Summary
Sekventiel salt udvinding af kromatin bundet proteiner er et nyttigt værktøj for fastsættelsen af de bindende egenskaber af store proteinkomplekser. Denne metode kan anvendes til at vurdere individuelle underenheder eller domæner i det samlede affinitet af et proteinkompleks til bulk kromatin rolle.
Abstract
Udredning af de bindende egenskaber af kromatin-targeting proteiner kan være meget udfordrende på grund af den komplekse karakter af kromatin og den heterogene karakter af de fleste pattedyr ændring af kromatin komplekser. For at overvinde disse forhindringer, har vi tilpasset en sekventiel salt udvinding (SSE) analyse for at vurdere de relative bindende tilhørsforhold af kromatin-bundet komplekser. Denne let og ligetil assay kan bruges af ikke-eksperter til at vurdere den relative forskel i bindende affinitet af to relaterede komplekser, ændringer i affinitet af en kompleks, når en subunit er tabt eller et enkelt domæne er inaktiveret og forandring i bindende affinitet efter ændringer i kromatin landskab. Af sekventielt re suspendere bulk kromatin i stigende mængder salt, er vi i stand til at profilere eluering af et bestemt protein fra kromatin. Brug disse profiler, er vi stand til at bestemme, hvordan ændringer i en ændring af kromatin kompleks eller ændringer til kromatin miljøet påvirker bindende interaktioner. Kobling SSE med andre in vitro og i vivo assays, kan vi bestemme enkelte domæner og proteiner på funktionaliteten af et kompleks i en række kromatin miljøer roller.
Introduction
DNA regulering i eukaryote celler er en indviklet og sofistikeret system, som styres stramt af et sortiment af proteiner, der koordinere reaktioner på intracellulære og ekstracellulære stimuli. DNA er svøbt omkring Histon octamers til formen nucleosomes, som kan blive løst fordelt langs DNA eller komprimeret i stramt oprullet1. Denne strukturelle arrangement af DNA og histoner er kendt som kromatin, som er reguleret af et netværk af proteiner, læse, skrive og slette indlæg translationel ændringer (PTM) på histonerne2. Nogle Histon PTMs, såsom acetylation, ændre afgiften af aminosyren de er deponeret på, at ændre interaktioner mellem histonerne og DNA2. Histon PTMs også tjene til at rekruttere transcriptional regulatorer, kromatin remodelers, DNA skader reparation maskiner og DNA replikation maskiner til bestemte regioner i genomet3.
De fleste metoder til at studere kromatin interaktioner enten sonde små interaktioner eller inddrage store genome-wide analyser. In vitro bindende undersøgelser udnytter ofte individuelle rekombinant domæner med Histon peptider eller DNA i assays elektroforese mobilitet Skift assays (EMSA), isotermisk titrering kalorimetri, fluorescens polarisering og peptid pulldowns. Fordi disse assays fokuserer typisk på et domæne med individuelle protein, de lette forståelsen af en lille brik i puslespillet, men tillader ikke os at forstå den kooperative karakter af multi-domæne proteiner, endsige deres rolle i multi protein komplekser. Endnu et lag af indviklet er tilføjet af heterogene sammensætning af de fleste pattedyr ændring af kromatin komplekser. Dette protein heterogenitet, gør i kombination med den dynamiske karakter af kromatin landskab, det udfordrende for at sammenfatte det i vivo bindende interaktioner af kromatin proteiner til kromatin in vitro.
In vivo metoder har gjort betydelige fremskridt; de er imidlertid ofte dyrt, tidskrævende og teknisk udfordrende. Kromatin immunoprecipitation efterfulgt af sekventering (ChIP-FF.) er meget nyttig til at bestemme lokalisering af proteiner og Histon ændringer på tværs af genomet, men det kræver betydelige optimering4. Proteiner er ofte crosslinked til kromatin at bevare interaktioner; men dette kan producere kunstige interaktioner og kan forårsage epitop maskering5. Desuden kræver immunoprecipitations (IP) meget specifikke antistoffer, og omfattende optimering af DNA klipning og IP betingelser af ChIP-qPCR ved hjælp af en kendt bindingssted, som ofte ikke er tilgængelige på forhånd. Efter optimering af ChIP betingelser, behandlingen af prøverne er dyre og kræver flere uger til måneder sekvens og analysere. Selvom denne metode er uvurderlig for at identificere lokalisering af kromatin bundet proteiner på tværs af genomet, omkostninger og tid engagement gør det uoverkommelige at bruge denne metode til at generere hypoteser om, hvordan små ændringer kan påvirke globale bindende egenskaber .
I dette papir beskriver vi, hvordan en sekventiel salt udvinding (SSE) assay kan bruges til at undersøge globale bindende profiler af kromatin-bundet proteiner og skelne, hvordan ændringer i en protein, komplekse, eller globale PTM profil kan ændre interaktioner. Selvom salt ekstraktioner er et almindeligt og bredt anvendte teknik, viser vi, hvordan denne sekventielle metode er meget reproducerbare og alsidig. SSE tillader os at karakterisere, hvordan en enkelt underenhed af en kompleks eller endda et enkelt domæne bidrager til feriekompleksets samlede affinitet for bulk kromatin. SSE kan også bruges til at bestemme, hvis bindingen af et protein, der er påvirket af ændringer i kromatin landskab, giver interessante hypoteser for målretning af Histon mark, der kan bekræftes ved hjælp af ChIP-FF. og andre genom bred undersøgelser.
Vi oprindeligt tilpasset denne metode fra Wu et al., at undersøge om funktionen af Polybromo1 (PBRM1) i bindingen af PBAF kromatin remodeler6,7. Brug af denne teknik, vi bestemt PBRM1 rolle for kromatin bindende inden for den PBAF kromatin remodeling komplekse og derefter bestemmes det relative bidrag fra de seks individuelle bromodomains til denne funktion7.
Her vi beskrive, hvordan du optimerer denne metode for at udforske kromatin binding i forskellige celletyper, at vurdere relative bindingsaffinitet af lignende kromatin ændre komplekser, for at undersøge forskydningen af et protein fra kromatin ved en kemisk hæmmer, og at fastslå virkningerne af kromatin bindende efter ændringer i kromatin landskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. præparater
- forberede 100 mL af hypotonic Buffer A: 0,3 M saccharose, 60 mM KCl, 0,5% og 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, NP-40. Butik på 4 ºC.
Bemærk: Nogle cellelinjer, såsom HEK293T, kræver mindre strenge lysing betingelser. Hvis kerner lyse nemt, bruge modificerede Buffer A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 mM EDTA, 0,1% NP-40, og 10% glycerol. - Udarbejde en 250 mL stamopløsning af 2 x mRIPA løsning: 100 mM Tris pH 8,0, 2% NP-40, og 0,5% natrium deoxycholate.
- Udarbejde en 100 mL stamopløsning af 5 M NaCl.
- Ved hjælp af 2 x mRIPA og 5 M NaCl løsninger, forberede 50 mL af 1 x mRIPA løsning for hver af de seks salt koncentrationer: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM og 500 mM NaCl. Før du starter eksperimentet, cool alle løsninger på ice.
- Grow cellelinjer ønskede betingelser.
Bemærk: Ved fastsættelsen af virkningerne af bankede ned et protein, SSE for linjen knockdown skal sammenlignes med vildtype celler. Disse SSE skal udføres sideløbende. For eksempler på brug af kemiske hæmmere eller stimuli, henvises til afsnit 3-5.
2. Grundlæggende sekventielle Salt udvinding
- høst 8 millioner celler for hver betingelse og vaskes to gange med 5 mL af is kold PBS.
Bemærk: Det er afgørende at have samme antal celler, der har tilsvarende protein koncentrationer. Det nøjagtige antal celler skal være optimeret til enkelte cellelinjer eller særlige proteiner. Det er vigtigt ikke at have for mange, som stigningen i protein fusioner vil forhindre observation af eluering kurve, som er afhængige af ligevægt bindende. Men med for få celler kan der ikke være nok protein til at opdage kurven, og kromatin pellet er sværere at isolere og kan gå tabt mellem fraktioner. - Genopslæmmes celler i 1 mL Buffer A + proteasehæmmere, overføres til 1.5 mL micro centrifugeglas, og Roter top over bunden på 4 ºC i 10 min.
- Isolere kerner ved centrifugering ved 6000 x g i 5 min. ved 4 ºC.
Bemærk: Efter dette trin nukleare konvolutten skal stadig være intakt. Hvis den nukleare kuvert er intakt, vil pellet igen suspendere fuldt; men når konvolutten er mængden og kromatin er frigivet, pellet vil ikke genopslæmmes. Hvis den nukleare kuvert ikke er intakt efter Buffer A inkubation, bruge modificerede Buffer A. - Tilføje 200 µL af mRIPA 0 mM NaCl + protease-hæmmere til hver kerner pellet før re suspendere pellet. Omrystes hver prøve af pipettering 15 gange med 1 mL pipette. Pellet bør genopslæmmes nemt, men kerner vil lyse som det er pipetted og prøven vil blive tyk og klistret og vanskelig at afpipetteres.
- For at udarbejde pelleten ind i spidsen, tryk på slutningen af pipette spidsen mod bunden i centrifugeglasset. Pellet vil ikke fuldt opløses når DNA er frigivet fra kerner, men pipettering vil bryde det op
- Hvornår alle prøverne har været homogeniseret, inkuberes alle prøver på is i 3 min.
Bemærk: Inkubationstiden kan skal optimeres afhængig af protein af interesse. - Isoleres kromatin pellet ved centrifugering prøver for 3 min på 6500 x g på 4 ºC.
- Overførsel supernatanten til en ren 1,5 mL centrifugeres tube. Dette vil være 0 mM brøkdel. Denne 0 mM mRIPA løsning kan fungere som en vask skridt til lysering af kerner og fjerne enhver løs proteiner ikke tilknyttet kromatin.
- Tilføje 200 µL af mRIPA 100 mM NaCl + protease-hæmmere til hver kromatin pellet før re suspendere pellet. Bryde op kromatin pellet ved pipettering pellet op og ned 15 gange.
Bemærk: Det er afgørende at være i overensstemmelse med antallet gange pellet i pipetted. - Incubate på is i 3 min. Trinnet inkubation tillader alle prøver at nå frem til en ligevægt stat, hvilket er særligt vigtigt, når der er flere prøver.
- Centrifugeres ved 6500 x g i 3 min. ved 4 ºC og supernatanten overføres til en ren 1,5 mL tube.
- Gentage 2,6-2,10 de resterende salt koncentrationer.
Bemærk: Efter 400 mM NaCl, mRIPA pellet bør være klar og gloopy og vil ikke bo i bunden af røret. Pellet kan placeres i låget af centrifugeglasset mens supernatanten isoleret. - Tilføje 70 µL af 4 x protein lastning farvestof til hver fraktion og indlæse 30 µL af hver fraktion på en SDS acrylamid gel for western blot analyse.
Bemærk: For at fastlægge bindende profil af protein, det er afgørende at indlæse tilsvarende mængder af lysate i stedet for lastning lig protein koncentrationer. - Udføre en standard vestlige skamplet ved at overføre på en membran og bruge primære antistoffer for proteiner af interesse.
- Til at kvantificere protein elueres fra kromatin, Ruger skamplet i infrarød fluorescens IRDye sekundære antistoffer og billede skamplet med en imager. Mens kan anvendes andre metoder for udvikling, vi anbefaler fluorescens eller Infrarød billeddannelse, fordi det er mere kvantitative karakter.
- Brug ImageJ eller lignende software til at beregne intensiteten for protein elueret på hver saltkoncentration. Af graftegning band intensitet mod den saltkoncentration, eluering mønster af din protein af interesse kan bestemmes.
3. Sekventiel Salt udvinding i en " læser " hæmmer
- høste to sæt af celler (4 millioner) og isolere kerner som i en standard SSE.
- Genopslæmmes begge sæt i 200 µL af mRIPA 0 mM NaCl og der inkuberes i 3 min. Dette vil give mulighed for fjernelse af enhver gratis protein i atomkerner.
- Tilføje 200 µL mRIPA 0 mM NaCl til hver pellet. Tilføje inhibitor (2 µL af 1 mM (+) JQ1) til en prøve og DMSO til kontrol placere.
- Agitere pellet ved pipettering 15 gange og der inkuberes i isbad i 5 min.
- Centrifugeres ved 6500 x g i 3 min. ved 4 ºC og supernatanten overføres til en ren 1,5 mL tube.
- Gentag 3.3-4 for alle de salt koncentrationer og udføre en standard vestlige skamplet.
4. Sekventiel Salt udvinding i en " forfatter " hæmmer
- behandling af celler med inhibitor (10 µM SAHA) eller DMSO for 3 h.
- Høst 4 millioner celler for hver behandling.
- Udføre en standard SSE prøverne med hæmmer tilføjes alle buffere.
5. Sekventiel Salt udvinding følgende DNA skader
- behandling af celler med 1 µM doxorubicin for 1 h.
- Ændre medier på cellerne og tillade dem at genvinde til 3 h.
- Høst 8 millioner celler og udføre den grundlæggende SSE.
6. Ikke-sekventielle Salt udvinding
- høst 12 millioner celler og vask med PBS.
- Kløft celler, så der er 2 millioner celler pr. micro-centrifugerør.
- Genopslæmmes i 500 µL af Buffer A og inkuberes i 10 min.
- Isolere kerner ved centrifugering ved 6000 x g.
- Genopslæmmes pellets i en 200 µL af hver af mRIPA buffere + NaCl.
- Homogeniseres hver prøve af pipettering 15 gange med 1 mL pipette spids.
- Incubate på is i 3 min.
- Isolere kromatin ved centrifugering ved 6500 x g og overføre supernatanten at rengøre rør. Tilføje 70 µL af lastning farvestof og køre 30 µL på en SDS-page gel for western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette papir vise vi de fordele og anvendelser af den almindeligt anvendte sekventielle salt udvinding (SSE) metode, som vi har tilpasset fra litteratur6. I figur 1sammenligner vi reproducerbarhed af SSE at udvinde proteiner, ikke-sekventielt ved at afsløre eluering mønstrene af ARID1a og PBRM1. Vi observerer konsekvent at ARID1a, en BAF subunit, eluerer primært på 200 mM NaCl og PBRM1, en eksklusiv PBAF subunit, eluerer primært på 300 mM NaCl. Figur 1a viser tre uafhængige replikater af SSE med 8 millioner OVCA429 celler. Figur 1b viser en ikke-sekventielle salt udvinding hvor kerner isoleret fra 2 millioner celler blev igen suspenderet i en enkelt salt buffer. Selvom begge metoder konkludere at ARID1a eluerer på 200 mM og PBRM1 eluerer på 300 mM, SSE producerer en veldefineret bindende profil og giver mulighed for en klar skelnen af bindingen af disse to komplekser. Desuden i den ikke-sekventielle metode, mængden af protein elueret i 400 mM og 500 mM NaCl buffere er lavere end 300 mM og er ikke konsistent mellem de tre replikater. Selvom dette problem kan løses med yderligere optimering af inkubation tid og centrifugering hastighed, illustrerer dette reproducerbarhed fordel af SSE.
Gennem vores optimering fandt vi, at andre kromatin komplekser kan kræve mere tid til at være elueret. I figur 2viser vi, at transcriptional aktivator, PBAF, eluerer fra kromatin konsekvent mellem SSEs med 3 min. og 10 min. inkuberingstider. Derimod kræver eluering af det transkriptionel repressor, Polycomb Repressive komplekse 1 (PRC1), anført af BMI-1, en længere inkubationstiden frigivet fra kromatin8. Dette fænomen kunne være på grund af PRC1 er lokaliseret i mere kompakt og utilgængelige områder af genomet, eller kunne være på grund af differential bindende kinetik for de to komplekser.
Efter optimering for et bestemt protein, kan SSEs bruges til at studere, hvordan styrken af protein bindende ændringer i forskellige forudsætninger. SSE kan bruges til at undersøge effektiviteten af en hæmmer af protein-protein interaktioner. For at demonstrere dette koncept, udnyttet vi (+) JQ1, som er en BRD4 bromodomain hæmmer, til at undersøge, hvordan det ændret BRD4 bindende (figur 3a)9. Vi isoleret kerner fra 4 millioner OVCA429 celler. Hvis du vil fjerne enhver ubundne BRD4, blev en indledende 0 mM vask udført på begge prøver. Derefter en standard SSE blev udført med DMSO eller 1 µM (+) JQ1 tilføjes til hver fraktion. Prøverne blev inkuberet i 5 min. Vi observerer, at BRD4 eluerer tidligere i nærværelse af den hæmmer sammenlignet med DMSO. For at vise, at (+) JQ1 er specifikke for BRD4, vi renset for ARID1a og så ingen forandring i eluering (figur 3b).
Næste vi undersøgt, hvordan protein binding kan være ændret når landskabet af kromatin er ændret. BRD4 indeholder to bromodomains, der anerkender acetyleret lysin rester på Histon haler10. For at øge niveauet af Histon acetylation, vi behandlede OVCA429 celler med 10 µM af Histon deacetylase hæmmer suberanilohydroxamic syre (SAHA) for 3 h. SAHA (10 µM) blev føjet til alle bufferne under SSE. Ved at øge de globale Histon acetylation niveauer, observeret vi en stigning i BRD4 bindende (figur 4a). Når blotting for ARID1a, observerer vi strammere binding af ARID1a samt, hvilke er ikke overraskende, fordi underenheder af BAF komplekse, såsom BRG1, BRM og BRD9, indeholder alle bromodomains10,11 (figur 4b).
Endelig, for at udstille, hvordan SSE kan bruges til at se på hvordan protein bindende ændres når celler opleve genomisk ændringer, vi induceret dobbelt strandede DNA pauser med topoisomerase II inhibitor, doxorubicin12. Vi behandlede HEK293T celler med 1 µM af doxorubicin for en time og tilladt celler til at inddrive i tre timer. Efter udførelse af SSE, renset vi for PBRM1, som er involveret i DNA skader reparation13. Vi observerede to toppe for PBRM1 binding: en på 300 mM og en 500 mm NaCl (figur 5). Dette tyder på, at nogle af PBRM1 befolkningen bindende normalt, men et undersæt af PBRM1 er mere stramt bundet til kromatin efter DNA-skader. Dette er blot ét eksempel på hvordan SSE til at undersøge, hvordan kromatin interaktioner er ændret i respons på forskellige eksterne stimuli.
Figur 1: Ikke-sekventielle sammenlignet med sekventiel salt ekstraktioner i OVCA429 celler
A) Immunoblots og kvantificering af tre uafhængige gentagelser af ARID1a og PBRM1 eluering profiler af den sekventielle salt ekstraktion metode. B) Immunoblots og kvantificering af tre uafhængige gentagelser af ARID1a og PBRM1 eluering profiler i metoden ikke-sekventielle salt udvinding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning af inkuberingstider af PBAF og PRC1 eluering profiler
A) sammenligning af PBAF (PBRM1) eluering profiler med 3 og 10 minutters inkubation times. B) sammenligning af PRC1 (BMI-1) eluering profiler med 3 og 10 minutters inkubation times. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effektiviteten af (+) JQ1 på hæmme BRD4 bindende
A) eluering mønster af BRD4 i nærværelse af 1 µM (+) JQ1 i forhold til DMSO kontrol i OVCA429 celler. B) eluering profil af ARID1a i nærværelse af 1 µM (+) JQ1 i forhold til DMSO kontrol i OVCA429 celler. Bandet intensitet er indiceret til 0 mM - 500 mM brøkdel med DMSO eller (+) JQ1. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ændringer i bindende når kromatin anlagte er ændret
A) sammenligning af BRD4 eluering fra OVCA429 celler behandles med 10 µM SAHA i 3 timer i forhold til DMSO behandling. B) eluering profiler af ARID1a fra OVCA429 celler behandles with10 µM SAHA sammenlignet med DMSO. Bandet intensitet er indiceret til 0 mM - 500 mM brøkdel med DMSO eller SAHA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Ændringer i PBRM1 bindende efter DNA-skader
SSE resultater for PBRM1 bindende fra HEK293T celler behandles med 1 µM Doxorubicin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering af protein og kromatin interaktioner gennem salt ekstraktioner er en fælles metode, der har været ansat i årtier14,15; men det er ikke blevet systematisk optimeret før for at afsløre sin fulde nytte. Vi demonstrere, hvordan denne sekventielle metode giver en hurtig og billig måde at skelne mellem ændringer i kromatin bindende, når proteinet eller miljøet er ændret. SSE er yderst fleksibel og kan optimeres, og vigtigst, det er teknisk simpelt og kræver ingen specialiseret udstyr. De vigtigste aspekter, der skal optimeres før igangsættelse er: Start celle nummer, hypotonic buffer betingelser og inkubationstiden.
Det vigtigste aspekt af celle nummer er, at det er konsekvent mellem alle prøverne. Når man ser på BAF komplekser, giver ved hjælp af 8 millioner celler en god profil af hvordan disse komplekser er bindende; dog skal antallet celler (eller mængden af buffer) muligvis justeres afhængigt af overfloden af protein af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at ved hjælp af færre celler udfordrende fordi på 400 mM og 500 mM NaCl er det svært at visualisere kromatin pellet. Det er afgørende for at sikre pelleten ikke overføres med supernatanten efter 400 mM NaCl.
Præcist vurdere nukleare proteiner, skal kerner forblive intakt, indtil de er mængden med 0 mM NaCl mRipa løsning. Mange almindeligt anvendte hypotonic løsninger er for barsk for cellelinjer såsom HEK293T og HeLa celler. Disse cellelinjer anbefales det at bruge den ændrede Buffer A.
Endelig, at inkubationstiden kan variere afhængigt af eksperimentet. For BAF underenheder ændrer eluering mønster ikke mellem en 3 min og 10 min inkubation; dog ændrer eluering af PRC1 komplekset drastisk sig alt efter hvor længe prøverne inkuberes. Derudover ved evaluering af effekten af en inhibitor på bindingen af sit mål, kan inkubationstiden skal optimeres afhængigt af inhibitor kinetik.
Når du udfører eksperimentet, er det vigtigt at være så konsekvent som muligt med behandling af prøverne. For hver fraktion, skal salt bufferen tilføjes hver prøve inden homogenisering således at hver prøve er lige så udsatte. Punktet af pipettering er at bryde op kromatin og hjælp udgivelsen de bundne proteiner. Det er vigtigt at sørge for pelleten passerer gennem pipette tip. Især når du bruger et større antal celler, er kromatin pellet udfordrende at passere gennem pipette tip de første par gange. Vi har fundet, at en 1 mL tip virker bedst til dette, som med mindre trykke spids mod bunden af micro-centrifugerør, vi er i stand til at udarbejde pelleten ind i spidsen. Efter at have passeret kromatin pellet gennem spidsen femten gange, bør pellet glat flytte gennem aflæsse, selv om det ikke vil opløse. Efter inkubering prøver på is og isolere kromatin ved centrifugering, tillader fjernelse af supernatanten med en 200 µL pipette tip for maksimal fjernelse uden at forstyrre kromatin pellet.
Selvom SSE kræver teknisk sammenhæng, det er simpelt, ligetil, og kan udføres med fælles laboratorium ressourcer. Det er vigtigt at bemærke, at den sande effekt af denne metode er, når det kobles sammen med andre phenotypical undersøgelser. For eksempel, bruger denne teknik, vi sammenlignede bindende profiler af PBRM1, når hver af sine seks bromodomains var muteret, vi har besluttet, at alle, men en af bromodomains var involveret i bindingen af PBRM1 til varierende grader7. Intriguingly, fandt vi, at de bromodomains, der var det vigtigste for bindende også var afgørende for PBRM1 regulering af genekspression og kontrol celle spredning7. Vi også godkendt ændringer i bindingen af disse mutanter til en diskret genomisk locus af kvantitative ChIP-qPCR7.
Vi har vist kun et par eksempler på hvordan denne teknik kan bruges til at undersøge protein-kromatin interaktioner; men i vores laboratorium, vi har fundet, at SSE er et alsidigt værktøj til at undersøge en bred vifte af spørgsmål vedrørende kromatin læseren proteiner. I kombination med andre analyser, denne teknik letter vores evne belyse funktionaliteten af de komponenter, der omfatter disse udarbejde proteinkomplekser. Ved at forstå betydningen af individuelle domæner, kan vi identificere uanset om de er potentielle terapeutiske mål for udviklingen af en inhibitor, der blokerer kromatin association.
Vi har demonstreret, hvordan SSE kan udvides til at vurdere effektiviteten af en lille molekyle hæmmer på protein binding til kromatin. Derudover ved at hæmme epigenetiske forfattere og viskelædere, kan SSE bestemme forholdet mellem PTM niveauer og læser proteiner. Vi har også vist SSE kan bruges til at bestemme forandringer i bindende svar på eksterne stimuli som DNA-skader. Selv om dette er en simpel teknik, når de anvendes i de rette betingelser, kan det stærkt fremme vores viden om kromatin og dets lovgivningsmæssige proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en V scholar award (V2014-004) og et V scholar plus award (D2016-030) fra V instituttet for kræftforskning, og en American Cancer Society institutionelle forskning tilskud (ACS IRG Grant 58-006-53) at Purdue University Center for kræft Forskning. E. G. P. blev støttet af Borch Graduate Endowment Award til Purdue Universitet medicinalkemi og molekylær farmakologi afdeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
