Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

doi: 10.3791/55362 Published: March 1, 2017

Summary

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

Abstract

microarrays הסלולר microfabricated, הכוללות שילובים מודפס קשר של ביומולקולות על משטח הידרוג'ל אלסטי, לספק נתונים לפיקוח הדוק, מערכת מהונדסים תפוקה גבוהה למדידת ההשפעה של אותות ביוכימיים ערוכים על התמיינות תאים. מאמצים אחרונים באמצעות מערכי תא הוכיחו השירות שלהם ללימודי קומבינטורית שבה גורמים רבים microenvironmental מוצגים במקביל. עם זאת, מאמצים אלה התמקדו בעיקר שבדקו את ההשפעה של רמזי ביוכימיים על תגובות תא. כאן, אנו מציגים פלטפורמת microarray תא עם תכונות חומר מתכוננות להערכה היא התמיינות התאים על ידי immunofluorescence ואינטראקציות תא-מצע ביומכנית ידי מיקרוסקופ כוח המתיחה. לשם כך, פיתחנו שני פורמטים שונים ניצול הידרוג polyacrylamide משתנה מודול יאנג מפוברק משני שקופיות מיקרוסקופ או צלחות פטרי זכוכית התחתונה. אנו מספקים BESשיטות t ופתרון בעיות עבור ייצור של microarrays על מצעים הידרוג'ל אלה, תרבית תאים עוקבות על microarrays, ורכישת נתונים. פלטפורמה זו היא מתאימה היטב לשימוש בחקירות של תהליכים ביולוגיים עבורו הוא ביוכימיים (למשל, רכב תאי מטריקס) ו biophysical (למשל, קשיחות מצע) רמזים עשויים לשחק משמעותיים, מצטלבים תפקידים.

Introduction

אינטראקציות בין תאים וגורמים microenvironmental שמסביב לתווך מגוון גדול של תהליכים ביולוגיים במהלך ההתפתחות, הומאוסטזיס, ומחלות בפתוגנזה 1, 2, 3, 4. אינטראקציות microenvironmental אלה כוללים משלוח של גורמים מסיסים לתאים, תא-מטריצה ​​מחייבת, ואינטראקציות תאי תאים באמצעות קולטן ליגנד המחייב. בנוסף לשיקולים ביוכימיים לעיל, פרמטרים biophysical, כגון תכונות מכניות המצע (למשל, מודולוס של יאנג, נקבוביות) ואת צורת התא, ואת mechanotransduction במורד הזרם הקשורים ויותר זכו להכרה כמתווכים המפתח של התמיינות תאים 5, 6, 7, 8, 9 10. אותות כתוצאה מאינטראקציות microenvironmental הללו משרתים כתשומות לרשתות גני מסלולי איתות. יתר על כן, מרכיבי תא-מהותי אלה גם ולספק משוב על המיקרו-הסביבה באמצעות גורמי מופרשים ואנזימים משפילים-מטריקס, השלימו לולאת שיתוף רגולטוריות מורכבת בין תכנות גנטי מהותי תאים וגורמים microenvironmental חיצוני תאי 5, 11, 12.

השימוש במערכות מהונדסות עבור המצגת המבוקרת של גורמי microenvironmental הוכיח שימושי במגוון של קשרים שונים 13, 14, 15. מערכות microfabricated בפרט הקלו דפוסים מרחביים מדויקים של חלבונים בתאים וכן ניתוח parallelized ביותר באמצעות מזעור 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays תא לייצג מערכת microfabricated אחד כזה שבו שילובים של מולקולות ביולוגיות הם מודפס קשר על מצע הידרוג'ל polyacrylamide אלסטי 23, 24, 25. הכללת רכיבים דבק תאים (כלומר חלבונים מטריקס) מאפשרת הידבקות התא מתמשכת והתרבות על microarrays, אשר מלווה לעתים קרובות על ידי ניתוח במורד הזרם באמצעות immunocytochemistry וכתבים ניאון. Microarrays התא הופנה פרודוקטיבית להשגת הבנה משופרת של פנוטיפ כבד תא 23, 26, בידול עצבי מבשר 27, mammarהחלטות גורל אב y 28, / תחזוקת תאי גזע עוברי בידול 23, 29, 30, גרורות סרטן ריאות 31, ותגובה טיפולית מלנומה 32. אנחנו הוכחנו את השימוש לאחרונה של microarrays תא להגדרת התפקיד של תאי מטריקס (ECM) רכב חלבון במפרט endoderm 33, בידול ובתאים בכבד 34, 35, ותגובת תרופת תא ריאת גידול 36. בעבודות אלה, התמקדנו הרחבת היכולות קומבינטורית של פלטפורמת מערך לחקור את הצמתים של איתות תאי-מהותי עם הרכב תאי מטריקס ו ביומכניקה. בנוסף, יישמנו readouts biophysical במצע מערך זה כדי לספק את היכולת charac כמותיתterize את התפקיד של התכווצות תא בידול מעבד 35. לשם כך, אנו משולבים מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) עם microarrays התא לאפשר הערכת תפוקה גבוהה של מתיחת תא שנוצר. TFM היא שיטה שימוש נרחב למדוד כוחות המתיחה שנוצר התא סיפקה תובנות משמעותיות ביחס לתיאום פונקציה חד תאים ורקמות ברמה להרכב ביומכניקה של microenvironment המקומית 37, 38, 39, 40. לפיכך, שילוב TFM עם microarrays התא מספק מערכת תפוקה גבוהה למדידת מפתח, פרמטרי biophysical רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

פלטפורמת microarray התא המתואר כאן מורכבת מארבעה חלקים: המצאה של מצעי polyacrylamide, ייצור של מערכים, תרבית תאי הודעת assay, וניתוח של נתונים. לִרְאוֹתאיור 1 עבור סיכום סכמטי של השלושה הסעיפים הניסיוניים הראשונים; ראה איור 2 עבור סיכום סכמטי של הקטע האחרון עם דגש על ניתוח נתוני immunofluorescence. על מנת להתאים את פלטפורמת microarray תא המחקרים של אינטראקציות תא-מצע ביומכנית, השתמשנו מצעי polyacrylamide של מודולוס של יאנג מתכונן אבל נקבובי דומה, לכל אל וון et. 41. כדי לאפשר מדידות TFM של כוחות המופעלים על ידי התאים על המצע שלהם, יישמנו בפורמט צלחת זכוכית התחתונה פטרי בנוסף מיקרוסקופ זכוכית עבה שקופיות מנוצל לעתים קרובות על ידי קבוצות אחרות. לפיכך, פלטפורמת microarray התא הזה מסוגלת מדידות מקבילות של התמיינות תאים באמצעות immunofluorescence בשקופיות מיקרוסקופ וכוחות שנוצרו תא באמצעות TFM על מנות זכוכית תחתונה נפרדות. גם יש לנו ליישם מספר שיפורים על הגישה האנליטית נפוצה עם microarrays תא. specifically, במקום Z-ניקוד פרמטרית של עוצמת אי ברמה כללית אנו מודדים את עוצמת תא בודד ולהחיל נורמליזציה בחמישון כדי לתת דין וחשבון על הפצות הלא נורמליות יותר לתאר במדויק התנהגות הסלולר. אנו מאמינים שיפורים אלה מספקים כלי מסוים כלפי חקירות של תהליכים ביולוגיים שבהם שני רמזים ביוכימיים biophysical לשחק משמעותיים, תפקידים מצטלבים. יתר על כן, שיפורים האנליטית שלנו לאפשר יישום של microarrays תא ללימודים של מגוון רחב של תפקודים תאיים עבורו תא בודד והתנהגות ברמת האוכלוסייה לסטות.

Protocol

1. ייצור של מצעי polyacrylamide

  1. מצעי זכוכית נקיים - גם שקופיות מיקרוסקופ רגילות עבור immunofluorescence נקודת סיום או זכוכית תחתונה 35 מ"מ צלחות פטרי עבור TFM - כדי להבטיח ייצור הידרוג'ל polyacrylamide האופטימלי ויושרה במהלך תרבית תאים. לחלופין, שימוש מראש לנקות מצעי זכוכית.
    1. לטבול מצעי זכוכית נ 0.25% / v טריטון X-100 במים מזוקקים (DH 2 O). מניחים מצעים על שייקר מסלולית למשך 30 דקות.
    2. הסר פתרון טריטון X-100 ולשטוף מצעים 5 פעמים עם DH 2 מצעים O. Leave שקוע השטיפה ומקום הסופי על שייקר מסלולית למשך 30 דקות.
    3. הסר DH 2 O ו לטבול מצעים אצטון. מניחים מצעים על שייקר מסלולית למשך 30 דקות.
    4. הסר אצטון לטבול מצעים מתנול. מניחים מצעים על שייקר מסלולית למשך 30 דקות.
    5. הסר מתנול לשטוף מצעים 5 פעמים עם DH <sub> 2 מצעים O. לטבול 0.05 N NaOH ומניחים על שייקר מסלולית במשך 1 שעה.
      זהירות: NaOH מאוד מאכל והוא יכול לגרום לכוויות בעור חמור לנזק לעיניים. יש להשתמש בכפפות מגן, ביגוד, ומשקפי מגן.
    6. הסר פתרון NaOH ולשטוף מצעים 5 פעמים עם DH 2 אוויר דחוס O. השתמש מסוננים לייבוש מצעים ואופים ב 110 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית עד יבש (5 - 15 דק '). מצעים ניקה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.
  2. Silanize מצעי זכוכית נקיים על מנת להבטיח מצורף של הידרוג'ל polyacrylamide.
    1. לטבול מצעי זכוכית נקיים V / V 2% המוכנים טרי 3- (trimethoxysilyl) methacrylate propyl (3-TPM) באתנול. מניחים מצעים על שייקר מסלולית למשך 30 דקות.
      זהירות: 3-TPM הוא נוזל דליק. התרחק חום, ניצוצות, להבות פתוחות, משטחים חמים ולהשתמש רק במנדף כימי.
    2. הסר פתרון 3-TPM לטבול מצעים ethaנול. מניחים מצעים על שייקר מסלולית במשך 5 דקות.
    3. השתמש באוויר דחוס מסונן לייבוש המצעים ואופים ב 110 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית עד יבש (5 - 15 דק '). ניתן לאחסן מצעים silanized בטמפרטורת החדר למשך עד חודש 1.
  3. אפשרות 1: לפברק הידרוג polyacrylamide על שקופיות מיקרוסקופ silanized עבור immunofluorescence נקודות קצה.
    1. הכן פתרון מראש פולימר ב DH 2 O עם אחוז acrylamide הרצוי / bisacrylamide (w / v) יחס לפברק מצעים עם moduli של יאנג של 4 kPa (4% acrylamide, 0.4% bisacrylamide), 13 kPa (acrylamide 6%, 0.45 bisacrylamide%), או 30 kPa (acrylamide 8%, 0.55% bisacrylamide) נקבוביות דומה, לכל וון et al. 41. פתרון וורטקס עד ברורה מסננת עם מזרק 0.2 מיקרומטר. ניתן לאחסן פתרונות מראש פולימר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 חודשים.
      זהירות: חשיפת acrylamide או bisacrylamide יכולה לגרום לרעילות חריפה, neurotoxicity, וגירוי. יש להשתמש בכפפות מגן, ביגוד, ומשקפי מגן.
    2. כן פתרון photoinitiator של 20% w / v Irgacure 2959 מתנול. פתרון photoinitiator זה לא יכול להיות מאוחסן חייב להיות מוכן טרי בכל פעם.
    3. מערבבים את הפתרונות מראש פולימר photoinitiator ב 9: 1 (פולימר-מראש: photoinitiator) יחס. דגה לחלופין עם תא ואקום במשך 15 דקות כדי להסיר בועות.
    4. מניחים שקופיות silanized לתוך מגש ייבוש זכוכית pipet 100 μL של 9: 1 מראש פולימר: פתרון photoinitiator על כל שקופית. בעדינות לכסות כל שקופית עם coverslip מ"מ 22 × 60 תוך הימנעות יצירת בועות. ראוי לציין, כי coverslip מונע עיכוב התגובה פילמור על ידי החמצן.
    5. מגש ייבוש מקום בתוך crosslinker UV ולחשוף שקופיות א UV 365 ננומטר במשך 10 דקות (4 W / m 2). מטב זמן פילמור לפי הצורך. כבר חשיפות קושי סיכון הסרת coverslip בשל overpolymerization. חשיפות שורטר rISK underpolymerization ויציבות הידרוג'ל נמוכה.
    6. לטבול הידרוג ב DH 2 O למשך 5 דקות. הסר coverslips עם תער, נזהר שלא לפגוע הידרוג polymerized.
    7. השאירו הידרוג ב DH 2 O בטמפרטורת החדר למשך 1 - 3 ד, משתנה מדי יום DH 2 O. מייבשים הידרוג על 50 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית עד יבש (15 - 30 דקות) ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך עד 3 חודשים.
  4. אפשרות 2: לפברק הידרוג polyacrylamide חרוז המכיל ניאון על צלחות פטרי silanized 35 מ"מ זכוכית תחתונה להערכה חייה של אינטראקציות תא-מצע באמצעות TFM.
    1. Sonicate פתרון המניות של 1 מיקרומטר חרוזי ניאון במשך 15 דקות כדי לפזר אגרגטים.
    2. הכן פתרון מראש פולימר ב DH 2 O עם אחוז acrylamide הרצוי / bisacrylamide (w / v) יחס לפברק מצעים עם moduli של יאנג של 4 kPa (4% acrylamide, 0.4% bisacrylamide), 13 kPa (acrylamide 6%, 0.45% Bisacrylamide), או 30 kPa (8% acrylamide, 0.55% bisacrylamide) נקבוביות דומה, לכל וון et al. 41. פתרון וורטקס עד ברורה מסננת עם מזרק 0.2 מיקרומטר. ניתן לאחסן פתרונות מראש פולימר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 חודשים.
      זהירות: חשיפה acrylamide או bisacrylamide יכול לגרום לרעילות חריפה, רעילות במערכת העצבים ופגיעה גירוי. יש להשתמש בכפפות מגן, ביגוד, ומשקפי מגן.
    3. הוספת חרוזי ניאון לפתרון מראש פולימר בריכוז סופי של 0.2% v / v ו מערבולת לערבב.
    4. כן פתרון photoinitiator של 20% w / v Irgacure 2959 מתנול. פתרון photoinitiator זה לא יכול להיות מאוחסן חייב להיות מוכן טרי בכל פעם.
    5. מערבבים את הפתרונות מראש פולימר / חרוז photoinitiator ב 9: יחס: 1 (photoinitiator מראש פולימר / חרוז). דגה לחלופין עם תא ואקום במשך 15 דקות כדי להסיר בועות.
    6. מניחים silanized 35 צלחות פטרי זכוכית התחתונה מ"מ לתוך מגש ייבוש זכוכית pipet 20 μL של 9: פתרון photoinitiator על גבי במרכז כל צלחת: 1 מראש פולימר / חרוז. בעדינות לכסות כל שקופית עם coverslip עגול 12 מ"מ תוך הימנעות יצירת בועות. ראוי לציין, כי coverslip מונע עיכוב התגובה פילמור על ידי החמצן.
    7. על מנת להפיץ את חרוזי ניאון אל פני השטח של הידרוג'ל, להפוך את הכלים ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, לכל Knoll et al. 42.
    8. אמנם עדיין הפוך, לחשוף צלחות לווין UV 365 ננומטר במשך 10 דקות (4 W / m 2). מטב זמן פילמור לפי הצורך. כבר חשיפות קושי סיכון הסרת coverslip בשל overpolymerization. underpolymerization סיכון חשיפות שורטר ויציבות הידרוג'ל נמוכה.
    9. לטבול הידרוג ב 0.1 M 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך הלילה האפל. הסר coverslips בזהירות עם סכין גילוח, נזהר שלא לפגוע פולימרייםהידרוג rized.
    10. מייבשים הידרוג על 50 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית עד יבש (15 - 30 דקות). הידרוג ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר בחושך במשך 3 חודשים.

ייצור 2. של מערכים

  1. כן מאגרים להדפיס ביומולקולות. השתמש חיץ ההדפסה המתאים כדי ביומולקולות העניין. חיץ הדפסת Growth Factor (GF) מתאים רחב עבור בסוגים אחרים של מולקולות, כגון הליגנדים תאי תאים.
    1. כדי להכין חיץ הדפסה חלבון 2 × ECM, להוסיף 164 מ"ג של נתרן אצטט ו- 37.2 מ"ג של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) עד 6 מ"ל DH 2 O. וורטקס לדגור על 37 מעלות צלזיוס כדי solubilize ביסודיות. לאחר solubilization, להוסיף 50 μL של טרום חימם טריטון X-100 ו -4 מ"ל של גליצרול. וורטקס ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס שוב כדי solubilize. הוסף 40 - 80 μL של חומצה אצטית קרחונית, titrating להתאים את ה- pH ל 4.8. 2 × חיץ הדפסת חלבון ECM יכול להיות מאוחסן על 4° C עבור 1 חודש.
      זהירות: חומצה אצטית היא דליקה מאכלת. יש להשתמש בכפפות מגן, ביגוד, ומשקפי מגן.
    2. כדי להכין חיץ GF הדפסה 2 ×, להוסיף 105.5 מ"ג נתרן אצטט ו EDTA 37.2 מ"ג ל -6 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). וורטקס ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס כדי solubilize ביסודיות. לאחר solubilization, להוסיף 100 מ"ג 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (פרקים) ו -4 מ"ל של גליצרול. 2 × חיץ הדפסת GF חלבון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש.
  2. כן מקור צלחת.
    1. בעוד microplate V-תחתון 384 גם, לשלב כמויות שווות של חיץ 2 × הדפסה עם כל פתרון biomolecule במחיר כפול ריכוז היעד.
      הערה: ריכוז יעד מתאים עבור חלבוני ECM הנפוצים ביותר הוא 250 מיקרוגרם / מיליליטר בעוד ריכוזי יעד עבור סוגים אחרים של גורמים ערוכים משתנים בהתאם בשייר הידרוג'ל והתפקוד ביולוגי. ההיקף הכולל בכל טוב יכול להיותנמוך כמו 5 μL ולא צריך להיות יותר מ -15 μL. בנוסף שילובי biomolecule של עניין, כולל בסמן פלורסנטי ערוך על מנת להקל על ניתוח תמונה במורד זרם. השתמש dextran rhodamine מצומדות (2.5 מ"ג / מ"ל).
    2. מערבבים היטב כל ביסודיות על ידי pipetting, נזהרת שלא ליצור בועות. צנטריפוגה microplate המקור 1 דקות ב 100 × גרם. לפברק microarrays באמצעות צלחות מקור שהוכן באותו יום ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ייצור microarray.
  3. סיכות נקיות על פי הוראות היצרן לפני כל ריצת ייצור microarray. טען סיכות נקיות ישירות לתוך ההדפסה של microarrayer.
  4. כן microarrayer ותכנית באמצעות התוכנה של היצרן. למרות הצעדים הבאים הם בחלקם ספציפית microarrayer מסוים משמש כאן, המבצע של רוב microarrayers דומה.
    1. הפעל את יחידת אדים, להתאים את נקודת הסט ל -65% לחות יחסית (ללא-condensing), ולחכות עד rheometer תואם את הנקודה להגדיר. מניחים מקור צלחת את המתאם המתאים.
    2. מייבשי מצעים הידרוג'ל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומניחים לתוך המתאם המתאים. יש microarrayer מתאמים עבור שניהם שקופיות מיקרוסקופ microplates. לקבלת עֲרִיכָה 35 מ"מ זכוכית התחתונה צלחות פטרי, לטעון את הכלים לתוך microplate 6 באר והמקום microplate למתאם microplate על arrayer.
    3. כוונו את הפרמטרים של התוכנית כדי לשקף את פריסת מדויק של הצלחת למקור, עיצוב מערך, ואת הפורמט הרצוי (למשל, שקופיות מיקרוסקופ או microplate המכיל 35 מ"מ צלחות פטרי). לכלול צעדים לשטוף הוא באמצעות sulfoxide המים דימתיל (DMSO) בין כל תנאי על מנת למנוע-מעל לנשיאת זיהום צולב.
    4. תחל בייצור מערך, בדוק לא פחות מפעם אחת שעה כי הלחות לא ירד מתחת 65% לחות יחסית (ללא עיבוי) וכי הסיכות אינן סתומות. אם humidity שנכנס במפתיע, להשהות עֲרִיכָה למלא את מכשיר האדים ונקה צינורות הקשורים התעבות. אם הפינים סתומים, להשהות עֲרִיכָה לנקות את הסיכות או אחר להחליף עם סיכות מראש לנקות. שים לב אפשר סוגים שונים מערך של ברצף ביומולקולות באותו המצעים ספקו זמן ייבוש מספיק (כלומר, 4 שעות עד לילה).
    5. לאחר התוכנית תושלם, להציב מערכים מפוברק בתיבת שקופיות או microplate מכוסה בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר ו -65% לחות יחסית (ללא עיבוי) לילה. שים לב כי ייתכן שיהיה צורך להעריך את איכות מערך ושימור באמצעות כתמי חלבון כללי או immunofluorescence; לראות ואח ברפמן. לפרטים נוספים 25.

3. Cell התרבות Assay Readout

  1. למחרת ייצור, למקם מצעים ערוכים במנות 4-תאיים (שקופיות מיקרוסקופ) או 6 גם microplates (צלחות פטרי) וטבלו 1%v / v פניצילין / סטרפטומיצין ב PBS; להשתמש 4 מ"ל עבור מגלשות 3 מ"ל למאכלים. לחשוף UV צלזיוס למשך 30 דקות. המרת פניצילין / פתרון סטרפטומיצין עבור תרבית תאי תקשורת.
  2. אוסף לספור תאים. זרע על מערכים ב 500 × 10 3 - 2 × 10 6 תאים / מערך ב 4 מ"ל לכל שקופית מיקרוסקופ ו -3 מ"ל לכל 35 מ"מ צלחת פטרי. דגירת תרבויות מערך ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 2 - 24 שעות או עד להיווצרות של איים תא היטב מאוכלסים. התאם הוא צפיפות וזמן זריעה כנדרש עבור התאים שלך יישום מסוים. Underseeding (כלומר, צפיפות נמוכה או זמן זריעה) עלול לגרום אוכלוסיית מערך עניים ותוצאות ביולוגיות סוטות. Overseeding (כלומר, צפיפות גבוהה או זמן זריעה) עלול לגרום שלמות מערך מופחתת בשל ניתוק האי.
  3. לאחר שנלקח בחשבון היווצרות איי תא, לשטוף תרבויות מערך פעמים עם תקשורת תרבית תאים טרום חממה; להשתמש שוב 4 מ"ל עבור מגלשות 3 מ"ל למאכלים. Optionally להוסיף בקרות טיפולים מתאימים (למשל, מעכבי מולקולה קטנה, גורמי גדילה וכו ') המעניינות את המערכת הביולוגית. שנה את התקשורת של המערכים כל 1 - ד 2 כדי לשמור על הריכוז של כל טיפולים. הערכת הביטוי תא סמן ותפקוד התא על ידי אינטראקציות immunofluorescence או תא-המצע על ידי TFM בתוך 1 - 5 ד ליזום תרבויות מערך - ראה אפשרות 1 ו אפשרות 2 להלן.
  4. אפשרות 1: בצע immunofluorescence נקודות קצה. שימו לב immunofluorescence של חלבונים מסוימים עשוי לדרוש permeabilization מחמיר יותר באמצעות מתנול, אתנול, או HCl. בשל נזק אפשרי מערכים, להעריך ולמטב כל פרוטוקול permeabilization לפני השימוש בניסויים בקנה מידה גדול יותר.
    1. תרבית תאים התקשורת לשאוב שקופיות מערך במנות 4-תאיים ולהוסיף 4 מ"ל / שקופיות של נ 4% המוכן טרי / paraformaldehyde נ (PFA) ב- PBS. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: ירידיםיור כדי PFA יכול לגרום לרעילות חריפה, ויכול גם לגרום לגירוי או לשיתוק עור על קשר. יש להשתמש בכפפות מגן, ביגוד, ומשקפי מגן ולהשתמש רק במנדף כימי.
    2. פתרון לשאוב PFA ולשטוף כל שקופית 3 פעמים עם 4 מ"ל של PBS. בשלב זה, מגלשות קבועות יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שבוע. מומלץ, עם זאת, להמשיך דרך immunolabeling גובר באותו יום כמו תיקון על מנת להבטיח את תקינות מערך.
    3. לשאוב PBS ולהוסיף 4 מ"ל / שקופיות של נ 0.25% / v טריטון X-100 ב PBS. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשאוב טריטון פתרון X-100 ולשטוף כל שקופית 3 פעמים עם 4 מ"ל של PBS. הוסף 4 מ"ל / שקופיות של 5% v / v בסרום מתאימים מינים של נוגדנים משני (למשל, חמור בדם נוגדנים משני חמור) ב- PBS ו דגירה בטמפרטורת החדר 1 ח.
    5. ביסודיות להסיר את פתרון החסימה מן כל שקופית. הוספת 500 μL / שקופית של נוגדן ראשוני מדולל בסרום נ 5% / v ב PBS. נפח זה מספיק כדי לכסות מערכים עבור 1 הן incubations שעות בטמפרטורת החדר וכן incubations לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. לשטוף כל מערך שקופית 3 פעמים עם 4 מ"ל של PBS. ביסודיות להסיר לשטוף הסופי ולהוסיף 500 μL / שקופית של נוגדנים משני המתאים מדולל 5% v / v בסרום PBS.
    7. לשטוף כל מערך שקופית 3 פעמים עם 4 מ"ל של PBS. לשטוף בקצרה עם DH 2 O לפני הסרת שקופיות מערך בקפידה מתוך מלקחיים באמצעות פתרון. השתמש רקמות במעבדת פתיל או DH 2 שארית היבש O.
    8. Pipet 100 μL של פתרון הרכבה עם DAPI פני שקופיות תוך ראייה המאשר כיסוי מלא של המערך כולו.
    9. מניחים coverslip מ"מ 22 × 60 מעל השקופית לעלות. חותם את הקצוות של coverslip עם לק ברור. חנות בחושך ב 4 ° C עד הדמיה, לא לפני למחרת.
    10. מערכים שלמים תמונה או באמצעות סורק microarray או equipp מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךאד עם במה רובוטית. סורקי microarray לספק הודעה מהר אבל עשוי לדרוש fluorophores Cy3- או Cy5 התואם ולעתים קרובות הם של רזולוציה מוגבלת על פי הוראת תאים בודדים (כלומר, 1 - 10 מיקרומטר). מיקרוסקופי פלורסנט לספק את האפשרות להשתמש במגוון של ערוצי ניאון ברזולוציה גבוהה יותר (<1 מיקרומטר, ~ 100 × הגדלה בסך הכל) אבל לספק readout איטי בהתאם לאיכות של השלב רובוטית וגדלה / אובייקטיבית.
    11. שמור בשבי תמונות של מערכים שלמים אחת משתי הדרכים כקבצי TIFF כדי למנוע נתונים דחיסה או אובדן הקשורים פורמטים של קבצים אחרים (למשל, JPG).
  5. אפשרות 2: בצע הערכת חיה של אינטראקציות תא-מצע באמצעות TFM.
    1. כן פתרון של אלבומין בסרום שור V / V 1% (BSA) ו -1% v / סולפט dodecyl נתרן נ (SDS) ב- PBS לנתק תאי מצעים במהלך TFM.
    2. זז 35 מ"מ צלחות פטרי המכילות תרבויות מערךומטופח (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2), מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם במה רובוטית למדידות TFM.
      1. בצלחת אחת, לסמן את עמדות (X-לתאם, Y-לתאם) ולהתמקד מטוסים (Z-לתאם) איים תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
      2. Switch to מיקרוסקופ פלואורסצנטי אדום רחוק כדי להמחיש את החרוזים. חזור אל כל אחת מהעמדות הצילו בשלב הקודם ולתקן את Z-לתאם המטוס מוקד כך השכבה של חרוזים הראשונה רק מתחת אי התא היא בפוקוס. שמור את הקואורדינטות החדשות והמשך הדמיה אוטומטית של כל איי התא ללכוד בניגוד שלב טרום דיסוציאציה ותמונות ניאון אדומות רחוקות.
    3. בזהירות להוסיף 150 μL של פתרון BSA / SDS כדי בצלחת ולחכות 5 דקות, כדי לאפשר ניתוק תא שלם מן המצע; לפקח תא דיסוציאציה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
    4. לאחר איי התא כבר ניתק מן המצע, לחזור tהוא סמן את המקום ולבדוק כי השכבה הראשונה של חרוזים הם עדיין בפוקוס. אם חרוזים אלה הם מחוץ למטוס בגלל עיוות הנגרם על ידי מתיחת תא שנוצר, ולאחר מכן לתקן את Z-לתאם מטוס המוקד, כך שהם שוב בפוקוס. שמור את Z-קואורדינטות תיקן וחזור הדמיה אוטומטית של כל האיים ללכוד-דיסוציאציה לקורה תמונות ניאון אדום.
    5. חזור על שלבים 3.5.1 - 3.5.4 עבור המנות הנותרות.

4. ניתוח של נתונים

  1. ניתוח של נתוני immunofluorescence.
    1. תהליך רכש תמונות מערך. פיצול תמונות מערך מורכב לקבצים המכילים ערוצים בודדים (כלומר, אדום, כחול, או ירוק) ו להמיר תמונות TIFF 8-bit 43, 44. החל binning (למשל, 2 × 2 או 4 × 4) כדי להקטין את גודל התמונה ~ 32 מגה פיקסל לכל ערוץ להקטין את דרישות הזיכרון במהלך ניתוח תא בודד במורד הזרם של entiמחדש תמונות מערך. ראה קובץ קוד משלימה שכותרתו "array_processing.ijm" עבור יישום מאקרו ImageJ של מדרגות עיבוד מערך אלה.
    2. הערת הקואורדינטות בפיקסלים של בפינה השמאלית העליונה, השמאלית תחתון, וסמנים או תנאים ערוכים dextran rhodamine מצומדות ימניים תחתונים. השתמש הקואורדינטות האלה כדי לסובב את תמונות TIFF 8-bit להיות אנכי לחלוטין, ולאחר מכן להוסיף הערות פלט מניתוח תא בודד עם תנאים מסודרים ספציפיים. ראה שכותרתו קבצי קוד משלימה "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", ו "array_gridding.ijm" עבור יישומים אלה מערך סיבוב gridding צעדים.
    3. ביצוע ניתוח מתחיל מתא בודד זרקת לפח, לסובב תמונות TIFF 8 סיביות CellProfiler (גרסה 2.1.1) 45 באמצעות המודולים הבאים: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects, ו MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects מזהה גרעינים, IdentifySecondaryObjects מזהה immunolabels הקשורים לכל גרעין תא, ואת MeasureObjectIntensity מספק quantifications הוא תוויות גרעיניות immunolabels.
      1. נתונים מתא בודד פלט מכל שלושה מודולים כקובץ CSV על ידי הערוץ באמצעות מודול ExportToSpreadsheet כדי להקל על ניתוח במורד הזרם מאוחר יותר. ראה קבצים קוד משלימה שכותרתו "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", ו "rgb_array_image_analysis.cppipe" לצינורות CellProfiler ליישום השלבים הבאים עבור ערכות תמונה המכיל ערוצי אדום, ירוק או כחול.
    4. כדי להפוך נתונים לתת דין וחשבון על השתנות הניסיון והלא-גאוס הפצות תא בודד, להחיל נורמליזציה בחמישון ידי לשכפל ביולוגי 46. תהליך זה יוצר חלוקה משותפת בין משכפל ומאפשר השוואות משוחדות של שינויים בעוצמת immunolabel. יתר על כן, UNLאייק Z-ניקוד ושיטות פרמטרית אחרות, נורמליזצית החמישון היא הלא פרמטרית ואינה לוקחת על עוצמה חלוקה מסוימת של נתונים, המאפשרת נציג יותר מנתח התנהגות תא בודד כפונקציה של מצב ערוך.
    5. להתוות נתונים ולפרש. בהתאם למערכת והשערה הביולוגיות, לחשב ולתכנן אחד או יותר מהאמצעים הבאים אנסמבל עבור כל תנאים ערוכים:
      1. לחשב ולתכנן תאים לכל אי כאמצעי משולב של הידבקות והישרדות במהלך הניסוי.
      2. לחשב ולתכנן את עוצמת immunolabel מנורמל-בחמישון כאמצעי הגורל או תפקוד התא.
      3. לחשב ולתכנן את אחוז התא חיובי עבור immunolabel כפי שנקבע על ידי עוצמת מעל סף עקבי, בדרך כלל 2 SD מעל עוצמת מתכוון של פקד שלילי.
      4. לחלופין, הפצות חלקות עוצמת immunolabel על מנת לבחון ולמיין התנהגות תא בודדכפונקציה של מצב ערוך. הפצות אלה ניתן לאפיין נוספים באמצעות מדדי נטייה מרכזית (ממוצע, חציון, מצב) והגרסה (שונה, מקדם שונה, גורם Fano) ושיטות בדיקת שערות כגון מבחן קולמוגורוב-סמירנוב.
  2. ניתוח של נתוני TFM. כאן מתואר גישה שילוב אלגוריתם שפותח בעבר על ידי באטלר et al. וואנג et al. 40, 47.
    1. השתמש ImageJ יצווה להמיר את התמונות לקבצי TIFF 8-bit. החל binning ממוצעים פיקסל (למשל, 2 × 2) כדי להפחית את העלות חישובית והשעה של ניתוח במורד הזרם. כמו אלגוריתמי TFM התמקדו בעיקר ניתוח תא בודד, ממשק תא-מצע הגדול של האיים (~ 17.5 × 10 3 מיקרומטר 2) בהשוואה לממשק מצע תא של תא בודד (75 מיקרומטר 2) necessiטאטעס צעד binning.
    2. הזן את ניגוד השלב שנתפס ותמונות ניאון אדומות רחוקות (שתי דיסוציאציה טרום-ניתוק סרטון) סביבת תכנות מדעית כגון Matlab ו- תהליך באמצעות האלגוריתמים שפותחו בעבר של באטלר et al. וואנג et al. 40, 47.
      1. בחר בשלושה אזורים רחוקים מאי התא. אזורים אלה משמשים לתת דין וחשבון על התקות בשל תמונה או להיסחף מדגם.
      2. ספק הגורם להמיר מ פיקסלים מיקרומטר (למשל, 0.454 פיקסלים / מיקרומטר), מודולוס של יאנג של המצע (למשל, 13 kPa), ואת מקדם פואסון (למשל, 0.48 עבור ג'לים polyacrylamide המתואר כאן).
      3. עבור כל אי, לצייר גבול סביב בפריפריה להגדיר את האילוצים הגיאומטריים; כל הכוחות מחוץ לגבולות אלו הם מאופסים. מערכת מוגבלת זה הגיוני בהחלט בהתחשב dista הגדולNCE (כלומר, 450 מיקרומטר) בין האיים.
    3. לחשב את לחץ מתיחת שורש ממוצע מרובע רגע התכווצות עבור כל אי. ברגע ההתכווצות הוא מדד של מתח שיורי ברחבי אי התא הוכח על מנת לשקף את עוצמת תאי תאי אינטראקציות 48. עבור כל תנאי ערוכים, ערכים ממוצע מרובע שורש הממוצע מעל איים מרובים ביולוגי משכפל ולחשב הקשורים השונות לבדיקה השערה. אפשר גם סכום ממוצע של חלוקת מדגיש או רגעים על איים רבים כדי לספק מפת נציג של שני הצעדים כפונקציה של גיאומטריה, למשל, מרחק ממרכז האי.

Representative Results

באמצעות פלטפורמה זו, חקרנו את תפקיד שני הרמזים ביוכימיים biophysical במפרט גורל האבות כבדים 34, 35. חלבון / הליגנדים Notch G מצומדות הראה שימור אשכולות משופר הידרוג'ל polyacrylamide (איור 3 א) והיו יתר מצליח להבריח והתמיינות של אבות הכבד לקראת גורל התא צינור המרה (איור 3B). שימוש בניתוח תא בודד, אנו לכמת התגובה הליגנדים Notch עבור חלבוני ECM לי קולגן, קולגן III, IV קולגן, פיברונקטין, ו laminin (איור 3 ג), מציאת שהתגובה של אבות כבדים ליגנד תלוי גם על בהקשר ECM. לאחרונה, השתמשנו מציאת shRNA ליצור אבות כבדים ללא הליגנדים Dll1 ו Jag1. התגובה ליגנד Notch הערוך השתנתה בהתאם presence של או ליגנד, המאשר כי היענות ליגנד תאים חיצוניים היא גם פונקציה של הביטוי ליגנד-מהותי התא (איור 3D). יתר על כן, צפינו subpopulation מובהק של פעמים חיוביות (ALB + / OPN +) תאי מציאת Dll1 (האיור 3D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) את היכולות קומבינטורית של פורמט המערך, כפי שהודגם על ידי הזיווג של חלבוני ECM ו- הליגנדים Notch ערוכים מרובים עם המציאה של הליגנדים פרט; (2) את הפונקציונליות של לא רק ערוכי חלבוני ECM אך ערוכה גם ליגנד תאי תאים באמצעות חלבון A / G בתיווך נטייה; ו (3) היישום של ניתוח התא הבודד שלנו ועל יכולתה להבחין בתת אוכלוסיות ייחודיות.

אנו הבחנו גם כי הבידול של אבות כבדים תלוי הוא על קשיחות המצע ואת רכב ECM (איור 4 א אונג>), במיוחד במציאה כי קולגן IV תומכת בידול משני מצעים רכים ונוקשים ואילו פיברונקטין תומך רק בידול על מצעים נוקשים (האיור 4B). מפות חום נציג של מדידות TFM הציעו מתח מתיחה מתמשך לקראת קשיחות מצע נמוכה על קולגן IV קדם בידול לתאי צינור מרה (איור 4C), ממצא אושר על ידי ערכי שורש ממוצעים מרובע ממוצע (איור 4D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) שילוב המוצלח של TFM עם microarrays תא על מצעים עם קשיחות מתכוננת להעריך הוא את פנוטיפ תא ואת לחץ המתיחה; (2) התיאום של גורל התא כבד ובתאים בשני רכב מטריקס קשיחות המצע; ו (3) היישום של ניתוח TFM שלנו ופרופילי מתח מתיחה טיפוסיים microarrays תא.

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 55,362 / 55362fig1.jpg "/>
איור 1: הסקירה הכללית סכמטי המציג שלושת הסעיפים הניסיוניים הראשונים. בסעיף 1, מצעי זכוכית מנקים silanized כדי להקל על ייצור של הידרוג polyacrylamide. בסעיף 2, שילובי biomolecule של עניין ערוכים בתוך microplate מקור 384 גם. Arrayer רובוטית נטען אז עם סיכות נקי, microplate המקור, ואת הידרוג polyacrylamide ו אותחל, בודה מערכים על הידרוג'ל. בסעיף 3, תאים הם זורעים על התחומים הערוכים ואפשרו לדבוק, שלאחריו פרוטוקול התרבות של ריבית מבוצע. בנקודת הקצה, תאים מקובעים או עבור immunocytochemistry / immunofluorescence או נותחו באמצעות TFM. ברי סולם הם 75 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך-page = "1"> איור 2
איור 2: עיבוד וניתוח של נתונים Immunofluorescence מ מערכים. (א) שיש, 32 סיבי מרוכבי תמונות RGB הם זרקו לפח ראשון ולאחר מכן התפצלו לערוצי 8 סיביים בודדים. באמצעות שילוב של סמני ניאון ערוכים ואיי תא, שלוש פינות של המערך מזוהות על מנת לאפשר התמצאות אוטומטית gridding של המערכים. (ב) נתוני תא יחיד מופקים עבור כל ערוץ של מערכי הקלט. על מנת לתת דין וחשבון על להיסחף ניסיוני, הנורמליזציה בחמישון מוחלת על ידי לשכפל ביולוגי, הפקת הפצה משותפת אחת בכל המשכפל. הנתונים מנורמלים Quantile מכן הוא זמם ולפרש באמצעות חישוב מדידות הרכב (למשל, תאים / אי, אומרים עצמה, תאי אחוז חיוביים עבור תווית) או ניתוח ישיר של הפצות תא בודד.מ '/ קבצים / ftp_upload / 55,362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: בידול ובתאים כבד מתווכת מצגת Notch ליגנד. (א) Notch Fc-רקומביננטי הליגנדים Jagged-1 (JAG1) ודלתא דמוי 1 (DLL1) הציג השמירה משופרת אשכולות כאשר ערוכים עם חלבון / G. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. (ב) אבות כבדים מובחנים לתוך תאי צינור המרה בהצגה עם ליגנד Notch. 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא תווית גרעינית, אלבומין (ALB) היא סמן תא בכבד ואי osteopontin (OPN) הוא סמן תא צינור מרה. בר סולם הוא 150 מיקרומטר. (C) כימות אחוז התאים החיוביים עבור OPN עבור הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ודלתא דמוי 4 (DLL4) על חלבונים ECM קולגן אני, גollagen III, קולגן IV, פיברונקטין, ו laminin. -tests T של הסטודנט בוצע נגד IgG המלא לכל ליגנד Notch ערוך בתוך כל חלבון ECM עם ערכי P מותווה P <0.05 (*). (ד) הדמיה cytometry של ALB ו OPN עבור תאים על קולגן III בפניך את הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ו DLL4. אבות כבדים ללא Notch הליגנדים Dll1 ו Jag1 (כלומר, shDll1 ו shJag1) שהופקו באמצעות מציאת shRNA. הנתונים (C) כפי שהוצגו ממוצע ± SEM נתון זה יש הבדל בין Kaylan et al. 34. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: רכב מטריקס ואת המצע הנוקש Coordinate בידול ובתאים כבד. (א) בידול ובתאים כבדים למרר תאי צינור תלוי הוא בהרכב ECM וקשיחות מצע. DAPI הוא תווית גרעינית, ALB הוא סמן תא בכבד ואי OPN הוא סמן תא צינור מרה. (ב) כימות של אחוז התאים החיוביים עבור OPN על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa, 13 kPa, ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל דו כיוונית שילובים של אלה חלבוני ECM. (C) תא מתיחת לחץ תלוי הוא קשיחות מצע ורכב ECM. (ד) כימות של ערכים שורש ממוצע מרובע של מתח המתיחה על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל שילובים דו כיוונית של אלה חלבוני ECM. ב (ב) ו- (ד), הוצגו הנתונים כממוצע ± -tests t של SEM and Studentבוצעו נגד 30 kPa לכל צירוף ECM עם ערכי P מותווה P <0.05 (*), P <0.01 (**), ו- P <0.001 (***). ברי סולם הם 50 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין Kourouklis et al. 35. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סָעִיף בְּעָיָה סיבות אפשריות פִּתָרוֹן
ייצור 1. polyacrylamide המצע. Coverglass לא ניתן להסיר הידרוג'ל. Overpolymerization. מנמיכים פילמור זמן <10 דקות (4 W / m 2). בדוק UV crossliפלט nker נמצא בטווח צפוי.
פילמור הידרוג'ל polyacrylamide מסכן. Underpolymerization. הגדל זמן פילמור כדי> 10 דקות (4 W / m 2). בדוק כי פלט UV crosslinker נמצא בטווח צפוי.
הידרוג polyacrylamide פגומים לאחר הסרת coverglass. הידרוג polyacrylamide הרך הם קל לפגוע. אנו צופים ירידת תשואת ייצור הידרוג'ל (~ 50%) עבור הרך (כלומר, 4 kPa) הידרוג בפרט. טפל הידרוג בעדינות ולהגדיל מספר המתחיל להשיג תשואה רצויה.
ייצור 2. של מערכים. מורפולוגיה נקודה מסכנה או לא עקבית. פונקצית אדים עקבית. בדקו אדים ו rheometer פונקציונלי לאורך כל מהדורה ולשמור 65% לחות יחסית.
סיכות תקועות ראש הדפסה או סותםGED. נקה את ראש ההדפסה כדי לאפשר תנועה פינית בחינם. סיכות נקיות ביסודיות לפני או אחרי כל סיבוב הדפסה כדי להסיר אגרגטים מערוצים פיניים.
3. תרבית תאים וביצוע Assay. ניתוק או מוות של תאים על מערכים לאחר מצורף ראשוני. Overseeding ושגשוגם מוגזם. הפחת צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש "תחזוקה" או "בידול" תקשורת במהלך התרבות מערך להפחית התפשטות תאים.
שחרור מונומר acrylamide הרעיל מן הידרוג'ל. משרים הידרוג ב DH 2 O לפחות 3 ד כדי לאפשר דיפוזיה / שחרור מונומר acrylamide ולהפחית רעילות לתא.
תאים לא לצרף מערכים. Underseeding. גדל צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש בסוג התא חסיד ביתר שאת.
בתצהיר ירוד שלמטריקס או מצב biomolecule. סיכות נקיות של חלקיקים אגרגטים, לאשר פרמטרים להדפסה, ולהעריך תצפית של סמני ניאון, למשל, dextran מצומדות rhodamine.
ספציפי של אינטראקציות התא-מטריקס. סוגי תאים שונים לדבוק דווקא חלק אך לא חלבונים אחרים ECM. מבחן חלבוני ECM שונים מרובים עם התאים שלך.
אחסון מערך הכי מוצלח לאחר ייצור. אנו ממליצים שישמרו מערכים מפוברקים לילה בשעת 65% לחות יחסית וטמפרטורה בחדר, בין שאר כדי למנוע שינויי שלב במהלך הקפאה. הידבקות תא רגישה הוא לחות, טמפרטורה, זמן אחסון; לוודא פרמטרים אלה עולים בקנה אחד / אופטימיזציה עבור הניסויים שלך.
ניתוק של הידרוג'ל מן מצע זכוכית במהלך תרבית תאים. ניקיון silanization שקופיות מסכנים. חלף פתרונות עובדים לניקוי שקופיותsilanization.
הידרוג'ל Overdehydrated. אל תשאירו הידרוג dehydrating על פלטה חשמלית למשך זמן ארוך יותר מאשר 15-30 דקות.
4. ניתוח של נתונים. שונות גבוהה בין כתמים ומגלשות לשכפל. משתנה הוא ייצור מערך. בדוק סיכות ראש ההדפסה הם נקיים. אשר פונקצית אדים. דמיינו ולכמת איכות ספוט מערך באמצעות סמנים ניאון. מערכי חנות כמומלצים לעיל.

טבלה 1: פתרון בעיות.

Discussion

בניסויים שלנו, מצאנו כי הכשלים הנפוצים ביותר קשורים לאיכות מערכים מפוברקים גרוע מאופיין תגובה במערכת הביולוגית של עניין. אנו מפנים את קורא טבלת 1 עבור מצבי כישלון משותפים בניסויי microarray תא שלבי פתרון קשורים. לגבי איכות מערכים בפרט, אנו ממליצים על הבאה. אשר את האיכות הטכנית וביציבות של עֲרִיכָה תוכניות, פרמטרים או מאגר באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently כגון dextran rhodamine מצומדות. לנקות ביסודיות סיכות לפני או אחרי עֲרִיכָה לפי הוראות היצרן ובהמשך לבדוק חזותי שערוצי הסיכה ברורים של פסולת באמצעות מיקרוסקופ אור. אשר שמירת biomolecule ערוכה באמצעות כתמי חלבון כלליים או immunolabeling. שים לב ביומולקולות עם משקל מולקולרי מתחת ל -70 kDa אינן נשמרות לעתים קרובות הידרוג'ל 23, sup> 31. אמת תא-פונקציונלי biomolecule ערוך באמצעות סוגי תאים מרובים. שים לב, רק תאים חסידים תואמי מערכים; בנוסף, הדבקה למערכים תלויים הוא תכונות התא ספציפי (למשל, פרופיל ביטוי integrin) ואת חלבוני ECM שנבחרו.

עקב מספר המקומות המוגבל, לא סיפקנו טיפול רחב בעיצוב המערך, פריסה, ייצור פה מפנים את הקורא הקודם עובד 23, 25. אנו משתמשים בדרך כלל 100 subarrays ספוט (150 מיקרומטר קוטר נקודה, 450 מיקרומטר מרכז אל מרכז מרחק) מורכבים 10-20 תנאי biomolecule ייחודיים (כלומר, 5-10 כתמים / מצב). מספר subarrays במערך אחד משתנה בהתאם למספר תנאים biomolecule של עניין, אשר וניתן לשנותם בנוחות עד 1,280 בשקופית מיקרוסקופ אחד 25 × 75 מ"מ (~ 6,400 נקודות ב -64 subarrays)Xref "> 25, 31 הפרמטרים לעיל ישתנו נוספים בהתאם לדפוס הגודל של עניין;. סיכות מסוגלות לייצר דפוסי 75 - 450 מיקרומטר זמינים.

ניסויי מערך משלימים הטובים ביותר על ידי מתן תוקף תנאים ערוכים שקבלו דירוג הגבוה של עניין באמצעות פורמטי תרבות אחרים, readouts assay, ומערכות מודל ביולוגיות. באופן ספציפי, אנו ממליצים נוספים אימות השפעות של תנאים ערוכים בוחרים בתרביות בתפזורת בשילוב עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (למשל, qRT-PCR, immunoblotting) או תקן TFM. מניפולציה גנטית (למשל, מציאה או ביטוי יתר) של הגורם של עניין מערכת מודל ביולוגית מתאימה יכול לשמש גם כדי לאשר השפעות שנצפו במערכים. בשנת vivo במודלים של בעלי חיים לייצג פירושו אחר של אימות ושימשו לאחרונה, למשל, כדי לאשר את תפקידה המרכזי של galectin-3 ו galectin-8סרטן ריאות נישה גרורתי, כמו בתחילה זיהה באמצעות תא microarray 31, 49.

מספר שיטות אחרות שמשו לחקור תקנת microenvironmental של תפקודים תאיים, כוללים מגוון רחב של דו ממדי מערכות microfabricated 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ו מערכות ביולוגיות מהונדסות תלת ממדי 56, 57, 58 59,, 60, 61. בהשוואה לשיטות אחרות, היתרונות המסוימים של פלטפורמת microarray תא המתואר כאן כוללים: (1) תפוקה עדמאה או אלף שילובים שונים של גורמים, המאפשרים ניתוח של השפעות אינטראקציה; (2) נגישה, הדמיה אוטומטית וניתוח; (3) שילוב של שניהם readouts ביוכימיות biophysical עם המצגת מבוקרת של גורמים ערוכים; (4) יכולת להשתנות תכונות חומר מצע; ו (5) ניתוח של גורל ותפקוד תא תא בודד גבוה תוכן.

לסיכום, שילוב של microarrays תא עם TFM על מצעים של קשיחות המצע מתכונן מאפשרת אפיון מעמיק של שני רמזים ביוכימיים biophysical. כפי שהוצג כאן, פלטפורמה זו היא להכליל וניתן ליישום בקלות למגוון של סוגי תאים חסידים והקשרי רקמות לקראת הבנה טובה יותר של רגולצית microenvironmental קומבינטורית של התמיינות תאי mechanotransduction.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מכירים אוסטין Cyphersmith ו Mayandi Sivaguru (קרל ר Woese המכון לביולוגיה הגנום, אוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה עבור אדיב מסך בנדיבות לכידת וידאו בליבה מיקרוסקופיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27, (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324, (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11, (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25, (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15, (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6, (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23, (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4, (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24, (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3, (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29, (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123, (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48, (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27, (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72, (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2, (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7, (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22, (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18, (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5, (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6, (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3, (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153, (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853, (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282, (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19, (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282, (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5, (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514, (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21, (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8, (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314, (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7, (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10, (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (48), 19632-19637 (2012).
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter