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Bioengineering

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

doi: 10.3791/55362 Published: March 1, 2017

Summary

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。

Abstract

弾性ヒドロゲル表面上の生体分子の接触印刷の組み合わせから成る微細加工細胞マイクロアレイは、細胞分化に配列された生化学的シグナルの影響を測定するために厳密に制御され、高スループット操作システムを提供します。細胞マイクロアレイを用いた最近の努力は、多くの微小環境因子が並列に提示されるコンビナトリアル研究のためのそれらの有用性を実証しました。しかし、これらの努力は、主に細胞応答に対する生化学的手がかりの効果を調査に焦点を当てています。ここでは、牽引力顕微鏡により免疫蛍光および生体力学的細胞 - 基質相互作用の両方によって、細胞分化を評価するための調節可能な材料特性を有する細胞のマイクロアレイプラットフォームを提示します。そうするために、我々は、いずれかの顕微鏡スライドまたはガラス底ペトリ皿上に作製ヤング率を変化させるのポリアクリルアミドハイドロゲルを用いた二つの異なるフォーマットを開発しました。我々は、BESを提供しますこれらのヒドロゲル基板上のマイクロアレイの製造、マイクロアレイ上の後、細胞培養物、およびデータの取得のためのトンのプラクティスとトラブルシューティング。このプラットフォームは、手がかりの役割が交差する、重要な果たし得るための生化学的( 例えば 、細胞外マトリックス組成物)および生物物理学的両方の生物学的プロセスの研究に使用するために適している( 例えば 、基板の剛性)。

Introduction

細胞および周囲の微小環境因子間の相互作用は、開発、恒常性、および疾患の病因1、2、3、4を通して生物学的プロセスの多種多様を媒介します。これらの微小環境との相互作用は、リガンド - 受容体結合を介して、細胞に細胞 - マトリックス結合、および細胞 - 細胞相互作用の可溶性因子の送達を含みます。上記生化学的考察に加えて、基板の機械的特性などの生物物理学的パラメータは、( 例えば 、ヤング率、気孔率)と細胞の形状、及び関連する下流のメカノは、ますます細胞分化5、6、7、8の重要なメディエーターとして認識を得ています9 10。これらの微小環境の相互作用から生じるシグナルは、遺伝子ネットワークとシグナル伝達経路への入力として機能します。また、これらの細胞固有のコンポーネントは、細胞固有の遺伝的プログラムとの間の複合体の共調節ループを完了し、分泌因子およびマトリックス分解酵素を介して微小環境にフィードバックを提供し、細胞外因性微小環境は5、11、12因子

微小環境因子の制御された提示のための操作システムの使用は、異なるコンテキスト13、14、15の範囲内で有用であることが証明されています。特に微細加工システムは小型化13を介してタンパク質や細胞ならびに高度に並列化された分析の正確な空間的パターン形成を容易にしました16、17、18、19、20、21、22。細胞マイクロアレイは、生体分子の組み合わせが接触印刷弾性ポリアクリルアミドヒドロゲル基板23、24、25にしたもので、このような微細加工システムを表します。細胞接着性の成分(すなわちマトリックスタンパク質)を含むことはしばしば免疫細胞化学および蛍光レポーターを経て下流の分析が続いているマイクロアレイ、上の持続的な細胞接着や文化を可能にします。細胞マイクロアレイを生産肝細胞表現型23、26、神経前駆体の分化27、mammarの改善された理解を得るに向けられていますY前駆細胞の運命の決定28、胚性幹細胞の維持/分化23、29、30、肺癌転移31、及びメラノーマ32で治療反応。我々は最近、内胚葉仕様33、肝前駆細胞の分化34、35、及び肺腫瘍細胞の薬物応答36における細胞外マトリックス(ECM)タンパク質組成物の役割を定義するための細胞マイクロアレイの使用を実証しました。これらの作品では、我々は、アレイプラットフォームの組み合わせの機能を拡張し、細胞外マトリックス組成物および生体力学と細胞固有のシグナル伝達の交差点を探索に焦点を当てています。加えて、我々は定量的にCHARACする能力を提供するために、この配列のプラットフォームでは生物物理学的読み出しを実装しています分化における細胞収縮性のterize役割は、35を処理ます。そうするために、我々は、細胞生成トラクションの高スループットの評価を可能にするために、細胞マイクロアレイと牽引力顕微鏡(TFM)を統合しました。 TFMは、細胞が生成した牽引力を測定するために広く利用方法であり、組成物および局所微小環境37、38、39、40のバイオメカニクスを備えた単一細胞および組織レベルの機能の調整に関する重要な洞察を提供しています。したがって、細胞マイクロアレイとTFMを組み合わせてキー、生理学的に関連する生物物理学的パラメータを測定するためのハイスループットシステムを提供します。

ポリアクリルアミド基板の製作、アレイの製造、細胞培養およびアッセイの読み出し、およびデータの分析:ここで説明した細胞マイクロアレイプラットフォームは、4つのセクションで構成されています。見る最初の3つの実験のセクションの概略概要については、図1。免疫蛍光データの分析に焦点を当てた最後のセクションの概略概要については、 図2を参照てください。生体力学的な細胞-基質相互作用の研究に細胞マイクロアレイプラットフォームを適合させるために、我々は、ウェンごとに、調整可能なヤング率が、同様の多孔性のポリアクリルアミド基材を使用しました 41。その基板上の細胞によって及ぼされる力のTFMの測定を可能にするため、私たちはしばしば、他のグループにより利用用スライド厚いガラス顕微鏡に加えて、ガラスボトムシャーレフォーマットを実装しました。従って、この細胞マイクロアレイプラットフォームは、別個のガラスボトムディッシュにTFMを介して顕微鏡スライドおよび細胞発生力の免疫蛍光を介した細胞分化の並列測定が可能です。我々はまた、一般的に、細胞マイクロアレイで使用される分析手法にいくつかの改良を適用しています。 SpecificalLY、代わりに全体的な島強度のパラメトリックZスコアの、我々は、単一セルの強度を測定し、非正規分布を考慮し、より正確な細胞挙動を説明するために、分位正規化を適用します。私たちは、これらの改善は、生化学的および生物物理学的両方の手がかりが重要で、交差する役割を果たしている生物学的プロセスの研究に向けて、特定のユーティリティを提供すると信じています。さらに、我々の分析の改善は、単一細胞および集団レベルの動作が発散するために細胞機能の範囲の研究と細胞マイクロアレイの適用を可能にします。

Protocol

ポリアクリルアミド基質の1製作

  1. きれいなガラス基板 - 細胞培養の際に最適なポリアクリルアミドハイドロゲルの製造と整合性を確保するために - エンドポイント免疫蛍光またはグラスボトムTFMのための35ミリメートルペトリ皿のための標準的な顕微鏡スライドのいずれか。あるいは、使用は、ガラス基板を予備洗浄します。
    1. 蒸留水(のdH 2 O)にトリトンX-100V / 0.25%Vでガラス基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。
    2. トリトンX-100溶液を除去し、30分間、オービタルシェーカー上で最後のすすぎと場所に浸漬のdH 2 O脱退基板と基板を5回すすいでください。
    3. dH 2 Oを削除し、アセトン中に基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。
    4. アセトンを除去し、メタノールに基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。
    5. メタノールを除去およびDHで基板を5回すすぎ<1時間オービタルシェーカー上でサブ> 2 O浸し0.05 N NaOH中で基質と場所。
      注意:NaOHを高度に苛性であり、重篤な皮膚の薬傷・眼の損傷を引き起こす可能性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。
    6. NaOH溶液を外し、のdH 2 Oを使用して基板を5回すすぎ、基板を乾燥し、乾燥するまでホットプレート上で110℃で焼成することが圧縮空気をろ過(5から15分)。洗浄された基板は、無期限に室温で保存することができます。
  2. ポリアクリルアミドヒドロゲルの付着を確実にするために、きれいなガラス基板Silanize。
    1. エタノール中の新たに調製した2%v / vの3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(3-TPM)で清浄なガラス基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。
      注意:3-TPMは、可燃性液体です。熱、火花、裸火、および高温のものから遠ざけると化学ドラフト内でのみ使用します。
    2. 3-TPMソリューションを削除し、ETHA内の基板を浸しますNOL。 5分間オービタルシェーカー上の基板を置きます。
    3. ( - 15分5)基板を乾燥し、乾燥するまでホットプレート上で110℃で焼くために濾過圧縮空気を使用してください。シラン処理基材は、最大1ヶ月間室温で保存することができます。
  3. オプション1:エンドポイントの免疫蛍光のためのシラン化顕微鏡スライド上にポリアクリルアミドハイドロゲルを作製。
    1. 所望のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの割合で dH 2 O中でプレポリマー溶液を調製し(w / v)の4キロパスカル(4%アクリルアミド、0.4%ビスアクリルアミド)のヤング率を有する基板を製造する比率、13キロパスカル(6%アクリルアミド、0.45温家宝首相あたり%ビスアクリルアミド)、または30キロパスカル(8%アクリルアミド、0.55%ビスアクリルアミド)と同様の気孔率、。 41。 0.2μmのシリンジと渦透明になるまで溶液およびフィルター。プレポリマー溶液は、3ヶ月間4℃で保存することができます。
      注意:アクリルアミドまたはビスアクリルアミドへの暴露はneurot、急性毒性をもたらすことができますoxicity、および刺激。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。
    2. メタノール中で重量/体積のIrgacure 2959年20%の光開始剤溶液を調製します。この光開始剤溶液は、保存することができず、新鮮なたびを準備する必要があります。
    3. 1(プレポリマー:光開始剤)比9にプレポリマー及び光開始剤溶液を混合。必要に応じて、気泡を除去するために15分間真空室で脱気。
    4. 1プレポリマー:9のガラス乾燥トレイとピペット100μLにシラン化スライドを置き、各スライドの上に光開始剤水溶液。泡の生成を回避しながら、ゆっくりと22×60ミリメートルのカバーガラスと各スライドをカバーしています。カバーガラスは、酸素による重合反応の阻害を防止することに注意してください。
    5. UV架橋剤に入れ乾燥トレイと10分(4 W / m 2)で365 nmのUV Aにスライドを公開します。必要に応じて重合時間を最適化します。長いエクスポージャーのリスク困難overpolymerizationによるカバースリップを取り除きます。短い暴露rをISKのunderpolymerizationと低ヒドロゲルの安定性。
    6. 5分間のdH 2 Oにヒドロゲルを浸します。重合ヒドロゲルを損傷しないように注意しながら、かみそりでカバースリップを削除します。
    7. dH 2 O毎日を変え、3日間- 1のための室温で dH 2 Oにヒドロゲルを残します。最大3ヶ月間 - (30分15)と、室温で保存し、乾燥するまでホットプレート上で50℃でハイドロゲルを脱水。
  4. オプション2:TFMを使用して、細胞 - 基質相互作用のライブ評価のためのシラン化35mmのガラスボトムペトリ皿上の蛍光ビーズを含むポリアクリルアミドハイドロゲルを作製。
    1. 凝集体を分散させるために15分間1μmの蛍光ビーズのストック溶液を超音波処理します。
    2. (w / v)の比が4キロパスカル(4%アクリルアミド、0.4%ビスアクリルアミド)のヤング率を有する基板を製造するために、所望のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの割合で dH 2 O中でプレポリマー溶液を調製し13キロパスカル(6%アクリルアミド、0温家宝首相あたり0.45パーセントビスアクリルアミド)、または30キロパスカル(8%アクリルアミド、0.55%ビスアクリルアミド)と同様の気孔率、。 41。 0.2μmのシリンジと渦透明になるまで溶液およびフィルター。プレポリマー溶液は、3ヶ月間4℃で保存することができます。
      注意:アクリルアミドまたはビスアクリルアミドへの曝露は、急性毒性、神経毒性、および刺激をもたらすことができます。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。
    3. 混合するために0.2%v / vの渦の最終濃度でプレポリマー溶液に蛍光ビーズを加えます。
    4. メタノール中で重量/体積のIrgacure 2959年20%の光開始剤溶液を調製します。この光開始剤溶液は、保存することができず、新鮮なたびを準備する必要があります。
    5. 1(プレポリマー/ビーズ::光開始剤)比9におけるプレポリマー/ビーズおよび光開始剤溶液を混合。必要に応じて、気泡を除去するために15分間真空室で脱気。
    6. ガラス乾燥トレイとpにシラン化35mmのガラスボトムペトリ皿を置きます1プレポリマー/ビーズ:9のIPET 20μL、各皿の中央への光開始剤水溶液。泡の生成を回避しながら、ゆっくりと12ミリメートルの円形カバーガラスで各スライドをカバーしています。カバーガラスは、酸素による重合反応の阻害を防止することに注意してください。
    7. ノール当たり、ヒドロゲルの表面に蛍光ビーズを分配皿を反転し、20分間室温で残すために 42。
    8. まだ反転しながら、10分(4 W / m 2)で365 nmのUV Aに料理を公開します。必要に応じて重合時間を最適化します。長いエクスポージャーのリスク困難overpolymerizationによるカバースリップを取り除きます。短いエクスポージャーのリスクunderpolymerizationと低ヒドロゲルの安定性。
    9. バッファと、暗い一晩中、室温で残す0.1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)でヒドロゲルを浸します。 polymeを損傷しないように注意しながら、カミソリで慎重にカバースリップを削除しますrizedヒドロゲル。
    10. ( - 30分15)乾燥するまでホットプレート上で50℃でハイドロゲルを脱水。ヒドロゲルは、3ヶ月間、暗所で室温で保存することができます。

配列の2製作

  1. 生体分子を印刷するためにバッファを準備します。関心の生体分子への適切な印字バッファを使用してください。成長因子(GF)印刷バッファは、細胞 - 細胞リガンドのような分子の他のクラスのために広く適しています。
    1. 2×ECMタンパク質印刷バッファを準備するために、6ミリリットルのdH 2 Oボルテックスに酢酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の37.2 mgの164ミリグラムを追加し、完全に可溶化するために37℃でインキュベートします。可溶化の後、予熱したトリトンX-100およびグリセロールの4ミリリットルの50μLを追加します。ボルテックスとは、可溶化するために、再び37℃でインキュベートします。 4.8にpHを調整するために滴定、氷酢酸80μL - 40を追加します。 2×ECMタンパク質印刷バッファ4に格納することができます1ヶ月間Cを°。
      注意:酢酸は可燃性、腐食性を示します。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。
    2. 2×GF印刷バッファを準備するために、6 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に105.5 mgの酢酸ナトリウム、および37.2ミリグラムのEDTAを加えます。ボルテックスとは完全に可溶化するために37℃でインキュベートします。可溶化の後、100 mgの3を追加 - [(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ] -1-プロパン(CHAPS)とグリセロールの4 mLです。 2×GFタンパク質印刷バッファは、1ヶ月間、4℃で保存することができます。
  2. ソースプレートを準備します。
    1. 384ウェルV底マイクロプレートでは、二重標的濃度の各生体分子溶液で2回印字バッファの同等のボリュームを兼ね備えています。
      注:配列要素の他のタイプの標的濃度は、ヒドロゲルおよび生物学的機能の保持に依存して変化しながら、最も一般的なECMタンパク質のための適切な標的濃度は、250μgの/ mLです。各ウェルの総容積はすることができます5μL程度の低い以上15μLである必要はありません。関心対象の生体分子の組み合わせに加えて、下流の画像解析を容易にするために配列された蛍光マーカーを含みます。ローダミン結合デキストラン(2.5 mg / mlで)を使用します。
    2. 気泡を発生しないように注意しながら、ピペッティングにより完全に各ウェルを混ぜます。 100×gで1分間の供給源マイクロプレートを遠心します。ソースプレートと同じ日に調製し、マイクロアレイの製造まで4℃で保存を使用してマイクロアレイを製作。
  3. 各マイクロアレイの製造ランの前に、製造業者の指示に従ってクリーンピン。マイクロアレイのプリントヘッドに直接クリーンピンをロードします。
  4. メーカーのソフトウェアを使用してマイクロアレイヤーやプログラムを準備します。以下の手順は、ここで使用される特定のマイクロアレイに部分的に固有のものですが、ほとんどmicroarrayersの動作も同様です。
    1. 加湿ユニットの電源を入れ、65%RH(非にセットポイントを調整)-condensing、およびレオメーターがセットポイントと一致するまで待ちます。適切なアダプタでソースプレートを置きます。
    2. 15分間、50℃でハイドロゲル基材を脱水し、適切なアダプタに配置します。マイクロアレイは、顕微鏡スライドおよびマイクロプレートの両方のためのアダプタを持っています。 35ミリメートルのガラスボトムペトリ皿を並べるために、6ウェルマイクロプレートに料理をロードしてアレイヤー上のマイクロプレートアダプタにマイクロプレートを置きます。
    3. 正確にソースプレート、アレイ設計、及び所望のフォーマット(35ミリメートルペトリ皿を含む例えば 、顕微鏡スライドまたはマイクロプレート)のレイアウトを反映するために、プログラムのパラメータを調整します。キャリーオーバーと交差汚染を防止するために、各条件間の両方の水とジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して洗浄工程を含んで。
    4. 湿度が65%RH(結露しないこと)以下に低下していない一時間に一度以上とピンが詰まっていないことはそれほど頻繁にチェックしないと、アレイの製造を開始します。 HUMI場合dityは、加湿器を記入し、結露の関連チューブをクリアするために配列し、一時停止、予想外に低下しました。ピンが詰まっている場合は、ピンを清掃またはその他の予備洗浄ピンに置き換える並べ一時停止します。 ( すなわち 、4時間一晩に)十分な乾燥時間を提供し、同一基板上に生体分子を順次配列複数の種類にそれが可能であることに注意してください。
    5. プログラムが完了すると、室温でのアルミ箔と65%RH(結露しないこと)一晩で覆われたスライドボックスまたはマイクロプレートに製造された配列を配置します。一般的なタンパク質の汚れや免疫蛍光を使用してアレイの品質と保持を評価する必要があるかもしれないことに注意してください。 Brafman らを参照てください詳細は、25のため。

3.細胞培養およびアッセイ読み出し

  1. 製造の翌日、4チャンバーディッシュ(顕微鏡スライド)または6ウェルマイクロプレート(ペトリ皿)に配列された基板を配置し、1%浸しますPBSで(v / v)のペニシリン/ストレプトマイシン。料理のためのスライドの4 mLおよび3 mLのを使用しています。 30分間UV Cに公開します。交換ペニシリン/細胞培養培地のためのストレプトマイシン溶液。
  2. 収集した細胞を数えます。 2×10 6細胞/顕微鏡スライドあたり4 mLおよび35ミリメートルのペトリ皿当たり3 mLの配列- 500×10 3でのアレイ上にシード。 24時間またはよく人口の細胞の島が形成されるまで- 2のためのCO 2、37℃で、5%の配列培養をインキュベートします。あなたの細胞や特定のアプリケーションの必要に応じて播種密度と時間の両方を調整します。 Underseeding( すなわち 、低密度または播種時間)が悪いのアレイ人口とスキュー生物学的な結果をもたらす可能性があります。 ( すなわち 、高密度または播種時)Overseedingすることは、島の剥離に減少し、アレイの整合性をもたらすことができます。
  3. 細胞アイランドの形成を可能にした後、予め温めた細胞培養培地で二回アレイ培養物を洗浄します。再びスライドや料理のための3 mLを4 mLのを使用しています。 OptionaLLY生物系への関心の適切なコントロールや治療( 例えば 、小分子阻害剤、成長因子など )を追加します。いずれかの治療の濃度を維持するために、2日間 - アレイごとに1のメディアを変更します。配列培養を開始する5日 - - 1内のTFMによって免疫蛍光または細胞 - 基質相互作用によって細胞マーカー発現および細胞機能を評価オプション1および以下のオプション2を参照してください。
  4. オプション1:エンドポイント免疫蛍光を実行します。いくつかのタンパク質の免疫蛍光は、メタノール、エタノール、又はHClを使用して、より厳格な透過性を必要とするかもしれないことに注意してください。配列に対する潜在的な損傷に、より大規模な実験に使用する前に、各透過性プロトコルを評価し、最適化します。
    1. 吸引し、細胞培養培地4チャンバーディッシュ中のアレイスライドから、PBS中に新たに調製した4%(v / v)のパラホルムアルデヒド(PFA)の4ミリリットル/スライドを追加します。室温で15分間インキュベートします。
      注意:エクスポズPFAへのUREは急性毒性をもたらすことができるし、また、接触時に皮膚を刺激または腐食することができます。保護手袋、衣服、目の保護具を着用し、化学ドラフト内でのみ使用します。
    2. 吸引しPFA溶液およびPBSの4 mLで各スライドを3回洗浄します。この時点で、固定されたスライドを1週間4℃で保存することができます。これは、アレイの整合性を確保するために免疫標識し、固定と同じ日にマウントを介して継続する、しかし、賢明です。
    3. 吸引し、PBS、PBS中のトリトンX-100 V 0.25%V / 4mLの/スライドを追加します。室温で10分間インキュベートします。
    4. 吸引除去トリトンX-100溶液とPBSの4 mLで各スライドを3回洗浄します。 PBS中の二次抗体(ロバ二次抗体について、例えば 、ロバ血清)の種にマッチし、5%(v / v)の血清を4mL /スライドを追加し、室温で1時間インキュベートします。
    5. 徹底的に各スライドからのブロッキング溶液を除去します。 PBS中の5%(v / v)の血清中に希釈した一次抗体を500μL/スライドを追加します。。このボリュームは4℃の室温で両方1時間、インキュベーションのための配列だけでなく、一晩のインキュベーションをカバーするのに十分です。
    6. PBSの4 mLで各アレイスライドを3回洗浄します。徹底的に最終洗浄を除去し、PBS中の5%(v / v)の血清で希釈した適切な二次抗体を500μL/スライドを追加します。
    7. PBSの4 mLで各アレイスライドを3回洗浄します。慎重にピンセットを用いて、溶液からのアレイスライドを削除する前 dH 2 Oで簡単に洗います。吸い上げるために実験室の組織を使用するか、乾燥残留のdH 2 O
    8. 視覚的に配列全体の完全なカバレッジを確認しながら、スライド全体にDAPIでソリューションを実装するピペットで100μL。
    9. マウントするスライドの上に22×60ミリメートルのカバーガラスを配置します。明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。なし以前の翌日よりイメージングまで4℃、暗所で保管してください。
    10. マイクロアレイスキャナーや倒立蛍光顕微鏡equippのいずれかを使用して、画像全体の配列ロボットステージとエド。マイクロアレイスキャナは、より迅速な読み出しを提供するが、Cy3-またはCy5と互換性の蛍光団を必要とする場合があり、単一セルの順序で、多くの場合、限られた解像度の( すなわち 、1から10ミクロン)。蛍光顕微鏡は、蛍光チャネルの多様性を使用するためのオプションとより高い解像度(<1μmで、〜100×総合倍率)を提供するが、ロボットステージの品質及び倍率/目的に応じ遅い読み出しを提供します。
    11. 保存( 例えば 、JPG)他のファイル形式に関連付けられたデータ圧縮または損失を防止するために、TIFFファイルなどの方法のいずれかから配列全体のイメージを捕獲しました。
  5. オプション2:TFMを使用して、細胞 - 基質相互作用のライブ評価を行います。
    1. TFM中の基質から細胞を解離するためにPBS中の1%(v / v)のウシ血清アルブミン(BSA)の溶液および1%(v / v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を準備します。
    2. に配列培養を含む35ミリメートルペトリ皿を移動しますインキュベーション(37℃、5%CO 2)、TFM測定用ロボットステージと倒立蛍光顕微鏡。
      1. 一皿では、位置をマーク(X座標、Y座標)と、位相差顕微鏡を使用して、個々の細胞の島の面を(Z座標)注目します。
      2. ビーズを可視化するために遠赤色蛍光顕微鏡に切り替えます。前の手順で保存した各位置に戻り、セルの島下のビーズの第1層のみにフォーカスがあるように、焦点面のZ座標修正。新しい座標を保存して、前の解離相コントラストと遠赤色蛍光画像をキャプチャするために、すべてのセルの島の自動画像に進みます。
    3. 慎重に皿にBSA / SDS溶液150μLを追加し、基板からの完全な細胞解離を可能にするために5分を待ちます。位相差顕微鏡を用いて細胞分離を監視します。
    4. 細胞アイランドが基板から分離された後、tに戻ります彼はポジションをマークし、ビーズの第1の層が焦点に残っていることを確認してください。これらのビーズは、面外による細胞生成トラクションによる変形にある場合、それらは焦点に再びなるように、焦点面のZ座標を補正します。補正後のZ座標を保存し、後の解離遠赤色蛍光画像をキャプチャするためにすべての島の自動画像を繰り返します。
    5. 残りの料理のための3.5.4 - を繰り返して、3.5.1をステップ実行します。

データの4.解析

  1. 免疫蛍光データの分析。
    1. このプロセスは、アレイの画像を取得しました。 ( すなわち 、赤、青、または緑)は、個々のチャネルを含むファイルに複合アレイの画像を分割し、8ビットのTIFF画像43、44に変換します。 〜チャンネルあたり32メガピクセルはentiの下流の単一細胞分析中にメモリ要求量を減らすために画像サイズを縮小するビニング( 例えば 、2×2または4×4)を適用しますアレイ画像を再。これらの配列の処理ステップのImageJのマクロ実装は、「array_processing.ijm」というタイトルの補足コードファイルを参照してください。
    2. 左上、左下、右下のローダミン結合デキストランマーカーまたは配列された条件の各画素の座標に注意してください。特定の配列された条件で単一細胞分析からの出力に注釈を付けるために、後で、完全に垂直であるとする8ビットのTIFF画像を回転させるために、これらの座標を使用してください。回転と手順をグリッド化これらの配列の実装のための補足コードファイルと題した「rb_array_rotater.ijm "、" rg_array_rotater.ijm "、" rgb_array_rotater.ijm」、および「array_gridding.ijm」を参照してください。
    3. IdentifyPrimaryObjects、IdentifySecondaryObjects、およびMeasureObjectIntensity:ビン化の単一細胞分析を行い、以下のモジュールを使用してCellProfiler(バージョン2.1.1)45で8ビットのTIFF画像を回転させます。 IdentifyPrimaryObjectsはIdentifySecond、核を識別するaryObjectsは、それぞれの細胞核に関連したimmunolabelsを識別し、MeasureObjectIntensityは核ラベルとimmunolabelsの両方のための数量化を提供します。
      1. ExportToSpreadsheetモジュールを使用してチャネルによってCSVファイルとしてすべての3つのモジュールの出力の単一セルデータは、後で下流の分析を容易にします。赤、緑、または青のチャンネルを含む画像セットのためにこれらのステップを実施CellProfilerパイプラインのために補足コードファイルと題した「b_array_image_analysis.cppipe "、" gb_array_image_analysis.cppipe "、" rb_array_image_analysis.cppipe」、および「rgb_array_image_analysis.cppipe」を参照してください。
    4. 実験のばらつきや非ガウス単一細胞の分布を説明するためにデータを変換するために、生物学的複製46により分位正規化を適用します。このプロセスは、反復間で共有さ分布を生成し、免疫標識強度の変化の公平な比較を可能にします。また、UNLIKE Zスコアと他のパラメトリック法、クォンタイル規格化は、ノンパラメトリックであり、アレイ状の条件の関数としての単一細胞の挙動のより代表的な分析を可能にする、データの特定の分布を負いません。
    5. データをプロットし、解釈します。生物学的システムとの仮説に応じて、計算し、各アレイの条件については、次のアンサンブル対策の一つまたは複数をプロットします。
      1. 実験の過程にわたって密着性および生存の組み合わせ尺度として島ごとの細胞を計算し、プロット。
      2. 細胞の運命や機能の尺度としての変位値、正規化された免疫標識の強度を計算し、プロットします。
      3. 一貫性のある閾値以上の強度によって決定されるように通常2 SDネガティブコントロールの平均強度の上、免疫標識のための陽性細胞の割合を計算し、プロットします。
      4. 単一細胞の挙動を検討し、分類するために、免疫標識強度の代わりに、プロットの分布配列された状態の関数として。これらの分布は、中央傾向(平均値、中央値、モード)及び変動(分散、変動係数、ファノ因子)などコルモゴロフ - スミルノフ検定等の仮説検定法の測定を使用して特徴付けることができます。
  2. TFMデータの分析。ここバトラーらが以前に開発したアルゴリズムを組み込む方法を説明されていますそして、Wang ら。 40、47。
    1. バッチにはImageJを使用して、8ビットのTIFFファイルに画像を変換します。下流分析の計算コストと時間を削減するために、画素平均ビニング( 例えば 、2×2)を適用します。 TFMのためのアルゴリズムは、主に単一細胞分析、単セルのセル基板界面と比較して島(〜17.5×10 3μm2で)大細胞-基板界面(75ミクロン2)necessiに集中しているようtatesビニングステップ。
    2. バトラーの以前に開発したアルゴリズムを使用して、科学的なプログラミングMATLABなどの環境およびプロセスに入力される撮像位相コントラストと遠赤色蛍光画像(プリ解離とポスト解離の両方を)。そして、Wang ら。 40、47。
      1. セル島から離れた三つの領域を選択します。これらの領域は、画像または試料ドリフトに起因する変位を説明するために使用されます。
      2. マイクロメートル( 例えば 、0.454ピクセル/μm)とした画素から変換するための係数を提供し、基板のヤング率( 例えば 、13キロパスカル)、およびポアソン比( 例えば 、ここで説明するポリアクリルアミドゲル用0.48)。
      3. 各島について、幾何学的制約を定義するために周囲に境界線を引きます。この境界の外のすべての力がゼロにされています。この制約システムは、大規模なDISTA与えられた合理的ですNCE島の間( すなわち 、450ミクロン)。
    3. 各島のための二乗平均平方根トラクションストレスと収縮モーメントを計算します。収縮モーメントは、細胞島を横切る残留応力の尺度であり、細胞-細胞相互作用48の強度を反映することが示されています。各アレイの条件については、複数のアイランドでの平均二乗平均平方根値および生物学的複製と仮説検定のための関連する分散を計算します。 例えば 、幾何学の関数として両方の対策の代表的な地図を提供するために多くの島の上のストレスやモーメントの分布を平均化するために、島の中心からの距離が可能です。

Representative Results

このプラットフォームを使用して、我々は肝前駆細胞34、35の運命仕様の両方の生化学的および生物物理学的手がかりの役割を調べました。プロテインA / G-共役Notchリガンドは、ポリアクリルアミドハイドロゲル( 図3A)に改善された保持およびクラスタリングを示し、胆管細胞の運命( 図3B)に向けて、肝前駆細胞の分化を駆動する、さらに可能でした。単一細胞分析を使用して、我々は、リガンドの肝前駆細胞の応答は、にも依存することを見出し、ECMタンパク質コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブロネクチン、およびラミニン( 図3C)のためのNotchリガンドに対する応答を定量化ECMコンテキスト。最後に、我々はリガンドDLL1JAG1ずに肝前駆細胞を生成するためのshRNAノックダウンを利用しました。配列Notchリガンドへの応答は、PRに依存して変化しいずれかのリガンドのesenceは、細胞外因性リガンドに対する応答がセル固有のリガンドの発現( 図3D)の関数でもあることが確認されました。さらに、我々はDLL1ノックダウン中の二重陽性(ALB + / OPN +)細胞( 図3D)の別個の亜集団を観察しました。一緒に、これらの代表的な結果は:(1)個々のリガンドのノックダウンで複数配列されたECMタンパク質およびNotchリガンドのペアリングにより例示されるように配列形式の組合せ能力; (2)だけでなく、の機能は、ECMタンパク質の配列だけでなく、プロテインA / G媒介結合を介して細胞 - 細胞リガンド配列します。 (3)我々の単一細胞解析および固有の亜集団を識別する能力の実現。

我々はまた、肝臓の前駆細胞の分化は、基板の剛性とECM組成物( 図4Aの両方に依存することが観察されオング>)、特にフィブロネクチンだけ硬い基板( 図4B)の分化をサポートしながら、コラーゲンIVは両方のソフトと硬い基板上の分化を支持していることを発見。 TFM測定の代表的なヒートマップは、コラーゲンIV上の低い基板剛性での持続的な牽引応力が胆管細胞( 図4C)、平均二乗平均平方根値( 図4D)によって確認所見への分化を促進することを示唆しました。一緒に、これらの代表的な結果は:(1)調整可能な剛性を有する基板上の細胞マイクロアレイとTFM統合の成功は、細胞の表現型とトラクションストレスの両方を評価すること; (2)マトリックス組成物と基板の剛性の両方と肝前駆細胞の運命を調整します。 (3)当TFM分析および細胞マイクロアレイにおける典型的な牽引応力プロファイルの実装。

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図1:最初の3実験のセクションを表示概要回路図。第1に、ガラス基板を洗浄し、ポリアクリルアミドハイドロゲルの製造を容易にするために、シラン化されています。第2節では、関心対象の生体分子の組み合わせは、384ウェル源マイクロプレート中で調製されます。ロボットアレイヤーその後、ヒドロゲル上のアレイを製造する、きれいなピン、供給源マイクロプレート、およびポリアクリルアミドハイドロゲルでロードされ、初期化されます。第3節では、細胞は、関心の培養プロトコルが行われた後、配列されたドメイン上に播種し、付着させます。エンドポイントで、細胞は、いずれのTFMを用いて免疫細胞化学/免疫蛍光のために固定または分析されます。スケールバーは75μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ページ内= "1"> 図2
図2:処理と配列からの免疫蛍光データの解析。 (A)タイルは、複合材料の32ビットRGB画像はまずビニング及び個々 8ビットのチャネルに分割されます。配列された蛍光マーカーと細胞の島々の組み合わせを使用して、配列の3コーナーが自動化された向きと配列のグリッド化を可能にするために識別されます。 (B)単セルのデータが入力配列の各チャネルのために生成されます。実験的ドリフトを考慮するために、変位値正規化は、全ての反復にまたがる単一の共有分布を生成する、生物学的複製によって適用されます。分位正規化されたデータは、その後プロットと解釈アンサンブル測定の計算を介して( 例えば 、細胞/島、強度を意味し、ラベルの割合の細胞が陽性)または単一細胞分布の直接分析されます。メートル/ファイル/ ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:ノッチリガンドプレゼンテーションを媒介する肝臓前駆分化。プロテインA / Gで配列するとき(A)のFc-組換えNotchリガンドのJagged-1(JAG1)とデルタ様1(DLL1)を向上させる保持およびクラスタリングを示しました。スケールバーは50μmです。 (B)肝前駆細胞は、Notchリガンドとプレゼンテーションの際に胆管細胞に分化しました。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)は核標識である、アルブミン(ALB)は、肝細胞マーカーであり、オステオポンチン(OPN)は、胆管細胞マーカーです。スケールバーは150μmです。 (C)ECMタンパク質コラーゲン上のNotchリガンドJAG1、DLL1ためのOPNのための陽性細胞の割合の定量化、およびデルタ様4(DLL4)私は、Collagen III、コラーゲンIV、フィブロネクチン、およびラミニン。 スチューデントt -testsはP <0.05(*)に対して示さP値を有する各ECMタンパク質内の各アレイNotchリガンドのためのコントロールIgGに対して行いました。 (D)NotchリガンドJAG1、DLL1、およびDLL4を提示コラーゲンIII上の細胞のためのALBとOPNのイメージングサイトメトリー。ノッチなしの肝前駆細胞は、DLL1JAG1( すなわち 、shDll1とshJag1が)のshRNAノックダウンを使用して生成されたリガンド。この図は、Kaylan から変更されている平均値±SEMとして(C)内のデータが提示しました 34。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:マトリックス組成物と基板剛性クー肝前駆分化をrdinate。胆管細胞への(A)肝前駆細胞の分化は、ECM組成物及び基板の剛性の両方に依存します。 DAPIは核標識である、ALB、肝細胞マーカーであり、OPNは、胆管細胞マーカーです。 (B)のヤング率の基板30キロパスカル、13キロパスカル、コラーゲン4 kPaのI(C1)、コラーゲンIV(C4)、フィブロネクチン(FN)、およびすべての双方向の組み合わせでOPNについて陽性の細胞の割合の定量化これらのECMタンパク質。 (C)細胞牽引応力は、基板の剛性とECM組成の両方に依存します。 (D)ヤング率の基板30キロパスカルとコラーゲンのための4 kPaのI(C1)、コラーゲンIV(C4)、フィブロネクチン(FN)、およびそれらのすべての双方向の組み合わせに牽引ストレスの二乗平均平方根値の定量ECMタンパク質。 (B)及び(D)において、データは、SEM及びスチューデントt -tests±平均値として表しました30 Pのために示されたP値と各ECMの組み合わせのkPaの<0.05(*)、P <0.01(**)、およびP <0.001(***)に対して行いました。スケールバーは50μmです。この図は、Kourouklis から変更されています 35。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

セクション 問題 潜在的な原因 溶液
ポリアクリルアミド基板の1製作。 カバーガラスは、ヒドロゲルから削除することはできません。 Overpolymerization。 <10分(4 W / m 2)とに重合時間を短縮します。その紫外線crossliをチェックnker出力は、予想の範囲内です。
悪いポリアクリルアミドヒドロゲル重合。 Underpolymerization。 10分(4 W / m 2)と>に重合時間を増やします。 UVクロスリンカー出力が期待される範囲内であることを確認してください。
ポリアクリルアミドヒドロゲルは、カバーガラスを除去した後に破損しています。 柔らかいポリアクリルアミドヒドロゲルは損傷しやすいです。 私たちは、特に柔らかい( すなわち 、4キロパスカル)のヒドロゲルのためのハイドロゲルの製造収率(〜50%)の減少を観察します。優しくヒドロゲルを処理し、目的の収量を達成するための出発数を増やします。
配列の2製作。 悪いまたは一貫性のないスポット形態。 一貫性のない加湿機能。 その加湿器をチェックして、各プリントラン全体の機能をレオメーター、65%RHを維持します。
プリントヘッドまたは詰まりで立ち往生ピンGED。 無料のピンの動きを可能にするためにプリントヘッドを清掃してください。ピンチャネルから凝集物を除去するために徹底的に各プリントランの前または後にクリーンピン。
3.細胞培養およびアッセイの実行。 最初の取り付け後のアレイ上での細胞の剥離や死。 Overseedingおよび過剰増殖。 最初の播種密度と時間を削減します。細胞増殖を低減するために、アレイの培養中に「保守」または「分化」メディアを使用します。
ヒドロゲルからの有毒なアクリルアミドモノマーのリリース。 アクリルアミドモノマーの拡散/放出を可能にし、細胞毒性を低減するために、少なくとも3日間のdH 2 Oにヒドロゲルを浸します。
細胞は、アレイに接続しないでください。 Underseeding。 最初の播種密度と時間を増やします。より強力な接着性の細胞型を使用します。
の悪い堆積マトリックスまたは生体分子の状態。 粒子および凝集体のきれいなピンは、印刷パラメータを確認し、蛍光マーカー、 例えば 、ローダミン結合デキストランのスポッティングを評価します。
細胞 - マトリックス相互作用の特異性。 異なる細胞型は、いくつかのではなく、他のECMタンパク質に特異的に付着します。あなたの細胞に複数の異なるECMタンパク質をテストします。
製造後の次善のアレイストレージ。 我々は、凍結中に相変化を回避するために、部分的には、65%RH、室温で一晩作製アレイを記憶するお勧めします。細胞接着は、湿度、温度、および貯蔵時間の両方に敏感です。これらのパラメータは、あなたの実験のために最適化された/一致していることを確認してください。
細胞培養中のガラス基板からのヒドロゲルの剥離。 スライドクリーニングとシラン化が悪いです。 スライドの洗浄のために働いてソリューションを交換して、シラン化。
Overdehydratedヒドロゲル。 15〜30分間よりも長い間、ホットプレート上で脱水ヒドロゲルを放置しないでください。
データの4.分析。 複製スポットとスライド間の高い変動。 アレイ製造の変動。 ピンとプリントヘッドが汚れていないことを確認してください。加湿器の機能を確認してください。視覚化し、蛍光マーカーを使用してスポットと配列品質を定量化します。上記の推奨のように配列を格納。

表1:トラブルシューティング。

Discussion

我々の実験では、我々は、最も一般的な障害が作製アレイの品質に関連し、不十分な目的の生物学的システムにおける応答を特徴としていることを発見しました。我々は、細胞マイクロアレイ実験における共通の故障モードと関連するトラブルシューティングの手順については、 表1にリーダーを参照してください。特定の配列の品質に関しては、我々は次のことをお勧めします。そのようなローダミン結合デキストランなどの蛍光標識分子を使用して配列するプログラム、パラメータ、およびバッファの技術的品質と堅牢性を確認してください。前またはさらに視覚的に製造業者の指示に従って並べ及び後のいずれかに徹底的にきれいなピンは、ピンチャネルは、光学顕微鏡を用いて、デブリの明確であることを確認してください。一般的なタンパク質の汚れや免疫標識を使用して配列された生体分子の保持を確認してください。 70kDaの以下の分子量を有する生体分子が頻繁にヒドロゲル23に保持されていないことに注意してください SUP> 31。複数の細胞型を使用して配列された生体分子の細胞機能を検証します。唯一の接着細胞をアレイと互換性があることに注意してください。さらに、アレイへの接着は、細胞特異的な特性( 例えば 、インテグリン発現プロファイル)と選択されたECMタンパク質の両方に依存しています。

スペースに限りがあるため、ここではアレイ設計、レイアウト、および製造の大規模な治療を提供していないと、以前の作品23、25を読者に参照してください。私たちは、一般的に10から20のユニークな生体分子の条件( すなわち 、5月10日のスポット/条件)からなる100スポットサブアレイ(150μmのスポット径、450μmの中心間距離)を使用します。 1アレイ内のサブアレイの数が快適に1 25×75mmの顕微鏡スライド上に1280にスケールアップすることができ、目的の生体分子条件の数に応じて変化する(〜64サブアレイで6400スポット)上記外部参照"> 25、31のパラメータは、さらに関心のパターンサイズによって異なります。75からパターンを生成することが可能なピン- 450μmのは、容易に入手可能です。

アレイ実験は、最高の他の培養フォーマット、アッセイの読み出し、および生物学的モデル系を使用して、関心の高スコア配列条件の検証によって補完されます。具体的には、我々はさらに、標準的な分子生物学的技術( 例えば 、定量RT-PCR、免疫ブロット法)、または標準のTFMと一緒にバルク培養を用いて、選択配列された条件の影響を検証することをお勧めします。適切な生物学的モデル系における関心の因子の遺伝子操作( 例えば 、ノックダウンまたは過剰発現)は、アレイ内の観察された効果を確認するために役立つことができます。 インビボでの動物モデルは、検証の別の手段を表しており、最近でガレクチン-3およびガレクチン8の中心的な役割を確認するために、例えば、使用されました肺がん転移性ニッチは、として最初に細胞マイクロアレイ31、49介して同定しました。

他の多くの方法は、二次元の微細加工システム18、50、51、52、53、54、55及び三次元操作生体材料システム56、57、58の種々含む、細胞機能の微小環境調節を調べるために使用されています、59、60、61。他の方法と比較して、ここに記載した細胞マイクロアレイプラットフォームの特定の利点は、で構成されています:(1)最大スループット交互作用効果の解析を可能にする要因の異なる組み合わせの数百または数千。 (2)アクセス可能な、自動化されたイメージングと分析。 (3)配列の要素の制御されたプレゼンテーションで両方の生化学的および生物物理学的読み出しの統合。 (4)基板材料の特性を変化させる能力;細胞の運命および機能の(5)の高含有量の単一細胞分析。

要約すると、調整可能な基板の剛性の基板上にTFMを用いた細胞マイクロアレイの組み合わせは、両方の生化学的および生物物理学的な手がかりの徹底的な特性評価を可能にします。ここに示されるように、このプラットフォームは、一般化され、容易に細胞分化及びメカノの組み合わせ微小環境調節の改善された理解に向けて接着細胞タイプおよび組織の様々な状況に適用することができます。

Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Acknowledgments

私たちは認めるオースティンCyphersmithとMayandi Sivaguru(ゲノム生物学のためのカール・R. Woese研究所、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校)顕微鏡の支援のためと寛大顕微鏡コアで画面とビデオキャプチャを収容します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

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