Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55362
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana–Champaign

Summary

Дифференциация клеток регулируется множеством микроокружения факторов, в том числе как состав матрицы и материала подложки свойствами. Здесь мы опишем метод с использованием клеточных микрочипов в сочетании с тяговой силовой микроскопии для оценки как дифференцировки клеток и биомеханические клетки с субстратом взаимодействия как функция контекста микросреды.

Abstract

Микроизготовленном клеточные микрочипы, которые состоят из контактных печатных комбинаций биомолекул на упругой поверхности гидрогеля, обеспечивают жестко контролируется, с высокой пропускной инженерно-технической системы для измерения влияния выстроенных биохимических сигналов на клеточной дифференцировки. Недавние усилия с использованием клеточных микрочипов продемонстрировали свою полезность для комбинаторных исследований, в которых многие микросреды факторы представлены параллельно. Тем не менее, эти усилия были сосредоточены в основном на изучении влияния биохимических реакций на сигналы клеток. Здесь мы представляем ячейки микрочипов платформу с настраиваемыми свойствами материала для оценки как дифференцировки клеток с помощью иммунофлуоресценции и биомеханические клеток-субстратного взаимодействия с тяговой силовой микроскопии. Для этого мы разработали два разных формата, использующие полиакриламидных гидрогелей различного модуля Юнга, изготовленную либо на предметные стекла микроскопа или стеклянным дном чашки Петри. Мы предоставляем BESт методы и способы их устранения для изготовления микрочипов на этих гидрогелевых субстратов, последующей клеточной культуры на микрочипы и получения данных. Эта платформа хорошо подходит для использования в исследованиях биологических процессов , для которых и биохимические (например, внеклеточный матрикс композиции) и биофизических (например, жесткость подложки) может играть кии существенным, пересекающиеся роли.

Introduction

Взаимодействие между клетками и окружающими факторами микроокружения опосредует большое разнообразие биологических процессов , в ходе развития, гомеостаз, и болезни патогенез 1, 2, 3, 4. Эти микросреды взаимодействия включают доставку растворимых факторов для клеток, клеточную матрицу связывания и межклеточных взаимодействий посредством лиганд-рецепторного связывания. В дополнение к указанным выше биохимических соображений, биофизические параметры, такие как подложки механические свойства (например, модуль Юнга, пористость) и форма клеток, и связанным с ними вниз по течению механотрансдукция все чаще получили признание в качестве ключевых медиаторов клеточной дифференцировки 5, 6, 7, 8, 9 10. Сигналы, полученные в результате этих микроокружения взаимодействий служат в качестве входных данных для генных сетей и сигнальных путей. Кроме того, эти клеточные компоненты внутренней также обеспечивают обратную связь микросреды с помощью секретируемых факторов и разрушающих матрикс ферментов, завершая сложного взаимодействия регуляторная петля между сотовыми-характеристическая генетических программ и клеточных факторов микроокружения внешняя 5, 11, 12.

Использование инженерно - технических систем контролируемого представления микроокружения факторов, оказалась полезной в ряде различных контекстов 13, 14, 15. Микроизготовленном системы , в частности , способствовали точное пространственное структурирование белков и клеток, а также высоко распараллелен анализа с помощью миниатюризации 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Клеточные микрочипы представляют одну такую микроизготовленном систему , в которой комбинации биомолекул контактных печатают на подложке с гидрогелем упругая полиакриламидном 23, 24, 25. Включение клеточных компонентов клея (а именно матричные белки) обеспечивает устойчивую клеточную адгезию и культуру на микрочипов, который часто следуют вниз по течению анализа через иммуноцитохимию и флуоресцентных репортеров. Клеточные микрочипы были продуктивно направлены на достижение более глубокому пониманию клеток печени фенотипа 23, 26, нервной дифференцировки предшественника 27, Mammarу прародителя судьба решения 28, эмбриональных стволовых клеток обслуживания / дифференцировки 23, 29, 30, легких метастазирование рака 31, и терапевтический ответ при меланоме 32. Недавно мы продемонстрировали использование клеточных микрочипов для определения роли внеклеточного матрикса (ЕСМ) белковой композиции в спецификации энтодермы 33, печень прародитель дифференцировки 34, 35, и опухоль легкого ответа препарат клеток 36. В этих работах, мы сосредоточились на расширении комбинаторных возможностей платформы массива и исследуя пересечения клеточной внутренней сигнализации с внеклеточной матрицы композиции и биомеханики. Кроме того, мы внедрили биофизических отсчеты в этой платформе массива, чтобы обеспечить возможность количественно характериterize роль клеток сократительной в дифференциации процессов 35. Для этого, мы интегрировали тяги силовой микроскопии (TFM) с клеточных микрочипов для проведения оценки высокой пропускной способности клеток генерируемых тяги. МТФ широко используется метод измерения клеточных сгенерированных тяговые силы и обеспечил значительное понимание в отношении координации одноклеточных и функции ткани уровня с составом и биомеханики местного микросреды 37, 38, 39, 40. Таким образом, сочетая МТФ с сотовыми микрочипов обеспечивает систему высокой пропускной способностью для измерения ключевых, физиологически соответствующих биофизических параметров.

Платформа ячейки микрочипов описана здесь состоит из четырех разделов: изготовление полиакриламидных подложек, изготовление решеток, культивировании клеток и анализа считывания и анализа данных. ВидетьНа рисунке 1 для схематического резюме первых трех опытных участков; На рисунке 2 схематично резюме заключительной секции с акцентом на анализе данных иммунофлюоресценции. Для того , чтобы адаптировать ячейки микрочипов платформу для исследований биомеханических взаимодействий клетки с субстратом, мы использовали полиакриламидных субстраты модуля Юнга перестраиваемого но подобной пористости, в Wen и др. 41. Для включения измерения TFM сил, оказываемого клеток на их подложке, мы реализовали со стеклянным дном Петри формата блюдо в дополнение к толстым предметные стекла микроскопа часто используемых другими группами. Таким образом, эта ячейка микрочипов платформа способна параллельных измерений клеточной дифференцировки с помощью иммунофлуоресценции на предметные стекла микроскопа и клеточных генерируемых сил через МТФ на отдельных стеклянным дном посуды. Мы также применили несколько улучшений аналитического подхода обычно используется с сотовыми микрочипов. SpecificalLY, вместо параметрического Z-озвучивания общей интенсивности острова, мы измеряем интенсивность одноклеточных и применять квантильной нормализации для того, чтобы учесть ненормальных распределений и более точно описать поведение сотовой связи. Мы считаем, что эти усовершенствования обеспечивают особую полезность в отношении исследований биологических процессов, в которых как биохимические и биофизические сигналы играют важную роль, пересекающиеся. Кроме того, наши аналитические улучшения возможности применения клеточных микрочипов для изучения целого ряда клеточных функций, для которых одноклеточный и поведение на уровне населения расходиться.

Protocol

1. Изготовление полиакриламидном подложках

  1. Чистые стеклянные подложки - либо стандартные предметные стекла для конечных точек иммунофлюоресценции или стеклянным дном 35 мм чашки Петри для МТФ - для того, чтобы обеспечить изготовление гидрогеля оптимальной полиакриламида и целостность в процессе культивирования клеток. В качестве альтернативы, использование предварительно очищенных стеклянных подложек.
    1. Погружают стеклянные подложки в 0,25% об / об Тритона Х-100 в дистиллированной воде (дН 2 O). Поместите субстраты на орбитальном шейкере в течение 30 мин.
    2. Удалить Triton решение X-100 и полоскать подложек 5 раз с дН 2 O. Leave подложках , погруженных в последнем полоскании и место на орбитальном шейкере в течение 30 мин.
    3. Удалить дН 2 O и погрузить субстратов в ацетоне. Поместите субстраты на орбитальном шейкере в течение 30 мин.
    4. Удалите ацетон и погрузите субстратов в метаноле. Поместите субстраты на орбитальном шейкере в течение 30 мин.
    5. Удалить метанола и промыть подложек 5 раз с дН <суб> 2 O. Погрузитесь подложки в 0,05 н NaOH и место на орбитальном шейкере в течение 1 ч.
      ВНИМАНИЕ: NaOH весьма едкие и может вызвать серьезные ожоги кожи и повреждения глаз. Носите защитные перчатки, одежду и средства защиты глаз.
    6. Удалить раствор NaOH и прополоскать подложек 5 раз с дН 2 O. Используйте фильтрованный сжатый воздух для сушки подложки и выпекать при температуре 110 ° С на горячей плите до сухого (5 - 15 мин). Очищенные субстраты можно хранить при комнатной температуре до бесконечности.
  2. Silanize чистые стеклянные подложки, чтобы обеспечить прикрепление полиакриламидного гидрогеля.
    1. Погружают чистые стеклянные подложки в свежеприготовленной 2% об / об 3- (триметоксисилил) пропилметакрилат (3-ТРМ) в этаноле. Поместите субстраты на орбитальном шейкере в течение 30 мин.
      ВНИМАНИЕ: 3-ТРМ является горючей жидкостью. Хранить вдали от источников тепла, искр, открытого огня и горячих поверхностей и использовать только в химическом вытяжном шкафу.
    2. Удалить 3-ТРМ раствор и погрузить субстратов в этанольннол. Поместите субстраты на орбитальном шейкере в течение 5 мин.
    3. (- 15 мин 5), чтобы высушить субстраты и выпекать при температуре 110 ° С на горячей плите до сухого использовать фильтрованную сжатым воздухом. Силанизированы подложки можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца.
  3. Вариант 1: Изготовить полиакриламидных гидрогелей на силанизированы микроскопа для конечных точек иммунофлюоресценции.
    1. Приготовьте предварительно полимерного раствора в дН 2 O с желаемой акриламид / бис - акриламида в процентах (вес / объем) , чтобы изготовить субстраты с модулем Юнга 4 кПа (4% акриламид, 0,4% бис - акриламида), 13 кПа (6% акриламида, 0,45 % бис - акриламида), или 30 кПа (8% акриламида, 0,55% бис - акриламида) и аналогичные пористость, за Вен и др. 41. Vortex раствор до получения прозрачного раствора и фильтр с шприца 0,2 мкм. Предварительно полимерные растворы могут храниться при температуре 4 ° С в течение 3-х месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие акриламид или бисакриламида может привести к острой токсичности, Neurotoxicity, и раздражение. Носите защитные перчатки, одежду и средства защиты глаз.
    2. Готовят фотоинициатор раствор 20% вес / об Irgacure 2959 в метаноле. Этот раствор фотоинициатора не могут быть сохранены и должны быть готовы свежие каждый раз.
    3. Смешайте форполимера и фотоинициаторов растворы в соотношении 9: 1 (фотоинициатор форполимер). Необязательно дегазацию с вакуумной камерой в течение 15 мин для удаления пузырьков.
    4. Поместите силанизированы слайды в сушильную стеклянный поддон и пипеткой 100 мкл 9: 1 форполимер: фотоинициатор раствора на каждый слайд. Аккуратно покрыть каждый слайд с покровным мм 22 × 60 избегая при этом создания пузырьков. Обратите внимание, что покровное предотвращает ингибирование реакции полимеризации кислородом.
    5. Место для сушки лотка в УФ сшивателя и выставить слайды 365 нм УФ - А в течение 10 мин (4 Вт / м 2). Оптимизировать время полимеризации по мере необходимости. Длительном воздействии трудности риска удаления покровное из-за overpolymerization. Более короткие выдержки гИСК underpolymerization и низкая стабильность гидрогеля.
    6. Погрузитесь гидрогели в дН 2 O в течение 5 мин. Удалить покровные с бритвой, следя за тем, чтобы не повредить полимеризованные гидрогели.
    7. Оставьте гидрогели в дН 2 O при комнатной температуре в течение 1 - 3 суток, меняя дН 2 O ежедневно. не Дегидрировать гидрогели при 50 ° С на горячей плите до полного высыхания (15 - 30 мин) и хранить при комнатной температуре в течение до 3-х месяцев.
  4. Вариант 2: Изготовить флуоресцентных шарик, содержащий полиакриламид гидрогели на силанизированы 35 мм стеклянным дном чашки Петри для живой оценки клеточного субстрата взаимодействий с использованием МТФ.
    1. Разрушать ультразвуком исходного раствора флуоресцентных шариков размером 1 мкм в течение 15 мин для разгона агрегатов.
    2. Приготовьте предварительно полимерного раствора в дН 2 O с желаемой акриламид / бис - акриламида в процентах (вес / объем) , чтобы изготовить субстраты с модулем Юнга 4 кПа (4% акриламид, 0,4% бис - акриламида), 13 кПа (6% акриламид, 0+0,45% Бис - акриламида), или 30 кПа (8% акриламида, 0,55% бис - акриламида) и аналогичные пористость, за Вен и др. 41. Vortex раствор до получения прозрачного раствора и фильтр с шприца 0,2 мкм. Предварительно полимерные растворы могут храниться при температуре 4 ° С в течение 3-х месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие акриламид или бисакриламида может привести к острой токсичности, нейротоксичности и раздражение. Носите защитные перчатки, одежду и средства защиты глаз.
    3. Добавить флуоресцентные шарики в раствор форполимера при конечной концентрации 0,2% об / об и вихрем перемешать.
    4. Готовят фотоинициатор раствор 20% вес / об Irgacure 2959 в метаноле. Этот раствор фотоинициатора не могут быть сохранены и должны быть готовы свежие каждый раз.
    5. Смешайте форполимер / шарик и фотоинициаторов решения в соотношении 9: 1 (предварительно полимер / шарик: фотоинициатора) соотношение. Необязательно дегазацию с вакуумной камерой в течение 15 мин для удаления пузырьков.
    6. Поместите силанизированы 35 мм с прозрачным дном чашки Петри в лоток сушки стекла и рIPET 20 мкл 9: 1 форполимер / шарик: фотоинициатор решение на центр каждой тарелки. Аккуратно покрыть каждый слайд с круговой покровное 12 мм, избегая при этом создания пузырьков. Обратите внимание, что покровное предотвращает ингибирование реакции полимеризации кислородом.
    7. Для того , чтобы распределить флуоресцентные шарики на поверхность гидрогеля, инвертировать посуду и оставить при комнатной температуре в течение 20 мин, за Knoll и др. 42.
    8. В то время как все еще перевернутой, выставить посуду на 365 нм УФ - А в течение 10 мин (4 Вт / м 2). Оптимизировать время полимеризации по мере необходимости. Длительном воздействии трудности риска удаления покровное из-за overpolymerization. Более короткие underpolymerization рисков и низкая стабильность гидрогеля.
    9. Погружают гидрогели в 0,1 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) буфера и оставить при комнатной температуре в темноте в течение ночи. Осторожно удалите покровные с бритвой, следя за тем, чтобы не повредить polymeавторизованном гидрогели.
    10. не Дегидрировать гидрогели при 50 ° С на горячей плите, пока сухой (15 - 30 мин). Гидрогели можно хранить при комнатной температуре в темноте в течение 3-х месяцев.

2. Изготовление Массивы

  1. Подготовка буфера для печати биомолекул. Используйте буфер печати, соответствующий биомолекул интереса. фактор роста (GF) буфер печати широко подходит для других классов молекул, таких, как клетка-клетка лигандов.
    1. Для приготовления 2 × ЕСМ буфера печати белка, добавляют 164 мг ацетата натрия и 37,2 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) к 6 мл дН 2 O. Vortex и инкубировать при 37 ° С , чтобы полностью солюбилизировать. После солюбилизации добавляют 50 мкл предварительно подогретого Тритона Х-100 и 4 мл глицерина. Вихревые и инкубировать при 37 ° C еще раз для солюбилизации. Добавить 40 - 80 мкл ледяной уксусной кислоты, титрование для доведения рН до 4,8. 2 × ЕСМ печать белковый буфер может храниться при температуре 4° С в течение 1 месяца.
      ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота легковоспламеняющихся и коррозионных. Носите защитные перчатки, одежду и средства защиты глаз.
    2. Для приготовления 2 × буфера GF печати, добавить 105,5 мг ацетата натрия и 37,2 мг ЭДТА до 6 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Вихревые и инкубировать при 37 ° С, чтобы полностью солюбилизировать. После солюбилизации добавляют 100 мг 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонатом (CHAPS) и 4 мл глицерина. 2 × буфера печать Г.Ф. белка можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
  2. Подготовьте источник пластину.
    1. В 384-луночного V-дно микропланшета, объединить равные объемы 2 × печатного буфера с каждым биомолекулы раствором в два раза больше целевой концентрации.
      Примечание: Соответствующий целевой концентрации для наиболее распространенных белков ECM составляет 250 мкг / мл в то время как целевые концентрации для других типов выстроенных факторов варьируются в зависимости от удержания в гидрогеля и биологической функции. Общий объем в каждой ячейке может бытьпо цене от 5 мкл и не должны быть более 15 мкл. В дополнение к комбинации биомолекулы, представляющие интерес, включают в себя упорядоченную флуоресцентный маркер, чтобы облегчить вниз по течению анализа изображения. Используйте родамин-конъюгированного с декстран (2,5 мг / мл).
    2. Смешайте каждую лунку тщательно пипеткой, следя за тем, чтобы не генерировать пузырьки. Центрифуга источника микропланшет в течение 1 мин при 100 х г. Изготовить микрочипов с использованием исходных пластинок, полученных в тот же день и хранили при 4 ° С до изготовления микрочипов.
  3. Чистые контакты в соответствии с инструкциями изготовителя перед каждым изготовления микрочипов бегу. Загрузите чистые контакты непосредственно в печатающей головки microarrayer.
  4. Подготовьте microarrayer и программу, используя программное обеспечение производителя. Хотя приведенные ниже шаги являются частично специфическими для конкретного microarrayer используемой здесь, работа большинства microarrayers аналогична.
    1. Включите блок увлажнителя, отрегулируйте уставку до 65% RH (без-уплотняет), и ждать, пока реометр не совпадает с контрольной точки. Поместите источник пластину в соответствующий адаптер.
    2. Высушить гидрогелевые субстраты при 50 ° С в течение 15 мин и помещают в соответствующий адаптер. Microarrayer имеет адаптеры для обоих предметные стекла микроскопа и микропланшетов. Для выстроив 35 мм с прозрачным дном чашки Петри, загружать посуду в микропланшет 6-луночного и поместите микропланшет в адаптер для микропланшетов на arrayer.
    3. Настройте параметры программы , чтобы точно отразить расположение источника пластины, дизайн массива, и нужный формат (например, предметное стекло или микропланшет , содержащий 35 мм чашки Петри). Включите этапы стирки с использованием как воды и диметилсульфоксид (ДМСО) между каждым условием для того, чтобы предотвратить унос и перекрестного загрязнения.
    4. Начало изготовления массива, не проверяя не реже, чем раз в час, что влажность не упала ниже 65% RH (без конденсации), и что контакты не забиты. Если ХумиDity упал неожиданно, пауза выстроив, чтобы заполнить увлажнитель воздуха и очистить связанные трубки конденсации. Если контакты загрязнились, пауза выстроив для очистки булавки или иным образом заменить предварительно очищенную штифтами. Обратите внимание , что можно массив из нескольких типов биомолекул последовательно на одних и тех же подложках обеспечить достаточный уровень времени сушки (т.е. 4 ч до в течение ночи).
    5. После того как программа будет завершена, поместите сфабрикованные массивы в окне слайдов или микропланшет, покрытый алюминиевой фольгой при комнатной температуре и относительной влажности 65% (без конденсации) в течение ночи. Обратите внимание, что может быть необходимо для оценки качества массива и сохранение с использованием общих белковых пятен или иммунофлюоресценции; см Брафман и др. для более подробной информации 25.

3. Культура клеток и анализа счётчика

  1. На следующий день после изготовления, место выстроенных субстратов в 4-камерных Петри (предметные стекла микроскопа) или 6-луночных микропланшетов (чашки Петри) и погружают в 1%об / об пенициллин / стрептомицин в PBS; используют 4 мл для слайдов и 3 мл для посуды. Expose к УФ-С в течение 30 мин. Обмен раствор пенициллина / стрептомицина для культивирования клеток.
  2. Сбор и подсчет клеток. Семя на массивах при 500 × 10 3 - 2 × 10 6 клеток / массив в 4 мл на предметное стекло микроскопа и 3 мл на 35 мм чашку Петри. Инкубируйте культур массива при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 2 - 24 ч или до образования густонаселенных островов клеток. Регулировка плотности и времени, сколько необходимо для клеток и конкретного применения высева. Underseeding (т.е. низкой плотности или высева времени) может привести к плохому населения массива и перекошенных биологических результатов. Подсева (т.е. высокой плотности или высева времени) может привести к снижению целостности массива из - за островного отряда.
  3. После предоставления возможности для образования клеточных островков, моют культур массива дважды подогретого среды для культивирования клеток; снова используют 4 мл для слайдов и 3 мл для посуды. OptionaLLY добавить соответствующие элементы управления и процедуры (например, небольшие молекулы ингибиторов, факторы роста и т.д.) , представляющие интерес для биологической системы. Изменение СМИ каждый 1 массивов - 2 D, чтобы поддерживать концентрацию каких-либо процедур. Оценка экспрессии клеточного маркера и функции клеток с помощью иммунофлюоресценции или клетка-субстрат взаимодействий по ПМФ в пределах 1 - 5 г инициирующего культур массива - см Вариант 1 и Вариант 2 ниже.
  4. Вариант 1: Выполнение конечной точки иммунофлюоресценции. Обратите внимание, что иммунофлюоресценции некоторых белков может потребоваться более жесткие пермеабилизации с использованием метанола, этанола или HCl. Из-за потенциального ущерба для массивов, оценивать и оптимизировать каждый протокол пермеабилизирующего перед использованием в более масштабных экспериментах.
    1. Отберите среды для культивирования клеток из горок массива в 4-камерные блюд и добавить 4 мл / сползание свежеприготовленного 4% об / об параформальдегид (PFA) в PBS. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: ВыставокЮр к PFA может привести к острой токсичности, а также может вызвать раздражение или разъедают кожу при контакте. Носите защитные перчатки, одежду и средства защиты глаз и использовать только в химическом вытяжном шкафу.
    2. Отберите решение PFA и мыть каждый слайд 3 раза 4 мл PBS. На данный момент, фиксированные слайды могут храниться при температуре 4 ° С в течение 1 недели. Желательно, однако, чтобы продолжить через иммунноокрашивания и монтаж в тот же день, что и фиксации, с тем, чтобы обеспечить целостность массива.
    3. Отберите PBS и добавляют 4 мл / скольжение 0,25% об / об Тритон Х-100 в PBS. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Отберите Triton решение X-100 и мыть каждый слайд 3 раза 4 мл PBS. Добавить 4 мл / слайд 5% об / об сыворотки совпавшего к видам вторичного антитела (например, ослов сыворотка для ослиные вторичных антител) в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч.
    5. Тщательно удалите блокирующий раствор из каждого слайда. Добавить 500 мкл / слайд первичного антитела, разбавленного в 5% об / об сыворотки в PBS, Этого объема достаточно, чтобы покрыть массивы для обоих 1 ч инкубирования при комнатной температуре, а также на ночь инкубацию при 4 ° С.
    6. Промыть каждый массив слайд 3 раза 4 мл PBS. Тщательно удалить конечную промывку и добавить 500 мкл / слайд соответствующего вторичного антитела, разбавленного в 5% об / об сыворотки в PBS.
    7. Промыть каждый массив слайд 3 раза 4 мл PBS. Кратко промыть водой с дН 2 O , прежде чем осторожно удалить слайды массива из раствора с помощью пинцета. Используйте лабораторную салфетку впитывать или сухой остаток дН 2 O.
    8. Пипеткой 100 мкл монтажа раствора с DAPI через слайд в то время как визуально, подтверждающий полное покрытие всего массива.
    9. Поместите 22 × 60 мм покровное над горкой для монтирования. Печать края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей. Хранить в темном месте при температуре 4 ° С до обработки изображений, не ранее, чем на следующий день.
    10. Изображение целые массивы, используя либо сканер микрочипов или перевернутой флуоресцентного микроскопа equippэд с роботизированной стадии. Микрочипов сканеры обеспечивают более быстрое считывание , но может потребоваться Cy3- или Cy5-совместимые флуорофоры и зачастую ограниченного разрешения при заказе отдельных клеток (то есть, 1 - 10 мкм). Флуоресцентные микроскопы обеспечивают возможность использовать различные флуоресцентные каналов и более высокое разрешение (<1 мкм, ~ 100 × общее увеличение), но обеспечивают более медленное считывание в зависимости от качества роботизированной стадии и увеличения / цели.
    11. Сохранить захваченный образы целых массивов из любого метода , как TIFF - файлов, чтобы предотвратить сжатие данных или потери , связанные с другими форматами файлов (например, JPG).
  5. Вариант 2: Провести прямую оценку клеточного субстрата взаимодействий с использованием МТФ.
    1. Готовят раствор 1% об / об бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1% об / об додецилсульфата натрия (SDS) в PBS до диссоциации клеток из субстратов в процессе МТФ.
    2. Перемещение 35 мм чашки Петри, содержащие культуры массива винкубировали (37 ° C, 5% CO 2), перевернутый флуоресцентный микроскоп с роботизированной сценой для измерений ПМФ.
      1. В одном блюде, отметьте позиции (X-координата, Y-координата) и фокус плоскости (Z-координата) отдельных островков клеток с использованием фазово-контрастной микроскопии.
      2. Переход к дальним красным флуоресцентной микроскопии для визуализации бусинки. Возвращение в каждой из позиций, сохраненных в предыдущем шаге и коррекции Z-координату фокальной плоскости таким образом, что только первый слой бусин ниже острова клеток находится в фокусе. Сохраните новые координаты и перейти к автоматизированной визуализации всех островков клеток для захвата фазового контраста до диссоциации и дальнего красного флуоресцентного изображения.
    3. Осторожно добавьте 150 мкл раствора BSA / SDS на блюдо и подождать 5 минут, чтобы позволить полной диссоциации клеток от субстрата; мониторинг диссоциации клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии.
    4. После того, как клеточные островки были отделены от подложки, вернуться к тон отметил позиции и убедитесь, что первый слой шариков все еще находятся в фокусе. Если эти шарики некомпланарный из-за деформации, вызванной клетками генерироваться тяги, а затем скорректировать Z-координату фокальной плоскости таким образом, что они снова в фокусе. Сохранить исправленные Z-координаты и повторить автоматическую визуализацию всех островов, чтобы захватить после диссоциации далеко красные флуоресцентные изображения.
    5. Повторите шаги 3.5.1 - 3.5.4 для остальных блюд.

4. Анализ данных

  1. Анализ данных иммунофлюоресценции.
    1. Процесс полученных изображений массива. Сплит составных изображений массива в файлы , содержащие отдельные каналы (то есть, красные, синие или зеленые) и конвертировать в 8-битных TIFF - изображений 43, 44. Применяют биннинга (например, 2 × 2 или 4 × 4) , чтобы уменьшить размер изображения до ~ 32 мегапикселей на канал , чтобы уменьшить требования к памяти во время ниже по течению анализа одной ячейки ENTIповторно изображений массива. См Дополнительный код Файл под названием "array_processing.ijm" для реализации макро ImageJ этих шагов обработки массивов.
    2. Обратите внимание, координаты в пикселях верхнего левого, нижнего левого и нижнего правого родаминовых-конъюгированного декстрана маркеров или выстроенных условий. Используйте эти координаты для вращения 8-битный TIFF изображений быть совершенно вертикальными, а затем, аннотировать вывод из анализа одноклеточного с конкретными выстроенных условиями. См Дополнительный код файлов под названием "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", и "array_gridding.ijm" для реализации этих массива вращающемся и Гридинг шаги.
    3. Выполнить анализ одноклеточного из Binned, повернутый 8-битные TIFF изображения в CellProfiler (версия 2.1.1) 45 с использованием следующих модулей: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects и MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects идентифицирует ядра, IdentifySecondaryObjects идентифицирует immunolabels, связанные с каждым клеточного ядра, и MeasureObjectIntensity обеспечивает количественными как для ядерных этикеток и immunolabels.
      1. Выходные данные одноклеточные из всех трех модулей в виде файла CSV по каналу с помощью модуля ExportToSpreadsheet для облегчения позже вниз по течению анализа. См Дополнительный код файлов под названием "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", и "rgb_array_image_analysis.cppipe" для CellProfiler трубопроводов, реализующих эти шаги для наборов изображений, содержащих красный, зеленый или синий каналы.
    4. Для преобразования данных для учета экспериментальной изменчивости и негауссовских распределений одноклеточных, применяются квантили нормализацию биологической повторности 46. Этот процесс генерирует общий распределение по повторах и позволяет беспристрастные сравнения изменений в immunolabel интенсивности. Кроме того, УНЛIKE Z-скоринг и другие параметрические методы, квантиль нормализация непараметрический и не предполагает конкретное распределение данных, что позволяет более представительный анализ поведения одноклеточных в зависимости от состояния доченной.
    5. Участок данных и интерпретации. В зависимости от биологической системы и гипотезы, подсчитано и представлено графически одного или нескольких из следующих мер ансамбля для каждого доченной состояния:
      1. Подсчитано и представлено графически клеток на острове в качестве комбинированного измерения адгезии и выживаемости за ходом эксперимента.
      2. Рассчитать и построить интенсивности immunolabel квантиль нормированного как мера судьбы или функции клеток.
      3. Подсчитано и представлено графически процент клеток, позитивных для immunolabel, как определено выше интенсивности последовательного порога, как правило, 2 С.Д. выше средней интенсивности отрицательного контроля.
      4. В качестве альтернативы, участок распределения immunolabel интенсивности для того, чтобы изучить и классифицировать поведение одноклеточныхв зависимости от состояния доченной. Эти распределения могут быть дополнительно охарактеризованы с использованием мер центральной тенденции (среднее, медиана, мода) и вариации (дисперсии, коэффициента вариации, Fano фактор) и методы проверки гипотез, таких как тест Колмогорова-Смирнова.
  2. Анализ данных TFM. Здесь описан подход , включающий ранее разработанный алгоритм Батлером и др. и Ван и др. 40, 47.
    1. Используйте ImageJ для пакетного конвертирования изображений в 8-битных файлов TIFF. Применить пиксельный усредненный биннинга (например, 2 × 2) , чтобы уменьшить вычислительные затраты и время ниже по течению анализа. Поскольку алгоритмы МТФ были сосредоточены в основном на анализе одноклеточного, большая клетка-субстрат интерфейс островов (~ 17,5 × 10 3 мкм 2) по сравнению с интерфейсом клеточного субстрата одной клетки necessi (75 мкм 2)Tates с этапа бининг.
    2. Ввод захваченное фазового контраста и дальнего красного флуоресцентные изображения (как до диссоциации и после диссоциации) в научной среде программирования , такие как MATLAB и процесс с использованием ранее разработанных алгоритмов Butler и др. и Ван и др. 40, 47.
      1. Выберите три области удаленных от острова клеток. Эти регионы используются для учета перемещений из-за изображения или дрейфа образца.
      2. Обеспечить коэффициент для преобразования пикселей в микрометров (например, 0,454 пикселей / мкм), модуль Юнга подложки (например, 13 кПа) и коэффициент Пуассона (например, 0,48 для полиакриламидных гелей , описанных здесь).
      3. Для каждого острова, провести границу по периферии для определения геометрических ограничений; все силы за пределами этой границы обнулены. Эта система ограничена разумно учитывая большой Количессть (то есть, 450 мкм) между островами.
    3. Рассчитывают среднеквадратическое тяговое усилие и сократительную момент для каждого острова. Сократительную момент является мерой остаточного напряжения через остров клеток , и было показано , чтобы отразить силу межклеточных взаимодействий 48. Для каждого выстроил состояния, средние среднеквадратическое значения на нескольких островах и биологических повторностей и вычислите связанная с ним дисперсия для проверки гипотез. Кроме того , можно усреднить распределение напряжений или моментов на протяжении многих островов , чтобы обеспечить репрезентативную карту обоих мер в зависимости от геометрии, например, расстояние от центра острова.

Representative Results

Используя эту платформу, мы исследовали роль биохимических и биофизических репликами в спецификации судьбы клеток - предшественников печени 34, 35. Лиганды / G-конъюгированного Notch белка А показали улучшенное удерживание и кластеризацию в полиакриламидного гидрогеля (рис 3А) и , кроме того , были способны управлять дифференцировку клеток - предшественников печени в направлении желчных протоков клеточной судьбы (рис 3B). Используя анализ одноклеточного, мы количественно ответ на лигандов Notch для белков ЕСМ коллаген I, коллаген III, коллаген IV, фибронектин и ламинин (3С), находя , что реакция клеток - предшественников печени лиганда зависит также от контекст ECM. В прошлом, мы использовали shRNA нокдаун для генерации клеток - предшественников печени без лигандов Dll1 и jag1. Ответ на доченной лиганда Notch варьируется в зависимости от прesence либо лиганда, подтверждая , что отзывчивостью на клетки-лиганда внешний также является функцией клеточного характеристическая экспрессии лиганда (рис 3D). Кроме того, мы наблюдали отчетливую субпопуляции двойной положительный (ALB + / OPN +) клеток в Dll1 нокдаун (рис 3D). Вместе эти представительные результаты показывают: (1) комбинаторные возможности формата массива, в качестве примера спариванием множественных одел ECM белков и лигандов Notch с нокдауна отдельных лигандов; (2) функциональность не только выстроены белков ЕСМ, но и выстроены межклеточную лиганда с белком A / G-опосредованной конъюгации; и (3) осуществление анализа одноклеточных и его способность различать уникальные субпопуляции.

Мы также отметили , что дифференцировка клеток - предшественников печени зависит как от жесткости подложки и ЕСМ композиции (рис 4A Онг>), в частности , находя , что коллаген IV благоприятствуют дифференциации на мягких и жестких подложек в то время как фибронектин поддерживает только дифференциацию на жестких подложек (рис 4б). Типичные тепловые карты измерений ПМФ предположил , что устойчивое тяговой напряжение при низкой жесткости подложки на коллагена IV способствует дифференциации в клетках желчных протоков (рис 4в) нахождения подтверждается средним среднеквадратическое значений (рис 4D). Вместе эти представительные результаты показывают: (1) успешная интеграция МТФ с сотовыми микрочипов на подложках с перестраиваемой жесткостью, чтобы оценить как фенотип клеток и тяговое усилие; (2) координация судьбы клеток-предшественников печени как с составом матрицы и жесткости подложки; и (3) осуществление наших ПМФ анализа и типичных профилей тяги напряжений в клеточных микрочипов.

е 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Обзор Схематическое изображение первых трех опытных участков. В разделе 1, стеклянные подложки очищают и силанизированы, чтобы облегчить изготовление полиакриламидных гидрогелей. В разделе 2, комбинации биомолекул, представляющие интерес, получают в исходном микропланшет 384-луночного. Роботизированный arrayer затем загружается с чистыми штифтами, источник микропланшет и полиакриламидных гидрогелей и инициализируется, фабрикации массивы на гидрогелей. В разделе 3, клетки высевают на Выстраиваемый домены и дают возможность прилипать, после чего протокол культура интерес выполняется. В конечной точке клетки являются либо фиксированными для иммуноцитохимию / иммунофлюоресценции или анализировали с использованием МТФ. Шкала баров 75 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

в-странице = "1"> фигура 2
Рисунок 2: Обработка и анализ иммунофлуоресценции данных из массивов. (A) плиточные, составные 32-битные RGB - изображения сначала Binned , а затем разделить на отдельные 8-битных каналов. Используя сочетание выстроенных флуоресцентных маркеров и клеточных островков, три угла массива идентифицируются для обеспечения автоматизированной ориентации и Гридинг массивов. (Б) данные Одноклеточный генерируется для каждого канала из входных массивов. Для того, чтобы учесть экспериментального дрейфа, квантиль нормализация применяется биологической повторности, производя один общий распределение во всех повторах. Квантиль нормированы данные впоследствии построены и интерпретированы с помощью расчета измерений ансамбля (например, клеток / остров, средняя интенсивность, процент клеток положительных на этикетке) или прямого анализа распределений одноклеточных.м / файлы / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Notch лигандом Презентация посредничает печени Прародитель Дифференциация. (A) Fc-рекомбинантный Notch лигандов Jagged-1 (jag1) и Дельта-1 ( например Dll1) выставлены улучшенное удерживание и кластеризацию при выстроенных с белком A / G. Шкала бар составляет 50 мкм. Клетки - предшественники (B) Печень дифференцированы в клетках желчных протоков при предъявлении с лигандом Notch. 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) представляет собой ядерный ярлык, альбумин (ALB) является печеночная клеточный маркер, и остеопонтина (OPN) представляет собой желчный проток клеточный маркер. Шкала бар составляет 150 мкм. (C) Количественная процента клеток , положительных на OPN для лигандов Notch jag1, Dll1 и Дельта-как 4 (Dll4) на ECM белков коллагена I, сollagen III, коллаген IV, фибронектин и ламинин. Т - тестов Стьюдента были выполнены против контрольного IgG для каждого выстроил лиганда Notch внутри каждого ECM белка с P-значения , указанного при Р <0,05 (*). (D) визуализации цитометрия ALB и OPN для клеток на коллаген III , представленных с лигандами Notch jag1, Dll1 и Dll4. Клетки - предшественники печени без Notch лигандов Dll1 и jag1 (т.е. shDll1 и shJag1) были получены с использованием shRNA нокдаун. Данные в (С) представлены как среднее ± стандартная ошибка эта цифра была изменена с Kaylan и соавт. 34. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Матрица Состав и основания Жесткость Сооrdinate печени прародителя дифференциацию. (A) прародитель печени дифференцировка клеток желчных протоков зависит как от состава ECM и жесткости подложки. DAPI является ядерная метка, ALB является печеночная клеточный маркер, и OPN является желчный проток клеточный маркер. (В) Количественное процента клеток , положительных на OPN на подложках модуля Юнга 30 кПа, 13 кПа и 4 кПа в течение коллагена I (С1), коллаген IV (С4), фибронектина (FN), и все двухсторонние комбинациям ECM эти белки. (С) Cell тяговое усилие зависит как от жесткости подложки и состава ЕСМ. (D) Количественное среднеквадратическое значения тягового напряжения на подложках модуля Юнга 30 кПа и 4 кПа для коллагена I (C1), коллаген IV (C4), фибронектина (FN), и все двухсторонние комбинации этих ECM белки. В (В) и (D), данные были представлены в виде среднего значения ± СЭМ и Стьюдента - тестовбыли выполнены на 30 кПа для каждой комбинации ECM с P-значениями, указанными при Р <0,05 (*), р <0,01 (**), и P <0,001 (***). Шкала баров 50 мкм. Эта цифра была изменена из Kourouklis и др. 35. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Раздел проблема Возможные причины Решение
1. Изготовление полиакриламида субстрата. Покровного стекла не могут быть удалены из гидрогеля. Overpolymerization. Сокращение времени полимеризации до <10 минут (4 Вт / м 2). Убедитесь, что УФ-crossliВыход nker находится в пределах ожидаемого диапазона.
Бедный полиакриламидном гидрогель полимеризации. Underpolymerization. Увеличьте время полимеризации до> 10 минут (4 Вт / м 2). Убедитесь, что выход УФ сшивающий находится в пределах ожидаемого диапазона.
Полиакриламидных гидрогелей повреждены после удаления покровного стекла. Мягкие гидрогели полиакриламид легко повредить. Мы наблюдаем уменьшение выхода изготовления гидрогеля (~ 50%) для мягчайший (т.е. 4 кПа) гидрогели в частности. Ручка гидрогели мягко и увеличить стартовых номеров для достижения желаемого выхода.
2. Изготовление массивам. Плохое или несовместимыми пятна морфологии. Противоречивые Увлажнитель функция. Убедитесь, что увлажнитель воздуха и реометра функционал в течение каждого тиража и поддержания относительной влажности 65%.
Пальцы застряли в печатающей головке или засоритьВГО. Очистите печатающую головку, чтобы обеспечить свободное перемещение штифта. Чистые штифты тщательно до или после каждого тиража для удаления агрегатов из контактных каналов.
3. Культура клеток и анализа исполнения. Открепления клеток или смерти на массивах после первоначального вложения. Подсев и чрезмерное распространение. Уменьшите начальную плотность и время посева. Используйте "обслуживание" или "дифференциация" СМИ во время культивирования массива для уменьшения пролиферации клеток.
Выброс токсичного мономера акриламида из гидрогеля. Замочите гидрогели в дН 2 O в течение по крайней мере 3 дней для обеспечения диффузии / выпуска мономера акриламида и снижения токсичности клеток.
Клетки не прикрепляются к массивам. Underseeding. Повышение начальной плотности и времени посева. Используйте более высокой адгезией тип клеток.
Плохое отложениематрица или условие биомолекулы. Чистые контакты частиц и агрегатов, подтверждают параметры печати, а также оценить пятнистость флуоресцентных маркеров, например, родамина-декстрана с сопряженными.
Специфичность клеточной матрицы взаимодействий. Различные типы клеток придерживаться специально для некоторых, но не других белков ECM. Протестируйте несколько различных белков ECM с клетками.
Субоптимальное хранения массива после изготовления. Мы рекомендуем хранить произведенную массивы в течение ночи при 65% относительной влажности и комнатной температуре, в частности, чтобы избежать изменения фазы в процессе замораживания. Адгезия клеток чувствительна как к влажности, температуры и времени хранения; убедитесь, что эти параметры соответствуют / оптимизированы для ваших экспериментов.
Отрыв гидрогель из стеклянной подложки во время культивирования клеток. Плохое качество очистки слайдов и силанизация. Заменить рабочие растворы для очистки слайдов исиланизация.
Overdehydrated гидрогель. Не оставлять гидрогели дегидратирующих на горячей плите в течение более 15-30 мин.
4. Анализ данных. Высокая изменчивость между повторными пятен и горками. Изменчивость в изготовлении массива. Убедитесь, что контакты и печатающей головки чистые. Подтвердите функцию увлажнителя. Визуализируйте и количественного определения пятна и массива качества с использованием флуоресцентных маркеров. Хранить массивы, как рекомендовано выше.

Таблица 1: Устранение неисправностей.

Discussion

В наших экспериментах мы обнаружили, что наиболее распространенные ошибки связаны с качеством готовых массивов и плохо характеризуется отклик в биологической системе, представляющей интерес. Мы отсылаем читателя к таблице 1 для общих режимов отказа в клеточных микрочипов экспериментов и связанных с ними действий по устранению неполадок. Что касается качества массивов, в частности, мы рекомендуем следующее. Подтверждение технического качества и надежности выстроив программ, параметров и буферы с использованием флуоресцентно меченных молекул, таких как родамин-конъюгированного с декстраном. Тщательно очистите контакты до или после выстроив в соответствии с инструкциями изготовителя и дополнительно визуально проверить, что пин каналы очистить от мусора с помощью светового микроскопа. Подтвердите Arrayed сохранение биомолекулярная с использованием общих пятен белка или иммунноокрашивания. Следует отметить , что биомолекул с молекулярной массой ниже 70 кДа , которые часто не сохраняются в гидрогеле 23, SUP> 31. Проверка Arrayed биомолекулярная клеток-функциональность с использованием нескольких типов клеток. Обратите внимание, что только адгезивные клетки совместимы с массивами; Кроме того, адгезия к массивам зависит от обеих клеточных специфических свойств (например, интегрин профиль экспрессии) и выбранных белков ECM.

Из -за ограниченного пространства, мы не предусмотрели обширную обработку массива дизайна, верстка и изготовление здесь и отсылаем читателя к предыдущим работам 23, 25. Как правило , мы используем 100 выборочные подмассива (диаметр 150 мкм пятно, 450 мкм от центра до центра расстояния) , состоящие из 10-20 уникальных условий биомолекулы (например, 5-10 пятен / состояние). Число подмассивов в одном массиве изменяется в зависимости от количества биомолекул условий, представляющих интерес, которые могут быть удобно увеличенному до 1,280 на один 25 × 75 мм стекло микроскопа (~ 6,400 пятна в 64 подмассивов)Xref "> 25, 31 Параметры выше , будет в дальнейшем меняться в зависимости от размера рисунка интереса;. штырьки , способные генерировать шаблоны от 75 - 450 мкм , легко доступны.

Эксперименты с массивами лучше всего дополняют проверки высокой скоринговых выстроенных условий, представляющих интерес с использованием других форматов культуры, анализа считываний и систем биологической модели. В частности, мы рекомендуем дополнительно проверки влияния некоторых выстроенных условий с использованием массовых культур в сочетании со стандартными методами молекулярной биологии (например, QRT-ПЦР, иммуноблоттинга) или стандартного МТФ. Генетические манипуляции (например, нокдаун или избыточная экспрессия) фактора интереса в соответствующей биологической модели системы может также служить для подтверждения эффектов , наблюдаемых в массивах. В естественных условиях животные модели представляют собой еще одно средство проверки и недавно были использованы, например, чтобы подтвердить центральную роль галектина-3 и галектина-8рак легких метастатическим нишу, как это было первоначально идентифицированы с помощью микрочипов клеток 31, 49.

Ряд других методов были использованы для исследования микросреды регуляции клеточных функций, в том числе различных двумерных микроизготовленном систем 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 и трехмерных инженерных систем биоматериала 56, 57, 58 , 59, 60, 61. По сравнению с другими методами, особые преимущества ячейки микрочипов платформы, описанные здесь, включают в себя: (1) пропускной способностью досотни или тысячи различных комбинаций факторов, позволяющих анализ эффектов взаимодействия; (2) доступен, автоматизированный визуализации и анализа; (3) интеграция биохимических и биофизических считываниями с контролируемым представлением выстроенных факторов; (4) способность изменять свойства материала подложки; и (5) анализ одноклеточного высокого содержания судьбы и функции клеток.

Таким образом, сочетание клеточных микрочипов с МТФ на подложках жесткости перестраиваемый подложки позволяет тщательно характеристику биохимических и биофизических репликами. Как представлено здесь, эта платформа является обобщенным и может быть легко применен к различным адгезивных типов клеток и контекстов ткани в направлении улучшения понимания комбинаторной регуляции микросреды клеточной дифференцировки и механотрансдукции.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы признаем Остин Cyphersmith и Mayandi Sivaguru (Карл Р. Вёзе Институт геномных биологии, Университет штата Иллинойс в Урбана-Шампейн) за помощью микроскопии и великодушно размещения экрана и захвата видео в ядре микроскопии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. , Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 121 тканевой инженерии биоматериалы биомеханики микросреда клеточные микрочипы стволовые и биологии клеток-предшественников
Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P.,… More

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces. J. Vis. Exp. (121), e55362, doi:10.3791/55362 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter