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Bioengineering

सेल भेदभाव और ट्रैक्शन बलों के correlative विश्लेषण के लिए एक उच्च throughput सेल माइक्रोएरे प्लेटफार्म

doi: 10.3791/55362 Published: March 1, 2017

Summary

सेल भेदभाव दोनों मैट्रिक्स संरचना और सब्सट्रेट सामग्री संपत्तियों सहित microenvironmental कारकों की एक मेजबान के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हम यहाँ एक तकनीक कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में दोनों सेल भेदभाव और microenvironmental संदर्भ के एक समारोह के रूप में बायोमैकेनिकल सेल सब्सट्रेट बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए सेल प्रोटीन के उपयोग का वर्णन है।

Abstract

Microfabricated सेलुलर प्रोटीन है, जो एक लोचदार हाइड्रोजेल सतह पर biomolecules के संपर्क मुद्रित संयोजन से मिलकर बनता है, सेल भेदभाव पर arrayed जैव रासायनिक संकेतों के प्रभाव को मापने के लिए एक कसकर नियंत्रित, उच्च throughput इंजीनियर प्रणाली प्रदान करते हैं। सेल प्रोटीन का उपयोग करते हुए हाल के प्रयासों को मिश्रित के अध्ययन है, जिसमें कई कारकों microenvironmental समानांतर में प्रस्तुत कर रहे हैं के लिए उनकी उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। हालांकि, इन प्रयासों सेल प्रतिक्रिया पर जैव रासायनिक संकेतों के प्रभाव की जांच पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित किया है। यहाँ, हम कर्षण बल माइक्रोस्कोपी द्वारा immunofluorescence और biomechanical सेल सब्सट्रेट बातचीत से दोनों सेल भेदभाव के मूल्यांकन के लिए ट्यून करने योग्य सामग्री के गुणों के साथ एक सेल माइक्रोएरे मंच प्रस्तुत करते हैं। ऐसा करने के लिए, हम दो अलग-अलग या तो माइक्रोस्कोप स्लाइड या गिलास नीचे पेट्री डिश पर गढ़े यंग मापांक बदलती के polyacrylamide हाइड्रोजेल उपयोग स्वरूपों का विकास किया है। हम bes प्रदानटी प्रथाओं और इन हाइड्रोजेल substrates पर प्रोटीन का निर्माण, प्रोटीन पर बाद में सेल संस्कृति, और डेटा के अधिग्रहण के लिए समस्या निवारण। यह मंच है जो दोनों जैव रासायनिक (जैसे, बाह्य मैट्रिक्स संरचना) और biophysical के लिए (जैसे, सब्सट्रेट कठोरता) संकेतों महत्वपूर्ण निभा सकते हैं, भूमिकाओं पारस्परिक जैविक प्रक्रियाओं की जांच में उपयोग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

Introduction

कोशिकाओं और microenvironmental कारकों आसपास के बीच सहभागिता विकास, homeostasis, और रोग रोगजनन 1, 2, 3, 4 भर में जैविक प्रक्रियाओं की एक बड़ी विविधता मध्यस्थता। ये microenvironmental बातचीत ligand-रिसेप्टर बंधन के माध्यम से सेल सेल बातचीत कोशिकाओं को घुलनशील कारकों में से वितरण, सेल मैट्रिक्स बंधन, और शामिल हैं। ऊपर जैव रासायनिक विचार करने के अलावा, इस तरह के सब्सट्रेट यांत्रिक गुणों के रूप में biophysical मापदंडों, (जैसे, यंग मापांक, porosity) और सेल के आकार, और संबंधित डाउनस्ट्रीम mechanotransduction तेजी से मान्यता सेल भेदभाव 5, 6, 7, 8 के प्रमुख मध्यस्थों के रूप में प्राप्त की है, 9 10। इन microenvironmental बातचीत से उत्पन्न सिग्नल जीन नेटवर्क और संकेत दे रास्ते के लिए सामग्री के रूप में सेवा करते हैं। इसके अलावा, इन सेल आंतरिक घटकों को भी स्रावित कारकों और मैट्रिक्स अपमानजनक एंजाइमों, सेल आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों और सेल बाह्य कारकों microenvironmental 5, 11, 12 के बीच एक जटिल सह नियामक पाश को पूरा करने के माध्यम से microenvironment को फीडबैक प्रदान करते हैं।

Microenvironmental कारकों में से नियंत्रित प्रस्तुति के लिए इंजीनियर सिस्टम के उपयोग के अलग अलग संदर्भों 13, 14, 15 के एक रेंज में उपयोगी साबित हो गया। विशेष रूप से microfabricated सिस्टम miniaturization 13 के माध्यम से प्रोटीन और कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से अत्यधिक parallelized विश्लेषण के सटीक स्थानिक patterning में मदद की है, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22। सेल प्रोटीन एक ऐसी प्रणाली है जो microfabricated में biomolecules के संयोजन संपर्क छपी एक लोचदार polyacrylamide हाइड्रोजेल सब्सट्रेट 23, 24, 25 पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। सेल चिपकने वाला घटकों (अर्थात् मैट्रिक्स प्रोटीन) का समावेश निरंतर कोशिका आसंजन और प्रोटीन पर संस्कृति है, जो अक्सर immunocytochemistry और फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के माध्यम से नीचे की ओर विश्लेषण द्वारा पीछा किया जाता है सक्षम बनाता है। सेल प्रोटीन उत्पादकता जिगर सेल phenotype 23, 26, तंत्रिका अग्रदूत भेदभाव 27, mammar का एक बेहतर समझ हासिल करने की दिशा में निर्देशित किया गया हैY पूर्वज भाग्य का निर्णय 28, भ्रूण स्टेम सेल रखरखाव / भेदभाव 23, 29, 30, फेफड़ों के कैंसर मेटास्टेसिस 31, और 32 मेलेनोमा में चिकित्सीय प्रतिक्रिया। हमने हाल ही में एण्डोडर्म विनिर्देश 33, जिगर पूर्वज भेदभाव 34, 35, और फेफड़ों के ट्यूमर सेल दवा प्रतिक्रिया 36 में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन संरचना की भूमिका को परिभाषित करने के लिए सेल प्रोटीन के उपयोग का प्रदर्शन किया है। इन कार्यों में, हम सरणी मंच के मिश्रित क्षमताओं का विस्तार और बाह्य मैट्रिक्स संरचना और बायोमैकेनिक्स के साथ सेल आंतरिक सिगनल के चौराहों की खोज पर ध्यान केंद्रित किया है। इसके अलावा, हम इस सरणी मंच में biophysical readouts को लागू किया है मात्रात्मक चरित्र करने की क्षमता प्रदान करने के लिएभेदभाव में सेल सिकुड़ना की terize भूमिका 35 प्रक्रियाओं। ऐसा करने के लिए, हम एकीकृत सेल प्रोटीन के साथ कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) सेल जनित कर्षण के उच्च throughput आकलन कर सकें। TFM सेल जनित कर्षण बलों को मापने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग विधि है और एकल कोशिका और संरचना और स्थानीय microenvironment 37, 38, 39, 40 के बायोमैकेनिक्स के साथ ऊतक स्तरीय समारोह के समन्वय के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। इस प्रकार, सेल प्रोटीन के साथ TFM के संयोजन कुंजी, physiologically प्रासंगिक biophysical मानकों को मापने के लिए एक उच्च throughput प्रणाली प्रदान करता है।

सेल माइक्रोएरे यहाँ वर्णित मंच चार वर्गों के होते हैं: Polyacrylamide substrates, सरणियों, सेल संस्कृति और परख readout के निर्माण, और डेटा के विश्लेषण का निर्माण। देखपहले तीन प्रयोगात्मक वर्गों का एक योजनाबद्ध सारांश के लिए चित्रा 1; इम्यूनोफ्लोरेसेंस आंकड़ों के विश्लेषण पर ध्यान देने के साथ अंतिम खंड के एक योजनाबद्ध सारांश के लिए चित्र 2 देखें। आदेश बायोमैकेनिकल सेल सब्सट्रेट बातचीत के अध्ययन के लिए सेल माइक्रोएरे मंच अनुकूल करने के लिए, हम ट्यून करने योग्य यंग मापांक लेकिन इसी तरह के porosity के polyacrylamide substrates इस्तेमाल किया, प्रति वेन एट अल। 41। उनकी सब्सट्रेट पर कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों की TFM माप सक्षम करने के लिए, हम मोटी कांच माइक्रोस्कोप अक्सर अन्य समूहों द्वारा उपयोग स्लाइड्स के अलावा एक गिलास नीचे पेट्री डिश प्रारूप लागू किया है। इस प्रकार, इस सेल माइक्रोएरे मंच TFM के माध्यम से खुर्दबीन स्लाइड और सेल उत्पन्न बलों पर immunofluorescence के माध्यम से सेल भेदभाव के समानांतर माप अलग गिलास नीचे बर्तन पर करने में सक्षम है। हम यह भी विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण आमतौर पर सेल प्रोटीन के साथ प्रयोग करने के लिए कई सुधार लागू है। specificalLy, समग्र द्वीप तीव्रता के पैरामीट्रिक जेड-स्कोरिंग के बजाय, हम एकल कोशिका तीव्रता मापने के लिए और आदेश गैर सामान्य वितरण के लिए खाते में और अधिक सही सेलुलर व्यवहार का वर्णन करने में quantile सामान्य बनाने के लागू होते हैं। हमारा मानना ​​है कि इन सुधारों के जैविक प्रक्रियाओं, जिसमें दोनों जैव रासायनिक और biophysical संकेतों महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं पारस्परिक की जांच की दिशा में विशेष उपयोगिता प्रदान करते हैं। इसके अलावा, हमारे विश्लेषणात्मक सुधार सेलुलर कार्यों जिसके लिए एकल कोशिका और जनसंख्या के स्तर का व्यवहार हट जाना की एक श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए सेल प्रोटीन के आवेदन को सक्षम।

Protocol

1. Polyacrylamide Substrates का निर्माण

  1. स्वच्छ कांच substrates - क्रम में सेल संस्कृति के दौरान इष्टतम polyacrylamide हाइड्रोजेल निर्माण और अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए - समापन बिंदु immunofluorescence या गिलास नीचे 35 मिमी TFM के लिए पेट्री डिश के लिए या तो मानक खुर्दबीन स्लाइड। वैकल्पिक रूप से, उपयोग पूर्व साफ ग्लास substrates।
    1. 0.25% वी में कांच substrates विसर्जित / वी ट्राइटन X-100 आसुत जल में (DH 2 हे)। 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर substrates रखें।
    2. ट्राइटन X-100 समाधान निकालें और substrates कुल्ला 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर अंतिम कुल्ला और जगह में डूबे substrates DH 2 ओ छोड़ के साथ 5 बार।
    3. हटाये DH 2 हे और एसीटोन में substrates विसर्जित कर दिया। 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर substrates रखें।
    4. एसीटोन निकालें और मेथनॉल में substrates विसर्जित कर दिया। 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर substrates रखें।
    5. मेथनॉल निकालें और धनबाद के साथ substrates कुल्ला 5 बार <उप> 2 0.05 एन NaOH में ओ विसर्जित substrates और 1 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर जगह है।
      चेतावनी: NaOH अत्यधिक कास्टिक है और गंभीर त्वचा जलता है और आंख नुकसान का कारण बन सकता है। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंखों की सुरक्षा पहनें।
    6. NaOH समाधान निकालें और substrates सूखी और सूखी जब तक एक गर्म थाली पर 110 डिग्री सेल्सियस पर गरम करने के लिए substrates कुल्ला फ़िल्टर संपीड़ित हवा DH 2 ओ उपयोग के साथ 5 बार (5 - 15 मिनट)। साफ substrates अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. आदेश polyacrylamide हाइड्रोजेल की कुर्की सुनिश्चित करने के लिए स्वच्छ कांच substrates Silanize।
    1. इथेनॉल में हौसले से तैयार 2% वी / वी 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate (3-TPM) में साफ ग्लास substrates विसर्जित कर दिया। 30 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर substrates रखें।
      चेतावनी: 3-TPM एक दहनशील तरल है। गर्मी, स्पार्क्स, खुली आग, और गर्म सतहों से दूर रखें और एक रासायनिक धूआं हुड में ही इस्तेमाल करते हैं।
    2. 3-TPM समाधान निकालें और etha में substrates विसर्जितNol। 5 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर substrates रखें।
    3. फ़िल्टर संपीड़ित हवा का उपयोग substrates सूखी और सूखी जब तक एक गर्म थाली पर 110 डिग्री सेल्सियस पर गरम करने के लिए (5 - 15 मिनट)। Silanized substrates 1 महीने तक के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. विकल्प 1: समापन बिंदु immunofluorescence के लिए silanized खुर्दबीन स्लाइड पर polyacrylamide हाइड्रोजेल बनाना।
    1. DH में एक पूर्व बहुलक समाधान तैयार 2 हे वांछित एक्रिलामाइड / bisacrylamide प्रतिशत (w / v) अनुपात 4 किलो पास्कल (4% एक्रिलामाइड, 0.4% bisacrylamide), 13 किलो पास्कल (6% एक्रिलामाइड, 0.45 की यंग moduli साथ substrates निर्माण करने के लिए के साथ % bisacrylamide), या 30 किलो पास्कल (8% एक्रिलामाइड, 0.55% bisacrylamide) और इसी तरह के porosity, वेन एट अल प्रति। 41। साफ है जब तक भंवर समाधान और एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज के साथ फिल्टर। पूर्व बहुलक समाधान 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      चेतावनी: एक्रिलामाइड या bisacrylamide के संपर्क में तीव्र विषाक्तता में परिणाम कर सकते हैं, neurotoxicity, और जलन। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंखों की सुरक्षा पहनें।
    2. एक photoinitiator मेथनॉल में डब्ल्यू / वी Irgacure 2959 20% की समाधान तैयार है। इस photoinitiator समाधान जमा नहीं किया जा सकता है और नए सिरे से प्रत्येक समय तैयार रहना चाहिए।
    3. 1 (पूर्व बहुलक: photoinitiator) अनुपात एक 9 में पूर्व बहुलक और photoinitiator समाधान मिक्स। 15 मिनट के बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात चैम्बर के साथ वैकल्पिक देगास।
    4. silanized स्लाइड एक गिलास सुखाने ट्रे में रखें और 9 के 100 μL pipet: 1 पूर्व बहुलक: प्रत्येक स्लाइड पर photoinitiator समाधान। जबकि बुलबुले के सृजन से परहेज धीरे से एक 22 × 60 मिमी coverslip के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर किया। ध्यान दें कि coverslip ऑक्सीजन द्वारा polymerization प्रतिक्रिया के निषेध से बचाता है।
    5. एक यूवी crosslinker में रखें सुखाने ट्रे और 10 मिनट (4 डब्ल्यू / एम 2) के लिए 365 एनएम यूवी एक करने के लिए स्लाइड बेनकाब। polymerization के समय का अनुकूलन के रूप में की जरूरत है। लंबे समय तक जोखिम कठिनाई overpolymerization के कारण coverslip हटाने जोखिम। कम जोखिम rISK underpolymerization और कम हाइड्रोजेल स्थिरता।
    6. 5 मिनट के लिए DH 2 हे में हाइड्रोजेल विसर्जित कर दिया। एक रेजर के साथ coverslips निकालें, देखभाल करने के polymerized हाइड्रोजेल नुकसान नहीं है।
    7. 1 कमरे के तापमान पर DH 2 हे में हाइड्रोजेल छोड़ दो - 3 डी, बदलते DH 2 हे दैनिक। अप करने के लिए 3 महीने के लिए कमरे के तापमान पर - (30 मिनट 15) और दुकान सूखी जब तक एक गर्म थाली पर 50 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल निर्जलीकरण।
  4. विकल्प 2: TFM का उपयोग करते हुए सेल सब्सट्रेट बातचीत का जीना मूल्यांकन के लिए silanized 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश पर फ्लोरोसेंट मनका युक्त polyacrylamide हाइड्रोजेल बनाना।
    1. 15 मिनट के समुच्चय को तितर-बितर करने के लिए 1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट मोती के एक शेयर समाधान Sonicate।
    2. DH में एक पूर्व बहुलक समाधान तैयार 2 हे वांछित एक्रिलामाइड / bisacrylamide प्रतिशत (w / v) अनुपात 4 किलो पास्कल (4% एक्रिलामाइड, 0.4% bisacrylamide), 13 किलो पास्कल (6% एक्रिलामाइड, 0 की यंग moduli साथ substrates निर्माण करने के लिए के साथ.45% Bisacrylamide), या 30 किलो पास्कल (8% एक्रिलामाइड, 0.55% bisacrylamide) और इसी तरह के porosity, वेन एट अल प्रति। 41। साफ है जब तक भंवर समाधान और एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज के साथ फिल्टर। पूर्व बहुलक समाधान 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      चेतावनी: एक्रिलामाइड या bisacrylamide के संपर्क में तीव्र विषाक्तता, न्यूरोटॉक्सिटी, और जलन हो सकती है। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंखों की सुरक्षा पहनें।
    3. 0.2% वी / वी और मिश्रण करने के भंवर के अंतिम एकाग्रता में पूर्व बहुलक समाधान के लिए फ्लोरोसेंट मोती जोड़ें।
    4. एक photoinitiator मेथनॉल में डब्ल्यू / वी Irgacure 2959 20% की समाधान तैयार है। इस photoinitiator समाधान जमा नहीं किया जा सकता है और नए सिरे से प्रत्येक समय तैयार रहना चाहिए।
    5. 1 (पूर्व बहुलक / मनका: photoinitiator) अनुपात एक 9 में पूर्व बहुलक / मनका और photoinitiator समाधान मिक्स। 15 मिनट के बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात चैम्बर के साथ वैकल्पिक देगास।
    6. silanized 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश एक गिलास सुखाने ट्रे और पी में रखें9 के IPET 20 μL: 1 पूर्व बहुलक / मनका: प्रत्येक पकवान के केंद्र पर photoinitiator समाधान। जबकि बुलबुले के सृजन से परहेज धीरे से एक 12 मिमी परिपत्र coverslip साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर किया। ध्यान दें कि coverslip ऑक्सीजन द्वारा polymerization प्रतिक्रिया के निषेध से बचाता है।
    7. आदेश हाइड्रोजेल की सतह के लिए फ्लोरोसेंट मोती वितरित करने के लिए, बर्तन पलटना और टीला एट अल प्रति, 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। 42।
    8. हालांकि अभी भी उल्टे, 10 मिनट (4 डब्ल्यू / एम 2) के लिए 365 एनएम यूवी एक व्यंजन का पर्दाफाश। polymerization के समय का अनुकूलन के रूप में की जरूरत है। लंबे समय तक जोखिम कठिनाई overpolymerization के कारण coverslip हटाने जोखिम। कम जोखिम जोखिम underpolymerization और कम हाइड्रोजेल स्थिरता।
    9. 0.1 एम 4- (2-hydroxyethyl) में विसर्जित कर दिया हाइड्रोजेल -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) बफर और अंधेरे में रात भर कमरे के तापमान पर छोड़ दें। , एक रेजर के साथ सावधानी से coverslips निकालें ख्याल रख रही polyme को नुकसान नहींrized हाइड्रोजेल।
    10. सूखी जब तक एक गर्म थाली पर 50 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल निर्जलीकरण (15 - 30 मिनट)। हाइड्रोजेल 3 महीने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. सारणियों का निर्माण

  1. biomolecules मुद्रित करने के लिए बफ़र्स तैयार करें। मुद्रण बफर ब्याज की biomolecules के लिए उचित प्रयोग करें। वृद्धि कारक (GF) मुद्रण बफर ऐसे सेल सेल ligands के रूप में अणुओं के अन्य वर्गों के लिए मोटे तौर पर उपयुक्त है।
    1. 2 × ईसीएम प्रोटीन मुद्रण बफर तैयार करने के लिए, सोडियम एसीटेट के 164 मिलीग्राम और 6 मिलीलीटर DH 2 ओ भंवर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) की 37.2 मिलीग्राम जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते अच्छी तरह से solubilize के लिए। solubilization के बाद, पूर्व गर्म ट्राइटन X-100 के 50 μL और ग्लिसरॉल के 4 एमएल जोड़ें। भंवर और solubilize के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते फिर से। हिमनदों एसिटिक एसिड के 80 μL, 4.8 पीएच को समायोजित करने के लिए titrating - 40 जोड़ें। 2 × ईसीएम प्रोटीन मुद्रण बफर 4 में संग्रहित किया जा सकता1 महीने के लिए सें।
      चेतावनी: एसिटिक एसिड ज्वलनशील और संक्षारक है। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंखों की सुरक्षा पहनें।
    2. 2 × GF मुद्रण बफर तैयार करने के लिए, 6 एमएल फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए 105.5 मिलीग्राम सोडियम एसीटेट और 37.2 मिलीग्राम EDTA जोड़ें। भंवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते अच्छी तरह से solubilize के लिए। ग्लिसरॉल के [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (लोग) और 4 एमएल - solubilization के बाद, 100 मिलीग्राम 3 जोड़ें। 2 × GF प्रोटीन मुद्रण बफर 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. स्रोत प्लेट तैयार करें।
    1. 384 अच्छी तरह से वी के नीचे microplate में डबल लक्ष्य एकाग्रता में प्रत्येक बायोमोलिक्यूल समाधान के साथ 2 × मुद्रण बफर के बराबर मात्रा गठबंधन।
      नोट: सबसे आम ईसीएम प्रोटीन के लिए एक उचित लक्ष्य एकाग्रता जबकि arrayed कारकों के अन्य प्रकारों के लिए लक्ष्य सांद्रता हाइड्रोजेल और जैविक समारोह में अवधारण के आधार पर बदलती 250 माइक्रोग्राम / एमएल है। प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा हो सकती हैके रूप में और 5 μL के रूप में कम नहीं की जरूरत है और अधिक से अधिक 15 μL हो। ब्याज की बायोमोलिक्यूल संयोजन के अलावा, क्रम में नीचे की ओर छवि विश्लेषण की सुविधा के लिए एक arrayed फ्लोरोसेंट मार्कर शामिल हैं। rhodamine संयुग्मित dextran (2.5 मिलीग्राम / एमएल) का प्रयोग करें।
    2. प्रत्येक pipetting द्वारा अच्छी तरह से अच्छी तरह मिक्स, देखभाल करने के बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं। 100 × छ पर 1 मिनट के लिए स्रोत microplate अपकेंद्रित्र। स्रोत प्लेटें एक ही दिन में तैयार किया है और माइक्रोएरे निर्माण जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत का उपयोग कर प्रोटीन बनाना।
  3. स्वच्छ पिन प्रत्येक माइक्रोएरे निर्माण चलने से पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार। सीधे microarrayer की printhead में साफ पिन लोड।
  4. निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर microarrayer और कार्यक्रम तैयार करें। हालांकि नीचे दिए गए चरणों आंशिक रूप से विशेष रूप से यहां इस्तेमाल किया microarrayer के लिए विशिष्ट हैं, सबसे microarrayers के आपरेशन के समान है।
    1. humidifier इकाई चालू करें, (65% आरएच करने के लिए सेट बिंदु समायोजित गैर-condensing), और जब तक प्रतीक्षा करें rheometer सेट बिंदु मेल खाता है। उचित एडाप्टर के स्रोत की थाली रखें।
    2. 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल substrates निर्जलीकरण और उचित एडाप्टर में जगह है। microarrayer दोनों माइक्रोस्कोप स्लाइड और microplates के लिए एडेप्टर है। 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश प्रोटीन के लिए, 6 अच्छी तरह से microplate में बर्तन लोड और arrayer पर microplate अनुकूलक में microplate जगह है।
    3. सही स्रोत प्लेट, सरणी डिजाइन, और वांछित प्रारूप (जैसे, माइक्रोस्कोप स्लाइड या microplate 35 मिमी पेट्री डिश युक्त) के लेआउट को प्रतिबिंबित करने के कार्यक्रम के मापदंडों को समायोजित करें। आदेश ले और अधिक से पार संक्रमण को रोकने के लिए हर हालत के बीच दोनों पानी और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) का उपयोग धोने कदम शामिल करें।
    4. सरणी निर्माण शुरू, एक बार एक घंटे कि नमी नीचे 65% आरएच (गैर संघनक) गिरा नहीं है की तुलना में और कहा कि पिन भरा नहीं कर रहे हैं कम नहीं अक्सर जाँच। Humi हैंdity अप्रत्याशित रूप से हटा दिया गया है, humidifier भरने और संक्षेपण के जुड़े नलियों स्पष्ट करने के प्रोटीन को थामने। पिन भरा रहे हैं, तो पिन साफ ​​करने के लिए या अन्यथा पूर्व साफ पिन के साथ की जगह प्रोटीन को थामने। ध्यान दें कि यह पर्याप्त समय सुखाने प्रदान की ही substrates (यानी, 4 घंटे के लिए रात भर के लिए) पर biomolecules क्रमिक रूप से की सरणी कई प्रकार के लिए संभव है।
    5. एक बार जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, एक स्लाइड बॉक्स या microplate कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम पन्नी और 65% आरएच (गैर संघनक) रातोंरात के साथ कवर में गढ़े सरणियों जगह है। नोट यह सामान्य प्रोटीन दाग या immunofluorescence का उपयोग करने वालों की गुणवत्ता और प्रतिधारण मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हो सकता है; Brafman एट अल देखें। अधिक जानकारी के लिए 25।

3. सेल संस्कृति और परख पढ़ा गया

  1. दिन के निर्माण के बाद, 4-संभाग व्यंजन (माइक्रोस्कोप स्लाइड) या 6 अच्छी तरह से microplates (पेट्री डिश) में arrayed substrates जगह और 1% में विसर्जितवी / वी पेनिसिलिन / पीबीएस में स्ट्रेप्टोमाइसिन; स्लाइड्स के लिए 4 एमएल और व्यंजनों के लिए 3 एमएल का उपयोग करें। 30 मिनट के लिए यूवी सी को बेनकाब। एक्सचेंज पेनिसिलिन / सेल संस्कृति मीडिया के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान।
  2. लीजिए और कोशिकाओं की गिनती। 500 × 10 3 में सरणियों पर बीज - 2 × 10 6 कोशिकाओं / माइक्रोस्कोप स्लाइड प्रति 4 एमएल और प्रति 35 मिमी पेट्री डिश में 3 एमएल सरणी। 24 घंटे या अच्छी तरह से आबादी सेल द्वीप समूह के गठन तक - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सरणी संस्कृतियों सेते हैं और 5% सीओ 2। दोनों बोने घनत्व और समय के रूप में अपने कोशिकाओं और विशेष रूप से आवेदन के लिए आवश्यक समायोजित करें। Underseeding (यानी, कम घनत्व या बोने के समय) गरीब सरणी जनसंख्या और विषम जैविक परिणामों में हो सकता है। Overseeding (यानी, उच्च घनत्व या बोने के समय) कम सरणी अखंडता में द्वीप टुकड़ी के कारण हो सकता है।
  3. सेल द्वीप समूह के गठन के लिए अनुमति देता है, पूर्व गर्म सेल संस्कृति मीडिया के साथ दो बार सरणी संस्कृतियों धोने के बाद; फिर स्लाइड और व्यंजनों के लिए 3 एमएल के लिए 4 एमएल का उपयोग करें। optionally उचित नियंत्रण और उपचार जैविक प्रणाली के हित के लिए (जैसे, छोटे अणु inhibitors, वृद्धि कारक, आदि) जोड़ें। आदेश में किसी भी उपचार की एकाग्रता बनाए रखने के लिए 2 डी - सरणियों हर 1 के मीडिया बदलें। सरणी संस्कृतियों की शुरुआत के 5 डी - - भीतर 1 TFM द्वारा immunofluorescence या सेल सब्सट्रेट बातचीत से सेल मार्कर अभिव्यक्ति और सेल समारोह का मूल्यांकन विकल्प 1 और नीचे विकल्प 2 देखें।
  4. विकल्प 1: समापन बिंदु immunofluorescence प्रदर्शन करना। ध्यान दें कि कुछ प्रोटीन के immunofluorescence मेथनॉल, इथेनॉल, या एचसीएल का उपयोग कर अधिक कड़े permeabilization आवश्यकता हो सकती है। सरणियों के लिए संभावित नुकसान के कारण, मूल्यांकन और बड़े पैमाने पर प्रयोग में उपयोग करने से पहले प्रत्येक permeabilization प्रोटोकॉल का अनुकूलन।
    1. 4-संभाग बर्तन में सरणी स्लाइड से महाप्राण सेल संस्कृति मीडिया और / वी paraformaldehyde पीबीएस में (पीएफए) जोड़ने के 4 मिलीग्राम / हौसले से तैयार 4% वी के स्लाइड। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      चेतावनी: Exposपीएफए ​​के लिए Ure तीव्र विषाक्तता में परिणाम कर सकते हैं और यह भी जलन या संपर्क पर त्वचा खुरचना कर सकते हैं। सुरक्षात्मक दस्ताने, कपड़े, और आंखों की सुरक्षा पहनें और एक रासायनिक धूआं हुड में ही इस्तेमाल करते हैं।
    2. महाप्राण पीएफए ​​समाधान और पीबीएस के 4 एमएल के साथ प्रत्येक स्लाइड 3 बार धोएं। इस बिंदु पर, तय स्लाइड 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। यह आदेश सरणी अखंडता को सुनिश्चित करने में immunolabeling और फिक्सिंग के रूप में एक ही दिन में बढ़ते के माध्यम से जारी रखने के लिए सलाह दी जाती है, लेकिन।
    3. महाप्राण पीबीएस और जोड़ने 4 मिलीग्राम / 0.25% वी के स्लाइड / वी पीबीएस में ट्राइटन X-100। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. महाप्राण ट्राइटन X-100 के समाधान और पीबीएस के 4 एमएल के साथ प्रत्येक स्लाइड 3 बार धोएं। 4 एमएल / 5% वी / वी सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के लिए मिलान की स्लाइड जोड़ें (जैसे, गधा माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए गधा सीरम) पीबीएस में और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक स्लाइड से अवरुद्ध समाधान निकालें। 500 μL / पीबीएस में 5% वी / वी सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की स्लाइड जोड़ें। यह मात्रा 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर दोनों 1 घंटे incubations के लिए सरणियों के रूप में अच्छी तरह से रात भर incubations को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
    6. पीबीएस के 4 एमएल के साथ प्रत्येक सरणी स्लाइड 3 बार धोएं। अच्छी तरह से अंतिम धोने को हटाने और 500 μL / पीबीएस में 5% वी / वी सीरम में पतला उचित माध्यमिक एंटीबॉडी की स्लाइड जोड़ें।
    7. पीबीएस के 4 एमएल के साथ प्रत्येक सरणी स्लाइड 3 बार धोएं। ध्यान से समाधान का उपयोग संदंश से सरणी स्लाइड हटाने से पहले DH 2 हे के साथ संक्षिप्त धो लें। बाती या सूखी अवशिष्ट DH 2 ओ एक प्रयोगशाला ऊतक का प्रयोग करें
    8. स्लाइड भर DAPI के साथ समाधान बढ़ते जबकि नेत्रहीन पूरे सरणी की पूरी कवरेज इस बात की पुष्टि की Pipet 100 μL।
    9. स्लाइड माउंट खत्म करने के लिए एक 22 × 60 मिमी coverslip रखें। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील। इमेजिंग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस, अगले दिन से पहले नहीं पर अंधेरे में स्टोर।
    10. छवि पूरे सरणियों या तो एक माइक्रोएरे स्कैनर या उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर equippएक रोबोट मंच के साथ एड। माइक्रोएरे स्कैनर तेज readout प्रदान करते हैं लेकिन Cy3- या Cy5-संगत fluorophores आवश्यकता हो सकती है और एकल कक्षों के आदेश पर अक्सर सीमित संकल्प के हैं (यानी, 1 - 10 माइक्रोन)। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप उच्च संकल्प (<1 माइक्रोन, ~ 100 × कुल बढ़ाई) फ्लोरोसेंट चैनलों की एक किस्म का उपयोग करने का विकल्प प्रदान करते हैं और लेकिन रोबोट मंच और बढ़ाई / उद्देश्य की गुणवत्ता के आधार पर धीमी readout प्रदान करते हैं।
    11. सहेजें आदेश डेटा संपीड़न या अन्य फ़ाइल स्वरूपों (जैसे, जेपीजी) के साथ जुड़े नुकसान को रोकने के लिए झगड़ा फ़ाइलों के रूप में या तो विधि से पूरे सरणियों की छवियों पर कब्जा कर लिया।
  5. विकल्प 2: TFM का उपयोग करते हुए सेल सब्सट्रेट बातचीत का जीना मूल्यांकन प्रदर्शन।
    1. 1% वी / वी गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 1% v / v सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) पीबीएस में से एक समाधान TFM दौरान substrates से कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए तैयार।
    2. 35 मिमी पेट्री करने के लिए सरणी संस्कृतियों युक्त व्यंजन ले जाएँएक incubated (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2), TFM मापन के लिए एक रोबोट चरण के साथ उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप।
      1. एक डिश में, पदों (एक्स-समन्वय स्थापित वाई-समन्वय) निशान और विमानों ध्यान केंद्रित चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग अलग-अलग सेल द्वीपों में से (जेड समन्वय)।
      2. अब तक लाल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए स्विच मोती कल्पना करने के लिए। पिछले चरण में बचाया पदों में से प्रत्येक के लिए वापस जाएँ और सही फोकस विमान के Z समन्वय केवल इतना है कि सेल द्वीप नीचे मोतियों की पहली परत ध्यान में है। नई निर्देशांक सहेजें और पूर्व हदबंदी चरण विपरीत है और अब तक लाल फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा करने के लिए सभी सेल द्वीपों के स्वचालित इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।
    3. ध्यान से डिश के लिए बीएसए / एसडीएस समाधान के 150 μL जोड़ें और 5 मिनट के इंतजार सब्सट्रेट से पूरा सेल हदबंदी के लिए अनुमति देने के लिए; चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल हदबंदी की निगरानी।
    4. बाद सेल द्वीपों सब्सट्रेट से अलग कर दिया गया है, टी करने के लिए वापसवह पदों चिह्नित और जाँच करें कि मोतियों की पहली परत ध्यान केंद्रित करने में अभी भी कर रहे हैं। इन मोतियों बाहर के विमान सेल जनित कर्षण से प्रेरित विकृति के कारण कर रहे हैं, तो सही फोकस विमान के Z समन्वय ताकि वे ध्यान में फिर रहे हैं। सुधारा जेड निर्देशांक बचाने के लिए और सभी द्वीपों के स्वचालित इमेजिंग दोहराने के बाद हदबंदी दूर लाल फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा करने के लिए।
    5. 3.5.4 शेष व्यंजनों के लिए - दोहराएँ 3.5.1 कदम।

4. डेटा का विश्लेषण

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा का विश्लेषण।
    1. प्रक्रिया सरणी छवियों का अधिग्रहण किया। अलग-अलग चैनलों (यानी, लाल, नीले, हरे या) युक्त फ़ाइलों में समग्र सरणी छवियों को विभाजित और 8 बिट झगड़ा छवियों 43, 44 कन्वर्ट करने के लिए। Binning (जैसे, 2 × 2 या 4 × 4) छवि का आकार कम करने के लिए ~ चैनल के अनुसार 32 मेगापिक्सल Enti के बहाव के एकल कोशिका विश्लेषण के दौरान स्मृति आवश्यकताओं को कम करने के लिएसरणी छवियों रहे हैं। इन सरणी प्रसंस्करण कदम की एक ImageJ मैक्रो कार्यान्वयन के लिए "array_processing.ijm" शीर्षक से पूरक संहिता फ़ाइल देखें।
    2. नोट के ऊपर छोड़ दिया, नीचे छोड़ दिया, और नीचे सही rhodamine संयुग्मित dextran मार्करों या arrayed की स्थिति के पिक्सल में निर्देशांक। पूरी तरह से खड़ी होने के लिए 8 बिट झगड़ा छवियों को बारी बारी से करने के लिए इन निर्देशांक का प्रयोग करें और, बाद में, विशिष्ट arrayed शर्तों के साथ एकल कोशिका विश्लेषण से उत्पादन व्याख्या करने के लिए। पूरक कोड फ़ाइलें शीर्षक "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", और "array_gridding.ijm" ये सरणी घूर्णन और कदम gridding के कार्यान्वयन के लिए देखें।
    3. IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects, और MeasureObjectIntensity: binned की एकल कोशिका विश्लेषण करते हैं, निम्नलिखित मॉड्यूल का उपयोग कर (संस्करण 2.1.1) 45 CellProfiler में 8 बिट झगड़ा छवियों घुमाया। IdentifyPrimaryObjects नाभिक को दिखाता है, IdentifySecondaryObjects प्रत्येक कोशिका के नाभिक के साथ जुड़े immunolabels दिखाता है, और MeasureObjectIntensity दोनों परमाणु लेबल और immunolabels के लिए quantifications प्रदान करता है।
      1. ExportToSpreadsheet मॉड्यूल का उपयोग कर चैनल द्वारा एक सीएसवी फाइल के रूप में सभी तीन मॉड्यूल से आउटपुट एकल कोशिका डेटा बाद में नीचे की ओर विश्लेषण की सुविधा। लाल, हरे, नीले या चैनलों युक्त छवि सेट के लिए इन चरणों को लागू करने CellProfiler पाइपलाइनों के लिए पूरक कोड फ़ाइलें शीर्षक "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", और "rgb_array_image_analysis.cppipe" देखें।
    4. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता और गैर गाऊसी एकल कोशिका वितरण के लिए खाते में डेटा को बदलने के लिए, जैविक को दोहराने के 46 से quantile सामान्य बनाने के लागू होते हैं। इस प्रक्रिया प्रतिकृति भर में एक साझा वितरण उत्पन्न करता है और immunolabel तीव्रता में परिवर्तन की निष्पक्ष तुलना में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यूएनएलआइक जेड-स्कोरिंग और अन्य पैरामीट्रिक तरीकों, quantile सामान्य बनाने गैर पैरामीट्रिक है और डेटा की एक विशेष वितरण ग्रहण नहीं करता है, अधिक प्रतिनिधि के लिए अनुमति arrayed हालत के एक समारोह के रूप में एकल कोशिका व्यवहार का विश्लेषण करती है।
    5. डेटा प्लॉट और व्याख्या। जैविक प्रणाली और परिकल्पना के आधार पर, गणना करने और एक या एक से प्रत्येक arrayed हालत के लिए निम्नलिखित उपायों का पहनावा अधिक की साजिश:
      1. गणना और प्रयोग के पाठ्यक्रम पर आसंजन और अस्तित्व का एक उपाय के रूप में संयुक्त द्वीप प्रति कोशिकाओं साजिश है।
      2. गणना और सेल भाग्य या समारोह के एक उपाय के रूप में quantile सामान्यीकृत immunolabel तीव्रता साजिश है।
      3. गणना और के रूप में आमतौर पर ऊपर 2 एसडी एक नकारात्मक नियंत्रण की तीव्रता मतलब एक सुसंगत सीमा से ऊपर तीव्रता द्वारा निर्धारित, एक immunolabel के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत साजिश है।
      4. वैकल्पिक रूप से, क्रम में immunolabel तीव्रता की साजिश वितरण की जांच करने और एकल कोशिका व्यवहार वर्गीकृत करने के लिएarrayed हालत के एक समारोह के रूप में। इन वितरण आगे केंद्रीय प्रवृत्ति (मतलब है, औसत, मोड) और भिन्नता (विचरण, विभिन्नता का गुणांक, Fano कारक) और ऐसे Kolmogorov-Smirnov परीक्षण के रूप में परिकल्पना परीक्षण तरीकों के उपायों का उपयोग होती जा सकता है।
  2. TFM डेटा का विश्लेषण। यहाँ एक दृष्टिकोण बटलर एट अल द्वारा एक पहले से विकसित एल्गोरिथ्म को शामिल बताया गया है। और वांग एट अल। 40, 47।
    1. बैच के लिए ImageJ का प्रयोग करें 8-बिट झगड़ा फाइल करने के लिए छवियों को बदलने। लागू पिक्सेल औसतन binning (जैसे, 2 × 2) कम्प्यूटेशनल लागत और नीचे की ओर विश्लेषण के समय को कम करने के लिए। के रूप में TFM के लिए एल्गोरिदम काफी हद तक एकल कोशिका विश्लेषण, एक एकल कोशिका के कोशिका-सब्सट्रेट इंटरफेस की तुलना में द्वीपों (~ 17.5 × 10 3 माइक्रोन 2) की बड़ी सेल सब्सट्रेट इंटरफेस (75 माइक्रोन 2) necessi पर ध्यान केंद्रित किया हैTATES binning कदम है।
    2. इनपुट पर कब्जा कर लिया चरण विपरीत है और इस तरह MATLAB और प्रक्रिया बटलर एट अल के पहले से विकसित एल्गोरिदम का उपयोग के रूप में दूर लाल फ्लोरोसेंट छवियों (दोनों पूर्व हदबंदी और पोस्ट-हदबंदी) एक वैज्ञानिक प्रोग्रामिंग वातावरण में। और वांग एट अल। 40, 47।
      1. तीन क्षेत्रों सेल द्वीप से दूर का चयन करें। इन क्षेत्रों में छवि या नमूना बहाव के कारण विस्थापन के लिए खाते में करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
      2. कारक पिक्सल से कन्वर्ट करने के माइक्रोमीटर (जैसे, 0.454 पिक्सल / माइक्रोन) प्रदान करते हैं, सब्सट्रेट की यंग मापांक (जैसे, 13 किलो पास्कल), और पॉसों के अनुपात (जैसे, यहाँ वर्णित polyacrylamide जैल के लिए 0.48)।
      3. प्रत्येक द्वीप के लिए, परिधि ज्यामितीय बाधाओं को परिभाषित करने के लिए चारों ओर एक सीमा आकर्षित; इस सीमा के बाहर सभी बलों को चुना जाता है। यह विवश प्रणाली बड़े DISTA दी उचित हैnce (यानी, 450 माइक्रोन) द्वीपों के बीच।
    3. जड़ मतलब वर्ग कर्षण तनाव और प्रत्येक द्वीप के लिए सिकुड़ा पल की गणना। सिकुड़ा पल सेल द्वीप भर में अवशिष्ट तनाव का एक उपाय है और सेल सेल बातचीत 48 की ताकत प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाया गया है। प्रत्येक arrayed हालत के लिए, कई द्वीपों और जैविक प्रतिकृति और गणना से अधिक औसत जड़ मतलब वर्ग मूल्यों परिकल्पना परीक्षण के लिए विचरण जुड़े। यह भी कई द्वीपों पर तनाव या क्षणों के वितरण के औसत से द्वीप के केंद्र से ज्यामिति के एक समारोह में, उदाहरण के लिए, दूरी के रूप में दोनों उपायों के एक प्रतिनिधि नक्शा उपलब्ध कराने के लिए संभव है।

Representative Results

इस मंच का उपयोग करना, हम जिगर पूर्वज 34, 35 के भाग्य का विनिर्देश में दोनों जैव रासायनिक और biophysical संकेतों की भूमिका की जांच की। प्रोटीन ए / जी संयुग्मित पायदान ligands polyacrylamide हाइड्रोजेल (चित्रा 3 ए) में सुधार को बनाए रखने और क्लस्टरिंग दिखाया और एक पित्त नली सेल भाग्य (चित्रा 3 बी) की ओर जिगर progenitors के भेदभाव ड्राइविंग के अलावा सक्षम थे। एकल कोशिका विश्लेषण का उपयोग करना, हम ईसीएम प्रोटीन कोलेजन मैं, कोलेजन तृतीय, चतुर्थ कोलेजन, फ़ाइब्रोनेक्टिन, और laminin (चित्रा 3 सी) के लिए पायदान ligands के जवाब मात्रा निर्धारित, लग रहा है कि ligand के लिए जिगर पूर्वज की प्रतिक्रिया पर भी निर्भर करता है ईसीएम संदर्भ। पिछले है, हम shRNA पछाड़ना उपयोग किया ligands Dll1 और Jag1 बिना जिगर पूर्वज उत्पन्न करते हैं। arrayed पायदान ligand के जवाब जनसंपर्क के आधार पर विविधया तो ligand के esence, पुष्टि है कि सेल बाह्य ligand के लिए जवाबदेही भी सेल आंतरिक ligand अभिव्यक्ति (चित्रा 3 डी) के एक समारोह है। इसके अलावा, हम डबल पॉजिटिव की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या मनाया (ALB + / OPN +) Dll1 पछाड़ना (चित्रा 3 डी) में कोशिकाओं। साथ में, इन प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं: (1) सरणी प्रारूप के मिश्रित क्षमताओं, के रूप में कई arrayed ईसीएम प्रोटीन और अलग-अलग ligands के पछाड़ना साथ पायदान ligands के बाँधना द्वारा उदाहरण; (2) न केवल की कार्यक्षमता ईसीएम प्रोटीन पहिने लेकिन यह भी एक प्रोटीन / जी की मध्यस्थता विकार के माध्यम से सेल सेल ligand arrayed; और (3) हमारे एकल कोशिका विश्लेषण और अद्वितीय उप-जनसंख्या विचार करने के लिए अपनी क्षमता का कार्यान्वयन।

हम यह भी कहा कि जिगर progenitors के भेदभाव दोनों सब्सट्रेट कठोरता और ईसीएम रचना (चित्रा -4 ए पर निर्भर है ओंग>), विशेष रूप से उस कोलेजन चतुर्थ खोजने फ़ाइब्रोनेक्टिन केवल कड़ी substrates (चित्रा 4 बी) पर भेदभाव का समर्थन करता है, जबकि दोनों नरम और कठोर substrates पर भेदभाव का समर्थन है। TFM माप के प्रतिनिधि गर्मी नक्शे सुझाव कोलेजन चतुर्थ पर कम सब्सट्रेट कठोरता पर निरंतर कर्षण तनाव पित्त नली कोशिकाओं (चित्रा 4C), एक खोज औसत जड़ मतलब वर्ग मूल्यों (चित्रा 4D) से इसकी पुष्टि में पदोन्नत किया है कि भेदभाव। साथ में, इन प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं: (1) सफल ट्यून करने योग्य कठोरता के साथ substrates पर सेल प्रोटीन के साथ TFM के एकीकरण दोनों सेल phenotype और कर्षण तनाव का आकलन करने के लिए; (2) दोनों मैट्रिक्स संरचना और सब्सट्रेट कठोरता के साथ जिगर पूर्वज सेल भाग्य के समन्वय; और (3) सेल प्रोटीन में हमारे TFM विश्लेषण और ठेठ कर्षण तनाव प्रोफाइल के कार्यान्वयन।

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चित्रा 1: अवलोकन योजनाबद्ध पहले तीन प्रयोगात्मक धारा दिखा रहा है। धारा 1 में, ग्लास substrates साफ और polyacrylamide हाइड्रोजेल के निर्माण की सुविधा के लिए silanized रहे हैं। धारा 2 में, ब्याज की बायोमोलिक्यूल संयोजन एक 384 अच्छी तरह से स्रोत microplate में तैयार कर रहे हैं। एक रोबोट arrayer तो साफ पिन, स्रोत microplate, और polyacrylamide हाइड्रोजेल के साथ भरी हुई है और initialized, हाइड्रोजेल पर सरणियों fabricating है। धारा 3 में, कोशिकाओं arrayed डोमेन पर वरीयता प्राप्त और पालन करने के लिए, जिसके बाद ब्याज की संस्कृति प्रोटोकॉल किया जाता है की अनुमति है। समापन बिंदु पर, कोशिकाओं या तो immunocytochemistry / immunofluorescence के लिए निश्चित या TFM का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। स्केल सलाखों 75 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: प्रसंस्करण और सारणियों से इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा का विश्लेषण। (ए) टाइलों, समग्र 32-बिट आरजीबी छवियों पहले binned कर रहे हैं और उसके बाद अलग-अलग 8-बिट चैनलों में विभाजित है। arrayed फ्लोरोसेंट मार्करों और सेल द्वीपों का एक संयोजन का उपयोग करना, सरणी के तीन कोनों स्वचालित अभिविन्यास और सरणियों की gridding के लिए अनुमति देने के लिए पहचाने जाते हैं। (बी) एकल कोशिका डेटा इनपुट सरणियों के प्रत्येक चैनल के लिए उत्पन्न होता है। आदेश प्रयोगात्मक बहाव के लिए खाते में करने के लिए, quantile सामान्य बनाने जैविक को दोहराने से लागू किया जाता है, सभी प्रतिकृति भर में एक साझा वितरण का निर्माण किया। Quantile सामान्यीकृत डेटा बाद में साजिश रची और पहनावा माप की गणना के माध्यम से व्याख्या की है (जैसे, कोशिकाओं / द्वीप, मतलब तीव्रता, प्रतिशत कोशिकाओं को एक लेबल के लिए सकारात्मक) या एकल कोशिका वितरण के प्रत्यक्ष विश्लेषण है।M / फ़ाइलें / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पायदान Ligand प्रस्तुति मध्यस्थता लिवर पूर्वज भेदभाव। (ए) एफसी-पुनः संयोजक पायदान ligands दांतेदार-1 (JAG1) और डेल्टा-तरह 1 (DLL1) में सुधार को बनाए रखने और क्लस्टरिंग जब प्रोटीन ए / जी के साथ arrayed प्रदर्शन किया। स्केल बार 50 माइक्रोन है। (बी) लिवर पूर्वज पायदान ligand के साथ प्रस्तुति पर पित्त नली कोशिकाओं में भेदभाव किया। 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) एक परमाणु लेबल, एल्बुमिन (ALB) एक यकृत सेल मार्कर है, और osteopontin (OPN) एक पित्त नली सेल मार्कर है। स्केल बार 150 माइक्रोन है। (सी) ईसीएम प्रोटीन पर पायदान ligands JAG1, DLL1, और डेल्टा की तरह 4 (DLL4) के लिए OPN के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत की मात्रा मैं कोलेजन, गollagen तृतीय, चतुर्थ कोलेजन, फ़ाइब्रोनेक्टिन, और laminin। छात्र टी -tests प्रत्येक ईसीएम प्रोटीन के भीतर प्रत्येक arrayed पायदान ligand पी-मूल्यों के साथ पी <0.05 (*) के लिए संकेत के लिए नियंत्रण आईजीजी के खिलाफ प्रदर्शन किया गया। (डी) इमेजिंग पायदान ligands JAG1, DLL1, और DLL4 के साथ प्रस्तुत कोलेजन III पर कोशिकाओं के लिए ALB और OPN की cytometry। पायदान बिना लिवर पूर्वज ligands Dll1 और Jag1 (यानी, shDll1 और shJag1) shRNA पछाड़ना का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। (सी) में डेटा प्रस्तुत के रूप में मतलब ± SEM यह आंकड़ा Kaylan एट अल से संशोधित किया गया है। 34। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मैट्रिक्स संरचना और सब्सट्रेट कठोरता सीओओलिवर पूर्वज भेदभाव rdinate। (ए) वाहिनी कोशिकाओं पित्त जिगर पूर्वज भेदभाव दोनों ईसीएम रचना और सब्सट्रेट कठोरता पर निर्भर है। DAPI, एक परमाणु लेबल है ALB एक यकृत सेल मार्कर है, और OPN एक पित्त नली सेल मार्कर है। (बी) के यंग मापांक के substrates 30 किलो पास्कल, 13 किलो पास्कल, और कोलेजन के लिए 4 किलो पास्कल मैं (C1) की, कोलेजन चतुर्थ (सी 4), फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन), और सभी दो तरह संयोजनों पर OPN के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत की मात्रा उन ईसीएम प्रोटीन। (सी) सेल कर्षण तनाव दोनों सब्सट्रेट कठोरता और ईसीएम संरचना पर निर्भर है। (डी) यंग मापांक के substrates 30 किलो पास्कल और कोलेजन के लिए 4 किलो पास्कल मैं (C1), कोलेजन चतुर्थ (सी 4), फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन), और उन सभी को दो तरह से संयोजनों पर कर्षण तनाव की जड़ मतलब वर्ग मूल्यों की मात्रा ईसीएम प्रोटीन। (बी) और (घ) में, डेटा ± SEM और छात्र टी -tests मतलब के रूप में प्रस्तुत किए गएपी <0.05 (*), पी <0.01 (**) के लिए संकेत पी-मूल्यों के साथ प्रत्येक ईसीएम संयोजन के लिए 30 किलो पास्कल के खिलाफ प्रदर्शन किया गया है, और पी <0.001 (***)। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा Kourouklis एट अल से संशोधित किया गया है। 35। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुभाग मुसीबत संभावित कारण उपाय
1. Polyacrylamide सब्सट्रेट का निर्माण। Coverglass हाइड्रोजेल से हटाया नहीं जा सकता। Overpolymerization। <10 मिनट (4 डब्ल्यू / 2 मीटर) के लिए polymerization के समय को कम करें। कि यूवी crossli चेकnker उत्पादन की उम्मीद सीमा के भीतर है।
गरीब polyacrylamide हाइड्रोजेल polymerization। Underpolymerization। Polymerization समय> 10 मिनट (4 डब्ल्यू / एम 2) को बढ़ाएँ। जाँच करें कि यूवी crosslinker उत्पादन की उम्मीद सीमा के भीतर है।
Polyacrylamide हाइड्रोजेल coverglass को हटाने के बाद क्षतिग्रस्त हो रहे हैं। शीतल polyacrylamide हाइड्रोजेल नुकसान करने के लिए आसान कर रहे हैं। हम नर्म (यानी, 4 किलो पास्कल) विशेष रूप से हाइड्रोजेल लिए हाइड्रोजेल निर्माण उपज (~ 50%) कम हो रही निरीक्षण करते हैं। धीरे हाइड्रोजेल संभाल और शुरुआती संख्या बढ़ाने वांछित उपज प्राप्त करने के लिए।
2. सारणियों का निर्माण। गरीब या असंगत मौके आकृति विज्ञान। असंगत humidifier समारोह। कि humidifier चेक करें और प्रत्येक प्रिंट चलाने भर में एक कार्यात्मक rheometer और बनाए रखने के लिए 65% आरएच।
printhead या रोकना में फंस पिंसGED। printhead साफ मुक्त पिन आंदोलन के लिए अनुमति देने के लिए। अच्छी तरह से पहले या प्रत्येक प्रिंट चलाने के बाद साफ पिन पिन चैनलों से समुच्चय हटा दें।
3. सेल संस्कृति और परख निष्पादन। सेल टुकड़ी या प्रारंभिक लगाव के बाद सरणियों पर मौत। Overseeding और अत्यधिक प्रसार। प्रारंभिक बोने घनत्व और समय कम। सरणी संस्कृति के दौरान "रखरखाव" या "भेदभाव" मीडिया का उपयोग सेल प्रसार को कम।
हाइड्रोजेल से विषाक्त एक्रिलामाइड मोनोमर जारी करना। के लिए कम से कम 3 डी DH 2 हे में हाइड्रोजेल सोख एक्रिलामाइड मोनोमर के प्रसार / रिहाई के लिए अनुमति देते हैं और सेल विषाक्तता को कम करने के लिए।
प्रकोष्ठों सरणियों को देते नहीं है। Underseeding। प्रारंभिक बोने घनत्व और समय बढ़ाएँ। एक और अधिक मजबूती से पक्षपाती सेल प्रकार का प्रयोग करें।
के गरीब बयानमैट्रिक्स या बायोमोलिक्यूल हालत। कणों और समुच्चय के स्वच्छ पिन, मुद्रण मानकों को इस बात की पुष्टि, और फ्लोरोसेंट मार्करों, जैसे, rhodamine संयुग्मित dextran के खोलना मूल्यांकन।
सेल मैट्रिक्स बातचीत की विशिष्टता। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कुछ नहीं बल्कि अन्य ईसीएम प्रोटीन के लिए विशेष रूप से पालन करें। अपनी कोशिकाओं के साथ कई अलग अलग ईसीएम प्रोटीन का परीक्षण करें।
निर्माण के बाद से इनकी सरणी भंडारण। हम ठंड के दौरान चरण परिवर्तन से बचने के लिए 65% आरएच और कमरे के तापमान पर रात भर गढ़े सरणियों के भंडारण की सिफारिश, हिस्से में। कोशिका आसंजन दोनों नमी, तापमान, और भंडारण के समय के प्रति संवेदनशील है; सुनिश्चित करें कि इन मानकों के अनुरूप हैं / अपने प्रयोगों के लिए अनुकूलित कर सकते हैं।
सेल संस्कृति के दौरान कांच सब्सट्रेट से हाइड्रोजेल की टुकड़ी। गरीब स्लाइड सफाई और silanization। स्लाइड सफाई के लिए काम कर समाधान बदलें औरsilanization।
Overdehydrated हाइड्रोजेल। अब की तुलना में 15-30 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर dehydrating हाइड्रोजेल मत छोड़ो।
4. डेटा का विश्लेषण। दोहराने के धब्बे और स्लाइड्स के बीच उच्च परिवर्तनशीलता। सरणी निर्माण में परिवर्तनशीलता। जाँच करें कि पिन और printhead साफ कर रहे हैं। humidifier समारोह की पुष्टि करें। कल्पना और फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर हाजिर और सरणी गुणवत्ता यों। के रूप में स्टोर सरणियों ऊपर की सिफारिश की।

तालिका 1: समस्या निवारण।

Discussion

हमारे प्रयोगों में, हमने पाया है कि सबसे आम विफलताओं गढ़े सरणियों की गुणवत्ता से संबंधित हैं और खराब ब्याज की जैविक प्रणाली में प्रतिक्रिया होती है। हम सेल माइक्रोएरे प्रयोगों में आम विफलता मोड और जुड़े समस्या निवारण चरणों के लिए 1 टेबल के लिए पाठक को देखें। विशेष रूप से सरणियों की गुणवत्ता के बारे में, हम निम्नलिखित सलाह देते हैं। तकनीकी गुणवत्ता और प्रोटीन कार्यक्रमों, मानकों, और जैसे rhodamine संयुग्मित dextran के रूप में fluorescently लेबल अणुओं का उपयोग कर buffers की मजबूती की पुष्टि करें। या तो पहले या निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन और आगे नेत्रहीन के बाद अच्छी तरह से साफ पिन जाँच करें कि पिन चैनलों एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग मलबे के स्पष्ट हैं। सामान्य प्रोटीन दाग या immunolabeling का उपयोग कर arrayed बायोमोलिक्यूल प्रतिधारण की पुष्टि करें। ध्यान दें कि 70 केडीए के नीचे एक आणविक वजन के साथ biomolecules अक्सर हाइड्रोजेल 23 में बनाए रखा नहीं कर रहे हैं, sup> 31। अनेक प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग कर arrayed बायोमोलिक्यूल सेल कार्यक्षमता मान्य। ध्यान दें कि केवल पक्षपाती कोशिकाओं सरणियों के साथ संगत कर रहे हैं; इसके अतिरिक्त, सरणियों के लिए आसंजन दोनों सेल विशिष्ट गुण (जैसे, इंटीग्रिन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल) और चयनित ईसीएम प्रोटीन पर निर्भर है।

सीमित स्थान के कारण, हम यहाँ सरणी डिजाइन, लेआउट, और निर्माण की एक व्यापक उपचार प्रदान की है और पाठक का उल्लेख पिछले कार्यों के लिए 23, 25 नहीं किया है। हम आम तौर पर 100 मौके subarrays (150 माइक्रोन मौके व्यास, 450 माइक्रोन केंद्र के लिए केंद्र की दूरी) 10-20 अद्वितीय बायोमोलिक्यूल की स्थिति (यानी, 5-10 स्पॉट / हालत) की रचना का उपयोग करें। एक सरणी में subarrays की संख्या ब्याज की बायोमोलिक्यूल की स्थिति की संख्या है, जो आराम से एक 25 × 75 मिमी खुर्दबीन स्लाइड पर 1,280 करने के लिए बढ़ाया जा सकता है पर निर्भर करता है (~ 64 subarrays में 6,400 स्पॉट)xref "> 25, 31 मापदंडों के ऊपर आगे ब्याज के पैटर्न आकार के आधार पर अलग अलग होंगे;। 75 से पैटर्न पैदा करने में सक्षम पिन - 450 माइक्रोन आसानी से उपलब्ध हैं।

ऐरे प्रयोगों सबसे अच्छा उच्च स्कोरिंग arrayed ब्याज की जैविक मॉडल प्रणाली अन्य संस्कृति स्वरूपों का उपयोग करने की स्थिति, परख readouts, और के सत्यापन से पूरित कर रहे हैं। विशेष रूप से, हम आगे मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक (जैसे, QRT- पीसीआर, immunoblotting) या मानक TFM के साथ संयोजन के रूप में थोक संस्कृतियों का उपयोग चुनिंदा arrayed की स्थिति के प्रभाव को मान्य सलाह देते हैं। आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक उपयुक्त मॉडल जैविक प्रणाली को भी सरणियों में मनाया प्रभाव पुष्टि करने के लिए सेवा कर सकते हैं में रुचि का कारक की (जैसे, पछाड़ना या overexpression)। विवो में पशु मॉडल सत्यापन का एक और साधन प्रतिनिधित्व करते हैं और हाल ही में, उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जाता था, में galectin -3 और galectin-8 की केंद्रीय भूमिका की पुष्टि के लिएफेफड़ों के कैंसर मेटास्टेटिक आला, के रूप में शुरू में सेल माइक्रोएरे 31, 49 के माध्यम से पहचान की।

अन्य तरीकों की एक संख्या में सेलुलर कार्यों की microenvironmental विनियमन, दो आयामी microfabricated सिस्टम 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 और तीन आयामी इंजीनियर biomaterial प्रणालियों 56 की एक किस्म, 57, 58 सहित जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है , 59, 60, 61। अन्य तरीकों के साथ तुलना में, सेल माइक्रोएरे मंच की विशेष लाभ यहाँ वर्णित से मिलकर बनता है: (1) के लिए throughputसैकड़ों या कारकों के विभिन्न संयोजनों, बातचीत के प्रभाव के विश्लेषण के लिए सक्षम करने के हजारों; (2) सुलभ, स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण; (3) arrayed कारकों में से नियंत्रित प्रस्तुति के साथ दोनों जैव रासायनिक और biophysical readouts के एकीकरण; (4) सब्सट्रेट सामग्री गुण भिन्न करने की क्षमता; और (5) उच्च सामग्री एकल कोशिका सेल भाग्य और समारोह का विश्लेषण।

सारांश में, ट्यून करने योग्य सब्सट्रेट कठोरता के substrates पर TFM के साथ सेल प्रोटीन का संयोजन दोनों जैव रासायनिक और biophysical संकेतों की पूरी तरह से लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है। यहाँ के रूप में प्रस्तुत किया है, इस मंच generalizable है और आसानी से सेल भेदभाव और mechanotransduction की मिश्रित microenvironmental नियमन का एक बेहतर समझ की दिशा में पक्षपाती सेल प्रकार के ऊतक और संदर्भों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

हम स्वीकार करते हैं ऑस्टिन Cyphersmith और Mayandi Sivaguru (जीनोमिक जीवविज्ञान के लिए कार्ल आर Woese संस्थान, इलिनोइस विश्वविद्यालय Champaign-Urbana) माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए और उदारता माइक्रोस्कोपी मूल में स्क्रीन और वीडियो पर कब्जा मिलनसार के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

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