elk eiland. De contractiele moment is een maat voor de restspanning over de cel eiland en is aangetoond dat de sterkte van cel-cel interacties 48 weerspiegelen. Voor elk gekleed conditie, de gemiddelde wortel van het gemiddelde kwadraat waarden over meerdere eilanden en biologische herhalingen en bereken bijbehorende variantie voor hypothese testen. Het is ook mogelijk om de verdeling van de spanningen of momenten gemiddeld over vele eilandjes een representatieve kaart van beide maatregelen als functie van de geometrie, bijvoorbeeld van het centrum van het eiland verschaffen.

Representative Results

Gebruik dit platform, hebben we de rol van zowel de biochemische en biofysische signalen in het lot specificatie van Leverprogenitoren 34, 35. Proteïne A / G-geconjugeerd Notch ligands liet verbeterd tegenhouden en clustering in de polyacrylamide hydrogel (figuur 3A) en zijn bovendien het aansturen van differentiatie van Leverprogenitoren naar een galgang lot van de cel (figuur 3B). Gebruik eencellige analyse hebben we gekwantificeerd de reactie op de Notch liganden voor de ECM eiwitten collageen I, collageen III, collageen IV, fibronectine en laminine (figuur 3C), vastgesteld dat de reactie van Leverprogenitoren het ligand hangt ook af van de ECM context. Last, benut we shRNA knock-down te Leverprogenitoren genereren zonder dat de liganden Dll1 en Jag1. De respons op de array Notch ligand varieerde afhankelijk van de presence van ofwel ligand bevestigt de respons van de cel-extrinsieke ligand is ook een functie van de cel-intrinsieke ligand expressie (Figuur 3D). Verder zagen we een duidelijke subpopulatie van dubbel-positieve (ALB + / OPN +) cellen in de Dll1 knock-down (Figuur 3D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de combinatoriële mogelijkheden van de array format, zoals blijkt uit de koppeling van meerdere ECM-eiwitten opgesteld en Notch ligands de knockdown van afzonderlijke liganden; (2) de functie van niet alleen bekleed ECM eiwitten ook gerangschikt cel- ligand via proteïne A / G-gemedieerde conjugatie; en (3) de uitvoering van onze single-cell analyse en de mogelijkheid om unieke subpopulaties onderscheiden.

We hebben ook waargenomen dat de differentiatie van progenitors lever is afhankelijk van zowel het substraat stijfheid en de ECM samenstelling (figuur 4A ong>), in het bijzonder het vinden van dat collageen IV is voorstander van differentiatie op zowel zacht en stijve substraten terwijl fibronectine alleen ondersteuning voor differentiatie op harde ondergronden (Figuur 4B). Representatieve warmtekaarten van TFM metingen voorgesteld aanhoudende trek wordt belast bij lage substraat stijfheid op collageen IV bevorderde differentiatie in bile duct cellen (Figuur 4C), een bevinding bevestigd gemiddelde wortel van het gemiddelde kwadraat waarden (Figuur 4D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de succesvolle integratie van TFM met mobiele microarrays op substraten met een instelbare stijfheid zowel de cel fenotype en trek wordt belast, te beoordelen; (2) de coördinatie van de lever voorlopercellen lot van de cel met zowel de matrix samenstelling en het substraat stijfheid; en (3) de implementatie van onze TFM analyse en typische tractie stress-profielen in cel microarrays.

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Figuur 1: Overzicht schematische weergave van de eerste drie Experimental secties. In paragraaf 1, worden glassubstraten schoongemaakt en gesilaniseerd om de fabricage van polyacrylamide hydrogels te vergemakkelijken. In hoofdstuk 2, worden de biomolecuul combinaties van belang bereid in een 384-wells microplaat bron. Een array-robot wordt dan geladen met schone pennen, de bron microplaat en de polyacrylamide hydrogels en geïnitialiseerd, vervaardigen arrays op de hydrogelen. In paragraaf 3 worden cellen gezaaid op de gekleed domeinen en liet zich te houden, waarna de cultuur protocol van belang is uitgevoerd. Op het eindpunt worden de cellen ofwel gefixeerd voor immunocytochemie / of immunofluorescentie geanalyseerd met TFM. Schaal bars zijn 75 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

binnen-page = "1"> Figuur 2
Figuur 2: Verwerking en analyse van immunofluorescentie gegevens van arrays. (A) Tegels, samengestelde 32-bits RGB-afbeeldingen worden eerst weggegooid en vervolgens te splitsen in afzonderlijke 8-bit kanalen. Een combinatie van fluorescente markers bekleed en mobiele eilanden worden drie hoeken van de array gemerkt zijn dat voor automatische oriëntatie en netten in de arrays. (B) Eencellige data wordt gegenereerd voor elk kanaal van de input arrays. Om rekening te houden experimentele drift, wordt quantile normalisatie toegepast door biologische repliceren, waardoor een enkele gedeelde verdeling over alle replicaten. Kwantiel genormaliseerde data wordt vervolgens uitgezet en geïnterpreteerd via de berekening van ensemble metingen (bijvoorbeeld cellen / eiland, gemiddelde intensiteit, het percentage cellen positief voor een label) of een directe analyse van single-cell distributies.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Notch Ligand Presentatie Bemiddelt Lever Progenitor Differentiatie. (A) Fc-recombinant Notch liganden Jagged-1 (JAG1) en Delta-like 1 (DLL1) tentoongesteld verbeterde retentie en clustering wanneer bekleed met proteïne A / G. Schaal bar is 50 micrometer. (B) Leverprogenitoren gedifferentieerd in galweg cellen na presentatie met Notch ligand. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is een nucleaire label, albumine (ALB) is een lever cel marker, en osteopontine (OPN) is een galwegen cel marker. Schaal bar is 150 pm. (C) Kwantificering van het percentage cellen positief voor OPN voor de Notch liganden JAG1, DLL1, en Delta-achtige 4 (DLL4) op de ECM eiwitten collageen I, collagen III, collageen IV, fibronectine en laminine. Student's t -testen werden uitgevoerd tegen controle IgG voor elk getooid Notch ligand binnen elke ECM-eiwit met P-waarden geïndiceerd voor P <0,05 (*). (D) Imaging cytometrie van ALB en OPN voor cellen op collageen III aangeboden met de Notch liganden JAG1, DLL1 en DLL4. Leverprogenitoren zonder Notch liganden Dll1 en Jag1 (dwz shDll1 en shJag1) werden gegenereerd met behulp van shRNA knock-down. Gegevens in (C) gepresenteerd als gemiddelde ± SEM Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kaylan et al. 34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Matrix Samenstelling en Substrate stijfheid Coordinate Lever Progenitor Differentiatie. (A) Lever voorlopercellen differentiatie ductale cellen gal afhankelijk van zowel ECM samenstelling en substraat stijfheid. DAPI is een nucleaire label, ALB is een lever cel marker, en OPN is een galweg cel marker. (B) Kwantificering van percentage cellen positief voor OPN op substraten van Young's modulus 30 kPa, 13 kPa, en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties de ECM eiwitten. (C) Cell trek wordt belast, afhankelijk van zowel substraat stijfheid en ECM samenstelling. (D) Kwantificering root-mean-square waarden trek wordt belast op substraten van Young's modulus 30 kPa en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties van deze ECM eiwitten. In (B) en (D), werden gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM en Student's t -testenwerden uitgevoerd op 30 kPa per ECM combinatie met P-waarden dienen P <0,05 (*), P <0,01 (**) en P <0,001 (***). Schaal bars zijn 50 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kourouklis et al. 35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Sectie Probleem mogelijke oorzaken Oplossing
1. Fabricage van Polyacrylamide substraat. Dekglaasje kan niet van hydrogel verwijderd. Overpolymerization. Verminder polymerisatietijd tot <10 minuten (4 W / m 2). Controleer of UV crosslinker output is binnen de verwachte range.
Slechte polyacrylamide hydrogel polymerisatie. Underpolymerization. Polymerisatietijd verhogen tot> 10 minuten (4 W / m 2). Controleer of de UV-crosslinker output is binnen de verwachte range.
Polyacrylamide hydrogels beschadigd na verwijdering van dekglaasje. Zachte polyacrylamide hydrogels zijn gemakkelijk te beschadigen. We zien afnemende hydrogel fabricage opbrengst (~ 50%) van de zachtste (dwz 4 kPa) hydrogels in het bijzonder. Handvat hydrogels zacht en verhogen startnummers om gewenste opbrengst te bereiken.
2. Vervaardiging van arrays. Slechte of inconsistente spot morfologie. Inconsistent luchtbevochtiger functie. Controleer of de luchtbevochtiger en Rheometer een functioneel gedurende de hele oplage en onderhouden van 65% RV.
Pins vast te zitten in de printkop of klompged. Reinig de printkop mogelijk te maken voor vrije pin beweging. Clean pennen grondig voor of na elke oplage aggregaten van pin-kanalen te verwijderen.
3. Cel Cultuur en Assay Execution. Cell onthechting of overlijden op arrays na de eerste bijlage. Bovenuitzaai en overmatige proliferatie. Verminder initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik "onderhoud" of "differentiatie" media tijdens scala cultuur tot celproliferatie te verminderen.
Vorming van giftige acrylamide monomeer uit hydrogel. Genieten hydrogels in dH 2 O tenminste 3 d om diffusie / vrijgave van acrylamide monomeer en verminderen celtoxiciteit.
Cellen niet hechten aan arrays. Underseeding. Verhoging van de initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik een sterker hechtende celtype.
Slechte afzetting vanmatrix of biomolecuul conditie. Clean pinnen van deeltjes en aggregaten, bevestigen afdrukken parameters, en het spotten van fluorescente markers, bijvoorbeeld rhodamine-geconjugeerde dextran te evalueren.
Specificiteit van cel-matrix interacties. Verschillende celtypen zich specifiek op sommige, maar niet andere ECM eiwitten. Test meerdere verschillende ECM eiwitten met je cellen.
Suboptimale scala opslag na fabricage. We raden het opslaan van gefabriceerde arrays 's nachts bij 65% relatieve vochtigheid en kamertemperatuur, voor een deel aan fase veranderingen tijdens bevriezing te voorkomen. Celhechting gevoelig voor zowel vocht, temperatuur en opslagtijd; zorg ervoor dat deze parameters zijn consistent / geoptimaliseerd voor uw experimenten.
Detachement van hydrogel van glassubstraat tijdens celkweek. Slechte slide reiniging en silaneren. Vervang werkende oplossingen voor het reinigen en slidesilaneren.
Overdehydrated hydrogel. Niet hydrogels dehydrateren op een hete plaat langer dan 15-30 minuten te verlaten.
4. Analyse van de gegevens. Hoge variabiliteit tussen repliceren plekken en glijbanen. Variabiliteit in serie fabricage. Controleer of de pinnen en printkop schoon zijn. Bevestig luchtbevochtiger functie. Visualiseren en kwantificeren spot en de vele kwaliteit met fluorescerende markers. WINKEL arrays zoals hierboven aanbevolen.

Tabel 1: Problemen oplossen.

Discussion

In onze experimenten hebben we gevonden dat de meest voorkomende fouten zijn gerelateerd aan de kwaliteit van de gefabriceerde arrays en slecht kenmerk reactie in het biologische systeem plaats. Wij verwijzen de lezer naar tabel 1 voor de gemeenschappelijke storingsmodi in cel microarray experimenten en bijbehorende stappen voor probleemoplossing. Ten aanzien van de kwaliteit van arrays in het bijzonder, raden wij u het volgende. Bevestigen de technische kwaliteit en de robuustheid van arraying's, parameters en buffers gebruikt fluorescerend gemerkte moleculen zoals rhodamine geconjugeerd dextran. Grondig reinigen pennen voor of na het rangschikken van de instructies van de fabrikant en verder visueel te controleren of de pin-kanalen zijn vrij van afval met behulp van een lichtmicroscoop. Bevestig gekleed biomolecuul retentie met behulp van algemeen eiwit vlekken of immunokleuring. Merk op dat biomoleculen met een molecuulgewicht lager dan 70 kDa vaak niet vastgehouden in de hydrogel 23, sup> 31. Valideren gekleed biomolecuul cell-functionaliteit met behulp van meerdere celtypen. Merk op dat alleen hechtende cellen geschikt arrays; bovendien, hechting aan matrices afhankelijk van zowel cel-specifieke eigenschappen (bijvoorbeeld integrine expressieprofiel) en de geselecteerde ECM eiwitten.

Vanwege de beperkte ruimte, hebben we niet voorzien van een uitgebreide behandeling van de array ontwerp, de indeling en fabricage hier en verwijzen de lezer naar de vorige werkt 23, 25. Wij gebruiken over het algemeen 100 spot subarrays (150 micrometer spot diameter van 450 micrometer hart-op-hart afstand), bestaande uit 10-20 unieke biomolecuul zijn uitgevoerd (5-10 vlekken / conditie). Het aantal subarrays in een matrix is ​​afhankelijk van het aantal biologische molecule voorwaarden plaats, die comfortabel tot 1280 worden geschaald op een 25 x 75 mm objectglaasje (~ 6400 spots in 64 subarrays)xref "> 25, 31 de parameters hierboven verder afhankelijk van de patroongrootte plaats;. pinnen kunnen genereren patronen 75-450 urn zijn beschikbaar.

Array experimenten worden best aangevuld met validatie van hoog scorende gekleed omstandigheden van belang het gebruik van andere cultuur formats, assay uitlezingen, en biologische modelsystemen. In het bijzonder, raden we verder valideren effecten van geselecteerde gekleed omstandigheden met behulp van bulk culturen in combinatie met standaard moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld qRT-PCR, immunoblotting) of standaard TFM. Genetische manipulatie (bijv knock-down of overexpressie) van de factor van belang in een geschikte biologische modelsysteem kan ook dienen om effecten waargenomen in arrays te bevestigen. In vivo diermodellen vertegenwoordigen een ander middel voor validatie en werden onlangs gebruikt, bijvoorbeeld, de centrale rol van galectine-3 en galectine-8 bevestigtde longkanker metastatische niche, zoals aanvankelijk geïdentificeerd via de mobiele microarray 31, 49.

Een aantal andere methoden zijn gebruikt om micro-omgeving regulatie van cellulaire functies, waaronder een verscheidenheid aan tweedimensionale microvervaardigde systemen 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 en driedimensionale engineered biomateriaal systemen 56, 57, 58 probe , 59, 60, 61. In vergelijking met andere werkwijzen, de bijzondere voordelen van de cel microarrayplatform beschreven omvatten: (1) tot doorvoerhonderden of duizenden verschillende combinaties van factoren, waardoor analyse van de interactie-effecten; (2) toegankelijk, geautomatiseerde beeldvorming en analyse; (3) integratie van beide biochemische en biofysische uitlezingen met gecontroleerde presentatie van gekleed factoren; (4) het vermogen om substraat materiaaleigenschappen variëren; en (5) met hoge gehalte single-cell analyse van het lot van de cel en functie.

Samengevat, de combinatie van cel microarrays met TFM op substraten afstembare substraat stijfheid maakt grondige karakterisatie van zowel biochemische en biofysische cues. Zoals hier gepresenteerde dit platform generaliseerbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van hechtende celtypen en weefsels context naar een beter begrip van combinatorische micro-omgeving regulering van celdifferentiatie en mechanotransductie.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij erkennen Austin Cyphersmith en Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign) voor hulp bij microscopie en voor royaal opvang scherm en video-opname op de microscopie kern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27, (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324, (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11, (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25, (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15, (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6, (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23, (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4, (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24, (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3, (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29, (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123, (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48, (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27, (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72, (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2, (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7, (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22, (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18, (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5, (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6, (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3, (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153, (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853, (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282, (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19, (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282, (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5, (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514, (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21, (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8, (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314, (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7, (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10, (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (48), 19632-19637 (2012).
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter