Summary
Murine studier i modeller av colonic betennelse har vist at en liten prosentandel (1-5%) av mesenchymal stamceller (MSC) injiseres intravenøst eller intraperitoneally hjem til betent kolon1,2. Denne studien viser at ultralyd-guidede intracardiac injeksjoner av MSCs resultere i økt lokalisering til tarmen.
Abstract
Crohns sykdom (CD) er en vanlig kronisk inflammatorisk sykdom av små og store tarmen. Murine og menneskelige stamceller (MSCs) har suppressive potensial og har vist seg å undertrykke betennelse i musen modeller av tarm betennelse, selv om inntaksmetoden kan begrense deres homing og effektiviteten 1 , 3 , 4 , 5. lokal anvendelse av MSCs colonic skade modeller har vist større effekt på ameliorating betennelse i tykktarmen. Men er det mangelen på data om teknikker for å forbedre lokaliseringen av menneskelig bein margtransplantasjon-avledet MSCs (hMSCs) til tynntarm, området av betennelse i SAMP-1/YitFc (SAMP) modell av eksperimentelle Crohns sykdom. Dette verket beskriver en ny teknikk for ultralyd-guidede intracardiac injeksjon av hMSCs i SAMP mus, et godt karakterisert spontan modell av kronisk intestinal inflammasjon. Kjønn og alder-samsvar, betennelse-free AKR/J (AKR) mus ble brukt som kontroller. For å analysere biodistribution og lokaliseringen, ble hMSCs transduced med en lentivirus som inneholder en trippel reporter. Trippel reporteren besto av firefly luciferase (fl), for bioluminescent avbildning; monomerisk rød fluorescerende protein (mrfp), i celle sortering; og avkortede herpes simplex virus thymidine kinase (ttk), fantes et positron utslipp stengte (PET) tenkelig. Resultatene av denne studien viser at 24 timer etter den intracardiac administrasjonen, hMSCs lokalisere i tynntarmen SAMP mus i motsetning til betennelse-free AKR mus. Denne romanen, ultralyd-guidede injeksjon av hMSCs i venstre ventrikkel SAMP mus sikrer en høy suksessrate på cellen levering, slik at for rask utvinning av mus med minimal sykelighet og dødelighet. Denne teknikken kan være en nyttig metode for den forbedrede lokaliseringen av MSCs i andre modeller av små-tarm betennelse, for eksempel TNFΔRE6. Fremtidige studier vil avgjøre hvis den økte lokaliseringen av hMSCs av intra arteriell levering kan føre til økt terapeutiske effekten.
Introduction
Crohns sykdom (CD) er en vanlig kronisk inflammatorisk sykdom av små og store tarmen og er antatt å skyldes en upassende reaksjon av immunsystemet vert intestinal mikrober7,8. Nyere studier har vist at både murine og menneskelige stamceller (MSCs) kan undertrykke betennelse i musen modeller intestinale betennelsen1,3,4,5. Det er flere pågående kliniske forsøk som bruker menneskelige MSCs avledet fra benmarg eller fettvev for å behandle pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), som inkluderer CD9. To ruter for MSC terapi har blitt brukt i disse kliniske forsøk: en innebærer systemisk infusjon (dvs. intravenøst) av MSCs for luminal IBD (inkludert CD), og den andre innebærer lokaliserte søknad/injeksjon av stamceller i fistel skrift av pasienter med perianale CD. I en nylig meta-analyse av MSC terapi for IBD systemisk (dvs. intravenøs) MSC terapi for luminal IBD (inkludert CD) var effektiv i opp til 40% (95% CI: 7-79%) pasienter, mens effekten var mye høyere, 61% (95% CI: 36-85%), når MSCs ble injisert lokalt i syke CD fistel9. En siste fase III multisenter randomisert placebo kontrollerte studie av allogene adipose stamceller injiseres direkte til perianale fistel CD pasienter viste statistisk signifikant klinisk og radiologiske tegn til perianale fistulae healing, bekrefter funnene i meta-analyse10. Årsakene til lav effekten av MSC terapi gitt intravenøst for luminal CD har blitt mangelfullt undersøkt, men en grunn kan være utilstrekkelig homing av MSCs til området av betennelse. Murine studier i modeller av colonic betennelse har vist at bare en liten prosentandel av MSCs (1-5%) injiseres intravenøst når betent tykktarmen; de gjenværende MSCs er filtrert av lungene (første-pass effekt)1,2 ,5,11,12. Flere murine undersøkelser har derfor brukt intraperitoneal ruten (IP) for MSC administrasjon i dyremodeller kolitt4. Men har de også vist at bare en liten brøkdel av cellene nå og engraft kolon og at effekten er knyttet til utskillelsen av løselig paracrine faktorer, som tumor nekrose faktor-induserbart genet 6 protein (TSG-6)2. MSC mekanisme immunsuppresjon og helbredelse innebærer en multipronged tilnærming som innebærer paracrine; cellen nærhet-uavhengige faktorer, som TSG-6; og nærhet-avhengige faktorer, som programmert død-ligand 1 (PD-L1); eller Jagged 1. MSC lokalisering til området av betennelse kan derfor føre til økt effekt9,13. Faktisk viste en fersk studie at MSCs direkte implantert på stedet av colonic skade resulterte i healing av sekresjon angiogenese-fremme vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). På den annen side, ble en minimal helbredende effekt bemerket etter intravenøs injeksjon5. For å øke deres lokalisering til området av betennelse (dvs. tynntarmen i SAMP mus), ble denne ultralyd-guidede intracardiac injeksjon teknikken for MSC administrasjon i venstre ventrikkel utviklet. Bilde-guidede injeksjon sikrer en nøyaktig injeksjon, noe som fører til en høyere rate av suksess og til redusert sykelighet og dødelighet. Videre leverer injeksjon av MSCs i venstre ventrikkel dem til arterial sirkulasjon, der de kan nå betent tynntarmen før bli fanget i lungene.
I denne studien var menneskelige Ben margtransplantasjon-avledet MSCs (hMSCs) brukes for injeksjon i SAMP-1/YitFc (SAMP) murine modellen CD14. SAMP er en godt karakterisert spontan murine modell av kronisk betennelse som utvikler små-tarm betennelse med nesten 100% penetrance14. Betennelse utvikler svar mikroflora i fravær av kjemiske, immunologiske eller genetisk manipulasjon og ligner menneskelige CD11. Kjønn og alder-matchet betennelse-free AKR/J (AKR) mus, foreldrekontroll musene av SAMP, ble brukt i denne studien.
HMSCs ble isolert og utvidet i laboratoriet fra benmargen (BM) prøver innhentet fra normal, uidentifisert givere etter samtykke bruker godkjent og publisert tidligere protokoller15,16. Etter isolasjon og utvidelse, MSC evne i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic differensiering ble vurdert i laboratoriet av flere analyser15. Osteogenic funksjonelle analysen ble utført av implanting keramiske kuber av hydroxyapatite/tricalcium fosfat matrise som inneholder hMSCs subcutaneously i immunsupprimerte CB17-Prkdc-SCID mus17. Cube analysen er viser osteogenesis og chondrogenesis potensielle og den ultimate testen for å vurdere personlige MSC forberedelser17. For å visualisere hMSCs i vivo etter injeksjon, ble lentivirus brukt til å transduce hMSCs med trippel reporter genet konstruere som består av firefly luciferase (fl), monomerisk rød fluorescerende protein (mRFP) og herpes simplex virus thymidine kinase (ttk ), drevet av en modifisert myeloproliferative sarkomspesialitet virus (mnd) promoter18. Firefly luciferase i trippel reporteren er et enzym som konverterer injisert luciferin til oxyluciferin i hMSCs og produserer fotoner/hvitt lys. Dette oppdages av sensitive kostnader - sammen enhet (CCD) kameraet (bioluminescens) i en i vivo optisk tenkelig system, muliggjør visualisering av live hMSCs i mus. Bioluminescens imaging (BLI) er en følsom teknikk som kan brukes serielt for sporing celler og ex vivo analyse. Bruk av en sterk mnd promoter kjører kontinuerlig uttrykk for trippel fusion reporter genet Konstruer og tillater avbilding av injisert hMSCs i mer enn 16 uker19. HMSCs er vanskelig å transduce og har en lav signaltransduksjon effektivitet. Bruker en optimalisert protokollen, hMSCs signaltransduksjon effektiviteten ble forbedret og transgene uttrykket ble forbedret18. Bruker mRFP uttrykk (en av trippel reporter genene) på flowcytometri, ble muligheten til å transduce hMSCs med høy effektivitet på opptil 83% demonstrert. Differensiering analyser og i vivo kube analyser vist evne til den transduced hMSCs å skille ut chondrocytes, adipocytter og osteocytes17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle mus eksperimenter og prosedyrer i studien ble godkjent ved Case Western Reserve University ' s institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Prosedyrene ble gjennomført i foreningen for vurdering og akkreditering av laboratoriet dyr omsorg (AAALAC) akkreditert anlegget. BM var pustende under en University sykehus institusjonelle Review Board-godkjent protokoll på stamcelleforskningen kjernen anlegget ved Case Western Reserve University etter samtykke.
1. kultur og signaltransduksjon av menneskelig bein margtransplantasjon-avledet Mesenchymal stamceller (hMSCs)
Merk: isolering av hMSCs er beskrevet i detalj i tidligere publikasjoner 15 , 20.
- Kultur isolerte hMSCs i Dulbecco ' s endret Eagle middels lav glukose (DMEM-LG) medium med 10% fosterets bovin serum (FBS). Kultur cellene på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO 2 i T175 flasker med 25 mL oppblomstringen medium. Erstatt medium hver 3-4 dager. På dag 14, utføre primære tidens hMSCs.
- Når cellene nå 80% samløpet, fjerne gamle mediet og forsiktig vaske cellene med 5 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS, for 75 cm vev kultur flasker).
- Fjerne PBS fra flasken og Legg 4 mL 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Sted kolbe tilbake i inkubator på 37 ° C i 5-10 min. holde tidspunktet for eksponering så kort som mulig.
- Når fleste cellene har blitt godt avrundet eller har løsrevet fra kultur parabol, stoppe reaksjonen ved å legge til et volum av bovin kalv serum lik halve volumet av trypsin.
- Overføre celle suspensjon til en passende størrelse sentrifuge rør. Sentrifuge cellene på 400 x g i 5 min og deretter forsiktig fjerne nedbryting.
- Resuspend cellene i 5 mL av medium (DMEM-LG + 10% FBS) og telle celler med en hemocytometer.
Merk: På dette punktet, cellene kan subcultured eller transduced med trippel reporter.
- Utføre Albin på hMSCs med trippel reporter.
- Frø 1,5 x 10 6 celler i en T175 kolbe. Kultur cellene i 25 mL av vekstmediet på 37 ° C, 95%, fuktighet og 5% CO 2. Vente 24 timer for cellene knytte.
- Lage en virus cocktail i 15-mL rør, som beskrevet i referanse 18.
- Tin lentivirus på 37 ° C i et badekar. Legge til 160 µL av en 5 mg/mL proteamine sulfat løsning i Dulbecco ' s endret Eagle middels (DMEM) til 8 mL kultur medium (DMEM-LG + 10% FBS) for en siste konsentrasjon 100 µg/ml. Vortex for 3 s. legge et virus mangfold av infeksjon (MOI) 5 (1st tid tint) .
- Fjerner mediet fra celle kultur kolbe (trinn 1.2.1) og legge virus cocktail til cellene. Inkuber 10 h på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO 2.
- Legge 4 mL 100 µg/mL proteamine sulfate i 4 mL av DMEM-LG + 10% FBS og Inkuber for en ekstra 14 h.
- Stoppe signaltransduksjon etter 24 h ved å erstatte med 25 mL av medium (DMEM-LG + 10% FBS).
- Bekreft signaltransduksjon effektivitet ved å evaluere mRFP uttrykk av flyt cytometri 18.
Merk: Her, hMSCs som var transduced med over 65% effektivitet ble brukt. - Utvide cellene ved å erstatte med 25 mL av fersk medium (DMEM-LG + 10% FBS) to ganger i uken. Kultur cellene på 37 ° C, 95%, fuktighet og 5% CO 2. Passasje celler når de når 80% samløpet.
- Når ønsket antall celler er nådd, utføre trypsinization per trinn 1.1.2 - 1.1.4.
- Telle celler og avbryte dem sterile PBS (1 x) i siste konsentrasjonen av 1 x 10 6 celler/75 µL. holde cellene på is transport til ultralyd maskinen. Bruk hMSCs fra passasje tall 2-5 for eksperimenter,.
2. Ultralyd-guidede Intracardiac injeksjon av hMSCs i venstre ventrikkel
Merk: Bruk SAMP1/YitFc med etablerte små-tarm betennelse og alder og kjønn-matchet AKR/J mus for eksperimenter. Opprettholde SAMP og AKR mus ved bestemte patogen uten betingelser, mate dem standard laboratorium chow og holde dem på 12-h lys/mørke sykluser. Her, ble ultralyd-guidede cardiac injeksjoner utført i et dedikert patogen-gratis cardiac ultralyd rom ligger i CWRU dyr forskning anlegget som ble renovert med en desinfiserende og skylles med 70% alkohol. Forskning laboratoriepersonell må ha personlig verneutstyr, inkludert kjoler, ansiktsmasker vernebriller og sterile hansker under intracardiac injeksjoner. Kroppsvarme museklikk må opprettholdes så lenge prosedyren.
- Satt opp av ultralyd imaging system før anesthetizing musen. For denne protokollen, kan du bruke ultralydsmaskin designet for musen ekkokardiogram.
- Slår på strøm og initialisere svingeren (30 MHz) sette opp den nye studien.
- Bedøve musen i en induksjon kammer med 3-4% isoflurane i 100% oksygen med en hastighet på 0,2 - 0,5 L/min. opprettholde dyr for hele prosedyren med 2% isoflurane i 100% oksygen via en nesen kjegle. Bekrefte riktig anesthetization før du utfører bildebehandling ved pinching tå, rulle musen, og observere fravær av bevegelsen.
Merk: Ophthalmica salve bør brukes for øynene etter induksjon av anestesi å hindre hornhinnen tørking. Overføre bedøvet mus til bildebehandling maskiner (dvs. bioluminescens tenkelig system og ultralyd), hvor de vil motta en opprettholdelsen dose av bedøvende isoflurane. Bestemme av bedøvelsen start- og dybden av anestesi ved å observere mangel på reaksjon pinches på halen og fot pad hvert 10 min for hele varigheten av anestesi. - Setter temperaturen på tenkelig tabell og ultralyd gel til 37 ° C.
- Fjerne pelsen over thorax området bedøvet musen bruker hår fjerning krem.
- Plasserer musen på tenkelig bordet i supine posisjon og sikre både øvre og nedre lemmer med teip til unngå kroppens bevegelser under prosedyren. Bruke et elektrokardiogram følge under prosedyren for alle mus.
- Rengjøre huden av thorax området med en 10% povidon/jod vattpinne etterfulgt av en 70% etanol vattpinne. Bruke et tykt lag med gel på området thorax museklikk.
- Montere svingeren i holderen og justere plasseringen til venstre ventrikkel er tydelig på synsfelt.
- Last 150 µL av transduced hMSC celle suspensjon (2 x 10 6 hMSCs i 150 µL av sterile PBS) til en 1-mL sprøyte med en 28-G p og feste sprøyten til riktig abonnenten. For å visualisere pulserende blod, holde kolonnevis lite luft i sprøyten. For å unngå klumper, suspendere cellene før injeksjon.
- Sprøyten mot musen thorax, justere nål banen ved hjelp av ultralyd veiledning og angi venstre ventrikkel.
- Følger veiledning av ultralyd imaging, trenge sprøytenålen gjennom interkostalrom plass og i venstre ventrikkel museklikk.
Merk: Sprøyte pinne-spissen bør være synlig i venstre ventrikkel på ultrasonographic bildet. Riktig plassering må bekreftes av fersk arterial blod utløp i sprøyten. Dette er tegn på en vellykket innsetting. - Injisere hMSC celle suspensjon veldig sakte over 2 min, bruke milde pressure.
- Etter injeksjon av suspendert celler, forsiktig trekke nålen, ren av ultralyd gel, og slipp museknappen fra tape baksetet.
- Sett dyr i en ny, ren bur med en forvarmet pad.
Merk: Etter fullført prosedyren, et varmt miljø bør gis til mus til gjenvinning. Over-oppvarming bør unngås, siden eksterne vasodilatasjon kompromisser utvinning. Mus bør følges nøye og holdes isolert fra andre mus til deres full gjenoppretting, indikert av deres evne til å opprettholde sternal recumbency. - Overvåke dyret før de oppnå fullstendig gjenoppretting av bedøvelsen og daglig til slutten av eksperimentet.
3. Bioluminescens (BLI) avbildning av hMSCs
- bilde musene 24 timer etter intracardiac injeksjon i bioluminesens tenkelig system. Start i vivo bildebehandlingsprogrammer. Initialisere tenkelig systemet og åpne en ny studie.
- i kontrollpanelet Angi parameterne tenkelig ved å klikke " sekvens oppsett. " i tenkelig modus, Velg " luminescence " og " fotografi. " angi eksponering fra 0,5 s 10 min. satt på binning til " middels " og F / Stopp til " 1. " satt eksitasjon filteret til " blokk " og utslipp-filteret for å " åpne. " satt synsvinkelen til " C " for to mus. Legge sekvensen oppsettet til veiviseren for bildet ved å klikke på kontrollpanelet oppkjøpet.
- Bytte på pumpe oksygen og sett isoflurane til 2,5% både induksjon kammeret og nesen kjegle inni maskinen.
- Injisere musen IP med 300 µL av D-Luciferin (12.5 mg/mL).
- Plasserer musen i anestesi induksjon kammeret.
- Etter 2-3 min, overføre musen til den i vivo imaging kammer, med hodet i nesen kjegle på anestesi manifold. Bruke optisk salve for å beskytte øynene under bildebehandling. For å bilde flere mus, bruke svart lys forbløffe for å forhindre refleksjon av lys på tilstøtende mus.
- Klikk på " hente " for å starte bildeopptak 10 min etter D-Luciferin injeksjon.
- Gjenta trinn 3.3-3,5 slik bilde mer mus.
- Etter bildeopptak i vivo euthanize mus ved CO 2 innånding etterfulgt av cervical forvridning, bekrefte død. Utføre ex vivo analysen.
- Hvis ex vivo analysen utføres etter 20 min, gjenta luciferin injeksjon (trinn 3.3) før ofre mus; BLI signalet kan redusere 20 min etter luciferin injeksjon.
- Dissekere mus for å fjerne hele gastrointestinaltraktus (dvs. fra magen til endetarmen), hvem lymfeknute (MLN), lunger, milten og leveren. Plasser dem i petri retter ved hjelp av tang og saks 2 , 4.
- Plasser Petriskål inneholder explanted organer i tenkelig kammeret og hente BLI bilder per trinn 3.1-3.6.
- Etter bilde oppkjøpet, overføre explanted organer til prøven muggsopp som inneholder optimalt kutte temperatur (OCT) sammensatte. Cryofreeze formene på-80 ° C med tørris. Utføre immunohistochemistry ved hjelp av anti-luciferase antistoff på frosne snitt for å påvise hMSCs 16.
- For kvantifisering av lysintensiteten, bruke regionen av interesse (ROI) verktøyet i verktøyet paletten 16 , 19. Velg ROI rammen og flytte den til områder av interesse på bildet. Klikk " Avkastningen måling " og lagre dataene i SEQ-filformat. Eksportere data som en txt-fil og bruke statistisk programvare for å utføre grunnleggende statistiske tester for kvantifisering 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser at hMSCs kan være transduced med trippel reporter på en høy effektivitet, bevare stamcelleforskningen egenskapene. Transduced hMSCs kan visualiseres i sanntid BLI (figur 1 c, Figur 3). Denne romanen, ultralyd-guidede injeksjon av hMSCs i venstre ventrikkel SAMP mus sikrer en meget høy suksessrate på injeksjon, slik at for rask utvinning av mus med minimal sykelighet og dødelighet (figur 2). Gjennomsnittstid for å injisere en mus med hMSCs er ca 10 min, og mindre enn 8-9% sykelighet og dødelighet ble observert med denne teknikken. Hovedgrunnen dødelighet er slag og hjerte tamponade fra hemoragisk perikard effusjon. Ex vivo analysen utført 24 timer etter intracardiac (intra arteriell) administrasjonen av hMSC bekrefter at denne ruten av administrasjonen resultater i homing av hMSCs til betent tynntarmen SAMP mus, i motsetning til betennelse-free kontroll mus (Figur 3 c og D). Videre pleier hMSCs ikke å bo i tynntarmen betennelse-free AKR mus og starte samler eller innestengt i lungene (figur 3B).
Figur 1 . hMSCs kan være Transduced med høy effektivitet I Vivo visualisering og med oppbevaring av stilk celleegenskaper. (A) mikroskopiske bilde av transduced hMSCs. Vellykket Albin på menneskelig MSCs, som bestemmes av mRFP uttrykk vurdert med flowcytometri (B) og BLI (C). Transduced hMSCs beholde stamcelleforskningen egenskaper, som bekreftes av differensiering analyser som demonstrerer evne til transduced hMSCs å skille ut chondrocytes, adipocytter og osteoblasts. For en funksjonell analysen, ble keramiske kuber av hydroxyapatite/tricalcium fosfat matrix implantert subcutaneously hos immunsupprimerte CB17-Prkdc-SCID mus til å demonstrere av hMSCs danner ektopisk donor bein (D). Skalere barer i A = 500 µm. skala stolper i C angir antall BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Skalere barer i D = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Instrumenter for ultralyd-guidede injeksjon. (A) panoramautsikt over instrumenter: hjerte ultralyd imaging system (rød firkant), svinger montert i treffende innehaveren, sprøyte holderen og kirurgisk tabell med nosecone for anestesi (grønne firkanten) og innånding anestesi maskin med induksjon kammer (gul firkant). (B) Ultrasonographic bilde av sprøytenålen: pinne-spissen (rød pil) er klart synlig i venstre ventrikkel (gule piler). (C) frisk arterial blod utløp i sprøyten bekrefter vellykket innsetting av sprøytenålen i venstre ventrikkel før hMSC administrasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . hMSCs Localize til tynntarmen etter Intracardiac/Intra-arterial administrasjon i SAMP mus. Representant bilder av 3-4 mus/gruppe, euthanized 24 timer etter injeksjon og fra tre uavhengige eksperimenter vises. I vivo bioluminescens imaging viser tilstedeværelse av hMSCs i SAMP og AKR mus 24 timer etter injeksjon (A). Ex vivo analyse i SAMP mus viser at hMSCs fortrinnsvis lokalisere til tynntarmen (dvs. området av betennelse) (D), mens de pleier å ikke bo i tynntarmen betennelse-free kontroll AKR mus (C). Faktisk, etter første arteriell passering, hMSCs starte samler mer i lungene til AKR mus, i motsetning til SAMP mus (B). En brøkdel av hMSCs kan også påvises i milten, leveren og lungene SAMP og AKR mus (B, C, D). Skala stolper angir antall BLI (103 fotoner/s/cm2/steradian). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien beskriver en ny teknikk for ultralyd-guidede intracardiac injeksjon av hMSCs i en liten-tarm musemodell av eksperimentelle CD. Denne teknikken har meget høy rate av overlevelse og suksess, som banen nålen kan bli justert basert på sanntid, høyoppløselige bilder av musen venstre ventrikkel, levert av ultralyd. Fordelen med levering til venstre ventrikkel er at hMSCs fordeles deretter intra-arterially og omkjøringsvei venøs sirkulasjon, dermed unngår aggregering av celler i lungene. Tidligere brukte arteria carotis catheterization for intra arteriell levering å injisere MSCs16,21. Carotis catheterization metoden medfører kirurgi for å avsløre arteria carotis for å plassere et kateter i arterien. Kateter er avansert mot aortabuen for overføring av celler. Kateter fjernes senere og arteria carotis samskrevet. Denne teknikken for ultralyd-guidede injeksjon av MSCs i venstre ventrikkel, sammenlignet med carotis communis catheterization, er mindre invasiv, er mye raskere (ca 10 min/mus versus 60 min/mus), og har mindre sykelighet og dødelighet (< 10% versus 30%). Klinisk oversettelsen av musen ultralyd-guidede intracardiac injeksjon av hMSCs til kliniske studier skulle gjennom catheterization av overlegen hvem subclavia (dag utføres for behandling av kronisk hvem iskemi og vanskelige gastrointestinal blødning) å levere hMSCs til syke tynntarmen.
Det er flere hensyn om endringer og feilsøking av ultralyd-guidede intracardiac injeksjon av hMSCs i venstre ventrikkel mus. En viktig del av prosedyren er mestre bruk av ultralyd å lede injeksjon nålen inn i venstre ventrikkel. Som noen prosedyre, riktig trening, praksis og ekspert feedback er viktige komponenter for å kunne utføre denne prosedyren. Dårlig teknikk kan føre til hjerte tamponade fra hemoragisk perikard effusjon og død. For å minimere celle clumping og risikoen for embolisering hjernen (dvs. slag), er det viktig å resuspend hMSCs før hver injeksjon. Før du implementerer denne fremgangsmåten, er det viktig å konsultere veterinær for lokale dyr forskning anlegget å få ekspertråd. Kontroller at retningslinjer for sikker og effektiv bruk av dyr følges for å minimere utilsiktet skade til mus.
For å undersøke biodistribution av hMSCs etter injeksjon i mus, var hMSCs vellykket transduced med trippel reporter, med høy effektivitet. Differensiering analyser utført demonstrert evne til transduced hMSCs å skille ut chondrocytes, adipocytter og osteocytes18. For osteogenic funksjonelle analysen, keramiske kuber av hydroxyapatite/tricalcium fosfat matrix ble implantert subcutaneously hos immunsupprimerte SCID mus og demonstrert evne til hMSCs å danne ektopisk donor bein17,18 . Disse differensiering og funksjonelle analyser viser at transduced hMSCs beholde stamcelleforskningen egenskapene. Resultatene av denne studien viser at transduced hMSCs brukes for intracardiac injeksjon i SAMP mus lokalisere til tynntarm, som er området av betennelse i SAMP mus. I tarm betennelse-free AKR mus, bare et mindretall av hMSCs lokalisert på tarmen 24 timer etter injeksjon, noe som tyder på at i fravær av betennelse, værende hMSCs ikke i tarmen. Disse dataene er i samsvar med flere andre studier som har vist evne til MSCs å migrere og engraft på stedet av skade, som hjertet i akutt hjerteinfarkt22 og den skadde BM i en stråling-skadde beinet16. Som i andre sykdommer, har lokale anvendelsen av MSCs colonic skade modeller vist effekt på ameliorating betennelse23. I en 2,4,6-trinitrobonzene sulfonsyre (TNBS) modell kolitt i rotter akselerert Hayashi et al. injisert BM-avledet MSCs i submucosa av rotte kolon, omkringliggende området utsatt for TNBS, og vist healing kolitt23 .
En fersk studie av Manieri et al. brukte romanen teknikk endoskop-assistert injeksjon av colonic MSCs i distale kolon, stedet for colonic skade, i prostaglandin-mangelfull mus og viste effektivitet i hindrer dannelsen av gjennomtrengende magesår5. SAMP er en modell av små-tarm betennelse, og disse musene utvikle ikke spontan betennelse i tykktarmen deres. Vårt laboratorium er utviklet og godkjent en endoskopisk metode for vurdering og kvantifisering colonic betennelse og tumor utvikling i mus. Endoskopisk enheter er imidlertid ikke kunne nå tynntarmen i en levende mus24. Scoring system kan bare brukes som terminal metode for vurdering av betennelse i SAMP mus etter euthanasia. Derfor er endoskopisk metoden ikke egnet for lokal anvendelse av MSCs i SAMP modellen. Ved hjelp av denne teknikken av injeksjon, kan bedre lokalisering av MSCs til tynntarmen oppnås. Om den økte lokaliseringen å betent tynntarmen vil oversette til økt effekt er ikke kjent, og vil være fokus for fremtidige studier. I tillegg til SAMP modellen, ville ultralyd-guidede injeksjon av MSCs være en nyttig metode for den forbedrede lokaliseringen av hMSCs i andre modeller av små tarm betennelse, som TNFΔRE6 murine modell av eksperimentelle CD.
BLI er en følsom og praktisk teknikk som kan brukes serielt spore hMSCs i vivo, men det tillater ikke for nøyaktig kvantifisering av hMSC homing. Fordelen med å bruke det trippel reporter-transduced hMSCs i mus er at enzymet ttk i trippel reporteren tillater mer kvantitativ fantes et positron utslipp tomografi (PET) imaging19. Kombinere svært kvantitative PET imaging (med en radiotracer sonde) med en beregnet tomografi (CT) scan (gi lokalisering) gir et kvantitativt overslag av antall engrafted hMSCs på syke-området, som gamma teller er proporsjonal med den antall levedyktig hMSCs merket med ttk genet. Nøyaktig kvantifisering av hMSC lokalisering kan bidra til å finne ut prosentandelen av hMSCs homing og terapeutisk effekt og vil være fokus for framtidige studier.
Denne teknikken, til tross for sine mange fordeler, har noen begrensninger: i) behovet for dyre cardiac ultralyd imaging system for mus, ii) dødelighet og sykelighet knyttet intracardiac injeksjon og iii) at du ikke kan brukes i langsom infusjon (dvs.m > over timer) av celler og andre molekyler. Til tross for disse begrensningene har det mange fordeler over gjeldende teknikken av arteria carotis catheterization for intra arteriell injeksjon av hMSCs, som fremhevet ovenfor.
Avslutningsvis viser resultatene av denne studien effektiviteten og bekvemmeligheten av ultralyd-guidede injeksjon teknikken å forbedre lokalisering av hMSCs til området av betennelse i SAMP modell av eksperimentelle CD. Fremtidige studier vil avgjøre hvis det økt homing av hMSCs av intra arteriell levering kan føre til økt terapeutiske effekten i modeller av små-tarm betennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Maneesh Dave støttes av Forsvarsdepartementet grant PR141774 og Crohns og kolitt Foundation of America karriere Development Award. Laboratoriet av Fabio Cominelli støttes av NIH gir DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) og DK07948 (FC). Laboratoriet av Arnold Caplan støttes delvis av L. David og E. Virginia Baldwin Foundation. Virkemiddelapparat ikke hadde noen rolle i studien analyse eller skriving av manuskriptet. Innholdet er ansvar forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) |
References
- Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
- Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
- Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
- Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
- Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
- English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
- Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
- Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
- Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
- Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
- Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
- Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
- Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
- Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
- Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
- Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
- Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843 (2013).
