Summary
הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.
Abstract
הבהרה של מאפייני האיגוד של פילוח כרומטין חלבונים יכולה להיות מאוד מאתגרת בשל האופי המורכב של כרומטין ואת הטבע הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. על מנת להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו הסתגלו assay הפקת מלח רציפים (SSE) להערכת את הזיקות איגוד היחסי של מתחמי מאוגד-כרומטין. זה קל ופשוט assay יכול לשמש על ידי שאינם מומחים כדי להעריך את ההפרש היחסי מחייבים זיקה של שני מתחמי קשורים, השינויים זיקה קומפלקס יחידת משנה אובד או תחום הפרט הוא מומת בשינוי זיקה מחייבת לאחר שינויים לנוף כרומטין. על ידי ברצף מחדש השעיית בצובר כרומטין להגדיל את כמויות מלח, אנחנו יכולים לעשות פרופיל • את תנאי של חלבון מסוים של כרומטין. באמצעות פרופילים אלה, אנו מסוגלים לקבוע כמה שינויים במתחם שינוי כרומטין או שינויים לסביבה כרומטין להשפיע על אינטראקציות מחייב. צימוד SSE עם אחרים מבחני חוץ גופית בתוך וויוו , אנו יכולים לקבוע את התפקידים של תחומים נפרדים, חלבונים על הפונקציונליות של תסביך במגוון סביבות כרומטין.
Introduction
תקנה DNA תאי האיקריוטים היא מערכת מורכב ומתוחכם מפוקחת על ידי מגוון של חלבונים לתאם תגובות לגירויים תאיים, חוץ-תאית. הדנ א הוא כרוך סביב היסטון octamers כדי נוקליאוזומים טופס, שניתן באופן רופף מפוזרים לאורך הדנ א או נדחס לתוך סלילי חזק1. ההסדר המבני הזה של ה-DNA, שינויים היסטוניים המכונה כרומטין, אשר מווסת על ידי רשת של חלבונים לקרוא, לכתוב או למחוק שינויים translational פוסט (PTM) על שינויים היסטוניים2. כמה היסטון PTMs, כגון acetylation, לשנות את המטען של חומצת אמינו ביותר הם מופקדים על, שינוי אינטראקציות בין שינויים היסטוניים דנ א2. היסטון PTMs משמשים גם כדי לגייס הרגולטורים תעתיק, remodelers כרומטין, DNA נזק תיקון מכונות, מכונות שכפול ה-DNA אזורים ספציפיים של גנום3.
רוב שיטות לימוד אינטראקציות כרומטין או בדיקה אינטראקציות בקנה מידה קטן או לערב גדול ניתוחים הגנום כולו. במבחנה מחייב לימודי לנצל לעתים קרובות תחומים רקומביננטי בודדים עם פפטידים היסטון. או דנ א במבחני כגון מבחני shift ניידות אלקטרופורזה (EMSA), calorimetry איזותרמי טיטור, קרינה פלואורסצנטית קיטוב פפטיד pulldowns. כי אלה מבחני להתמקד בדרך כלל תחום חלבונים בודדים, הם להקל על ההבנה של חתיכה קטנה של הפאזל, אך אינם מאפשרים לנו להבין את טבעם קואופרטיב של תחום מרובת חלבונים, שלא לדבר על התפקיד שלהם חלבון רב מתחמי. שכבה נוספת של במאוד נוסף של הקומפוזיציה הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. הטרוגניות חלבון זה, בשילוב עם אופי הדינמי של הנוף כרומטין, הופך אותו מאתגר כדי לסכם את ויוו איגוד אינטראקציות של חלבונים כרומטין כרומטין בתוך חוץ גופית.
שיטות in vivo עשו התקדמות משמעותית; עם זאת, לעתים קרובות הם יקרים, זמן רב, ומאתגר טכנית. Immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף (צ'יפ-seq) הוא מאוד שימושי לקביעת הלוקליזציה של חלבונים ושינויים היסטון ברחבי הגנום, אולם זה דורש אופטימיזציה ניכר4. חלבונים הם לעיתים קרובות תפור כדי כרומטין כדי לשמר את האינטראקציות; עם זאת, זה יכול לייצר אינטראקציות מלאכותי, עלול לגרום epitope מיסוך5. יתר על כן, immunoprecipitations (IP) דורשים נוגדנים ספציפיים מאוד, ואופטימיזציה נרחב של ה-DNA הטיה ומצבים IP על ידי שבב-qPCR שימוש באתר איגוד ידוע, אשר לעתים קרובות אינם זמינים א-פריורי. לאחר אופטימיזציה של שבב תנאים, עיבוד הדגימות יקר ודורש מספר שבועות עד חודשים רצף ולנתח. על פי שיטה זו היא שלא יסולא בפז לזיהוי הלוקליזציה של כרומטין מאוגד חלבונים ברחבי הגנום, העלות ושזה זמן מחויבות אסורה לשימוש בשיטה זו ליצירת היפותזות על מה שינויים קטנים עלול להשפיע על מאפייני האיגוד העולמי .
בנייר זה, אנו מתארים איך וזמינותו הפקת מלח רציפים (SSE) יכול לשמש כדי לבחון פרופילים האיגוד העולמי של חלבוני כרומטין מכורך ולהבחין איך שינויים בפרופיל חלבון, מורכבים, או גלובלי PTM יכול לשנות אינטראקציות. למרות עקירות מלח הם טכניקה בשימוש נפוץ, בהרחבה, נדגים כיצד רציפים בשיטה זו הוא מאוד תכליתי הדירים. SSE מאפשר לנו לאפיין כמה יחידת משנה יחיד של מתחם או אפילו מחשבים בודדת תורמת אהדה גורפת כרומטין הכולל של המתחם. SSE יכול לשמש גם כדי לקבוע אם הכריכה של חלבון מושפע משינויים בנוף כרומטין, מתן השערות מעניין עבור מיקוד מארק היסטון זה יכול להיות מאושרות באמצעות שבב-seq ומחקרים רחב נוספים הגנום.
במקור התאמנו בשיטה זו מ וו ואח ', לבחון את הפונקציה של Polybromo1 (PBRM1) באיגוד של6,7פורטל כרומטין PBAF. בעזרת טכניקה זו, אנחנו נקבע את התפקיד של PBRM1 עבור איגוד כרומטין בתוך כרומטין PBAF שיפוץ מורכב, ואז קבעו את התרומה היחסית של שישה bromodomains בודדים זו פונקציה7.
כאן נתאר כיצד לייעל בשיטה זו כדי לחקור את איגוד כרומטין סוגי תאים שונים, כדי להעריך את זיקה מחייבת היחסי של כרומטין דומה שינוי מכלולי כדי לבחון העקירה של חלבון מכרומטין על ידי מעכב כימי, ו כדי לקבוע את ההשפעות של כרומטין מחייב לאחר שינויים לנוף כרומטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ההכנות
- להכין 100 מ"ל של פתרון היפוטוניק מאגר ת 0.3 M סוכרוז, 60 מ מ אשלגן כלורי, 60 מ מ טריס pH 8.0, 2 מ מ EDTA, ו- 0.5% NP-40. החנות 4 ºC.
הערה: כמה שורות תאים, כגון HEK293T, לדרוש תנאים מחמירים פחות lysing. אם גרעינים lyse בקלות, השתמש שונה מאגר ת 25 מ מ HEPES pH 7.6, 25 מ מ של אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl 2, מ מ 0.05 EDTA, גליצרול NP-40, ו- 10% 0.1%- - להכין פתרון מניות 250 מ של פתרון x mRIPA 2: 100 מ מ טריס pH 8.0, 2% NP-40 0.5% נתרן deoxycholate.
- להכין פתרון מניות 100 מ של 5 M NaCl.
- שימוש x mRIPA 2 ו- 5 מ' NaCl פתרונות, להכין 50 מ של 1 x mRIPA פתרון עבור כל אחד ריכוזי מלח 6: 0 מ מ 100 מ מ, מ מ 200, 300 מ מ, 400 מ, 500 מ מ NaCl. לפני תחילת הניסוי, מגניב כל הפתרונות על קרח
- לגדול תא קווים בתנאים הרצויים.
הערה: בעת החלטה על ההשפעות של הורסים חלבון, SSE עבור שורת תמונות ציפורים יש להשוות לתאים wildtype. אלה SSE יש לבצע על הצד. לקבלת דוגמאות בעזרת מעכבי כימי או גירויים, פנה לסעיפים 3-5-
2. הפקת מלח רציפים בסיסי
- הקציר 8 מיליון תאים של כל תנאי ולשטוף פעמיים עם 5 מ של PBS קר קרח.
הערה: זה חשוב וקריטי. שיהיה מספר שווה של תאים יש ריכוז החלבון המקביל. המספר המדויק של תאים, ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים בודדים או חלבונים מסוימים. זה חשוב שלא יהיו רבים מדי, כמו עליית ריכוז חלבון תמנע התצפית של העקומה • תנאי, אשר תלויה מחייב שיווי משקל. עם זאת, עם תאים מעט מדי אולי לא יהיה מספיק חלבונים כדי לזהות את העקומה, בגדר כרומטין קשה לבודד, עלול ללכת לאיבוד בין שברים. - מושהה מחדש תאים 1 מ"ל של מאגר A + מעכבי פרוטאז, להעביר לתוך צינורות צנטריפוגה מיקרו 1.5 mL, ו- top סיבוב מעל תחתית ב 4 ºC במשך 10 דקות
- לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 6000 x g למשך 5 דקות ב- 4 ºC.
הערה: לאחר שלב זה מעטפת הגרעין עדיין אמורים להישאר שלמים. אם המעטפה גרעיני שלם, בגדר מחדש נשעה באופן מלא; עם זאת, כאשר המעטפה הוא lysed כרומטין הוא שוחרר, בגדר לא מחדש נשעה. אם המעטפה גרעיני אינו שלם לאחר דגירה מאגר A, השתמש שונה מאגר א
מעכבי - להוסיף 200 µL mRIPA 0 מ"מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה גרעינים לפני מחדש השעיית גלולה. Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם פיפטה 1 מ"ל. בגדר מחדש צריכים להשעות בקלות, לעומת זאת, הגרעינים lyse זה הוא pipetted, המדגם יהפוך סמיך, דביק וקשה פיפטה.
- על מנת להכין את צניפה לתוך הקצה, הקש על הסוף של קצה פיפטה בתחתית הצינורית צנטריפוגה. בגדר לא יימס לחלוטין ברגע ה-DNA הוא שוחרר מן האטומים, אך pipetting ישבור למעלה
- כאשר כל הדגימות יש כבר הומוגני, דגירה כל הדגימות על קרח דק 3
הערה: זמן הדגירה ייתכן שיהיה צורך ניתן למטב בהתאם החלבון עניין. - צנפה כרומטין ולבודד על ידי צריך שתוציאו את הדגימות למשך 3 דקות ב 6500 g x-4 ºC. צינור
- תגובת שיקוע העברה כדי צנטריפוגה mL 1.5 נקי. זה יהיה השבר 0 מ מ. הפתרון mRIPA 0 מ מ יכול לשמש צעד שטיפת פירוק הגרעינים ולהסיר כל החלבונים רופף לא משויך כרומטין. מעכבי
- להוסיף 200 µL mRIPA 100 מ מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה כרומטין לפני מחדש השעיית גלולה. להיפרד בגדר כרומטין מאת pipetting בגדר לאורך 15 פעמים.
הערה: זה קריטי להיות עקבי עם מספר פעמים בגדר ב pipetted. - Incubate על קרח למשך 3 דקות. שלב הדגירה זה מאפשר כל דוגמאות להגיע למצב של שיווי משקל, אשר חשוב במיוחד, כאשר ישנם מספר דגימות.
- צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-
- חזור על 2.6-2.10 ריכוז מלח שנותרו.
הערה: לאחר 400 מ NaCl, mRIPA בגדר צריך להיות ברור, ואילו, לא יישאר בתחתית הצינורית. ניתן למקם את צניפה במכסה של הצינור צנטריפוגה בזמן תגובת שיקוע מבודד. - 70 להוסיף µL של 4 x חלבון הטעינה לצבוע את כל השבר ולטעון 30 µL של כל שבר על ג'ל אקרילאמיד מרחביות לניתוח תספיג.
הערה: כדי לקבוע את פרופיל איגוד של החלבון, זה קריטי כדי לטעון כרכים המקבילה של חלבון שווה lysate, במקום טעינת ריכוזים. - לבצע תספיג רגיל על ידי העברת על גבי קרום ולהשתמש נוגדנים העיקרי חלבונים עניין.
- כדי quantitate החלבון eluted מ כרומטין, דגירה את האבן החשופה של זריחה אינפרא-אדום IRDye נוגדנים משניים, חשופה תמונה עם imager. אמנם ניתן להשתמש בשיטות אחרות של פיתוח, אנו ממליצים זריחה או הדמיית אינפרה-אדום, כפי שהוא יותר כמותיים בטבע.
- שימוש ImageJ או תוכנה דומה כדי לחשב את העוצמה של החלבון eluted-כל ריכוז המלחים. על ידי יצירת גרפים עוצמת הלהקה נגד ריכוזי המלח, התבנית • תנאי את החלבון עניין יכול להיקבע.
3. הפקת מלח רציפים רכוש " קורא " מעכב
- הקציר שתי קבוצות של תאים (4 מיליון) ובידוד הגרעינים כמו SSE רגיל.
- מחדש להשעות שתי קבוצות ב- 200 µL של mRIPA 0 מ"מ NaCl, תקופת דגירה של 3 דקות. זה יאפשר להסרת כל חלבון ללא הגרעינים.
- MRIPA µL להוסיף 200 0 מ"מ NaCl עד כל גלולה. להוסיף את המדכא (2 µL של 1 מ מ (+) JQ1) אחד מדגם של דימתיל סולפוקסיד לקבוצת הבקרה.
- על ידי pipetting 15 פעמים ואז וולדהיין חזר בגדר דגירה על קרח במשך 5 דק.
- צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-
- חזור על 3.3-4 עבור כל ריכוז מלח ולבצע תספיג סטנדרטי של.
4. הפקת מלח רציפים רכוש " סופר " מעכב
- יטפל בתאים עם החומר המדכא (10 מיקרומטר סאהה) או דימתיל סולפוקסיד עבור ה 3
- הקציר 4 מיליון תאים עבור כל טיפול.
- לבצע SSE סטנדרטי של הדגימות עם החומר המדכא נוספו כל המאגרים.
5. רציפים מלח החילוץ הבאים נזק לדנ א
- יטפל בתאים עם דוקסורוביצין 1 מיקרומטר עבור ה 1
- לשנות את התקשורת על התאים ולאפשר להם להתאושש במשך ה 3
- הקציר 8 מיליון תאים ולבצע בסיסית דר.
6. הפקת מלח שאינם רציפים
- הקציר 12 מיליון תאים ולשטוף עם PBS.
- חלוקת תאים כך שיהיו 2 מיליון תאים למחזור צנטריפוגה מיקרו-
- להשעות מחדש ב- 500 µL מאגר A ואת תקופת דגירה של 10 דקות
- לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה-6000 x ג
- מחדש להשעות. גללים ב µL 200 של כל מאגרי mRIPA + NaCl.
- Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם טיפ פיפטה 1 מ"ל.
- Incubate על קרח דק 3
- לבודד את כרומטין על ידי צנטריפוגה ב 6500 x g ולהעביר את תגובת שיקוע לנקות צינורות. להוסיף µL 70 של טעינת לצבוע ולהפעיל 30 µL ג'ל מרחביות-דף לניתוח תספיג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בנייר זה, נדגים את היתרונות והיישומים של השיטה הנפוצה הפקת מלח רציפים (SSE) יש שינינו ספרות6. איור 1, נוכל להשוות את הפארמצבטית של SSE חילוץ חלבונים שאינם ברצף על ידי גילוי דפוסי • תנאי ARID1a ו- PBRM1. אנו מבחינים באופן עקבי כי ARID1a, יחידת משנה BAF, elutes בעיקר ב-200 מ"מ NaCl ו- PBRM1, יחידת משנה בלעדי PBAF, elutes בעיקר ב 300 מ"מ NaCl. איור 1a מציג משכפל עצמאית שלושה של SSE עם 8 מיליון תאים OVCA429. איור 1b מתאר של הפקת מלח רציפים איפה הגרעינים מבודד 2 מיליון תאים היו מחדש על תנאי במאגר מלח בודד. למרות שתי השיטות להסיק כי ARID1a elutes-200 מ"מ, PBRM1 elutes-300 מ"מ, מז מייצרת פרופיל איגוד מוגדרים היטב ומאפשר הבחנה ברורה של הכריכה של שתי מערכות אלה. יתר על כן, בשיטה רציפים, כמות החלבונים eluted במאגרי NaCl מ מ 400, 500 מ מ נמוך יותר 300 מ"מ ואינה עולה בקנה אחד בין שלושה משכפל. אם כי ייתכן שהבעיה נפתרה עם נוספים מיטוב של מהירות צנטריפוגה וזמן הדגירה, זה מדגים את היתרון הפארמצבטית SSE.
באמצעות קידום אתרים שלנו, מצאנו כי מכלולי כרומטין אחרים עשויים לדרוש עוד זמן כדי להיות eluted. איור 2, נדגים activator תעתיק, PBAF, elutes מכרומטין בעקביות בין SSEs עם 3 דקות ו 10 דקות פעמים הדגירה. לעומת זאת, • תנאי של מדכא. תעתיק שבולם, Polycomb 1 מורכבות נוקשים (PRC1), המצוין על-ידי ה-BMI-1, דורש זמן דגירה ארוך יותר להשתחרר כרומטין8. תופעה זו יכולה להיות עקב PRC1 להיות מותאם יותר קומפקטי בלתי נגיש אזורים בגנום, או יכול להיות בגלל הכריכה דיפרנציאלית קינטיקה עבור שני מתחמי.
לאחר אופטימיזציה עבור חלבון מסוים, SSEs ניתן ללמוד כיצד הכוח של חלבון מחייב שינויים בתנאים שונים. SSE ניתן לבחון את האפקטיביות של מעכב של אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להדגים רעיון זה, אנחנו מנוצל (+) JQ1, שהוא מעכב bromodomain BRD4, כדי לבחון איך זה שונה BRD4 מחייב (איור 3 א)9. אנחנו מבודדים גרעינים מתאי OVCA429 4 מיליון. כדי להסיר את כל BRD4 לא מאוגד, ושטוף מ מ 0 הראשונית בוצעה על שתי דגימות. אז תקן ש-SSE בוצעה עם דימתיל סולפוקסיד או 1 מיקרומטר (+) JQ1 נוסף כל שבר. הדגימות היו הדגירה למשך 5 דקות. אנו מבחינים כי BRD4 elutes מוקדם יותר בנוכחות החומר המדכא בהשוואה דימתיל סולפוקסיד. כדי להציג שאת (+) JQ1 הוא ספציפי BRD4, מחק עבור ARID1a וראיתי שינוי. • תנאי (איור 3b).
הבא שבדקנו כמה חלבון מחייב יכולים להשתנות כאשר הנוף של כרומטין משתנה. BRD4 מכיל שני bromodomains מזהה ליזין acetylated שאריות היסטון זנבות10. כדי להגדיל את רמת acetylation היסטון, התייחסנו תאים OVCA429 עם 10 מיקרומטר מהל היסטון deacetylase מעכב suberanilohydroxamic (סאהה) עבור 3 ח' סאהה (10 מיקרומטר) נוספו כל המאגרים במהלך מז. על ידי הגדלת רמות acetylation היסטון גלובלית, הבחנו עלייה BRD4 מחייב (איור 4a). כאשר סופג עבור ARID1a, נתבונן קשירה הדוקה יותר של ARID1a, וזה לא מפתיע כי subunits של BAF מורכבים, כגון BRG1, ברמ BRD9, כולם מכילים bromodomains10,11 (איור 4b).
לבסוף, שהפגינו כיצד ניתן להשתמש SSE להסתכל על מה חלבון מחייב שינויים כאשר התאים חווים שינויים גנומית, אנחנו המושרה זוגי מעברי DNA תקועים עם החומר המדכא טופואיזומראז II, דוקסורוביצין12. אנחנו מטופלים תאים HEK293T עם 1 מיקרומטר של דוקסורוביצין לשעה ולא התאים להתאושש במשך שלוש שעות. לאחר ביצוע מז, אנחנו מחק עבור PBRM1, אשר מעורב DNA נזק תיקון13. ראינו שתי הפסגות עבור איגוד PBRM1: אחת 300 מ"מ, אחת 500 מ מ NaCl (איור 5). הדבר מצביע על כי חלק מן האוכלוסייה PBRM1 מחייב בדרך כלל, אך תת-קבוצה של PBRM1 קשורה באופן הדוק יותר כרומטין בעקבות נזק לדנ א. זוהי דוגמה אחת של אופן השימוש SSE לבחון כיצד האינטראקציות כרומטין שונו בתגובה לגירויים שונים.
איור 1: רציפים בהשוואה רציפים עקירות מלח בתאים OVCA429
א) Immunoblots, כימות של שלושה עצמאית משכפל של פרופילים • תנאי ARID1a ו- PBRM1 בשיטת החילוץ מלח רציפים. ב) Immunoblots, כימות של משכפל עצמאית שלושה פרופילי • תנאי ARID1a ו- PBRM1 שיטת החילוץ מלח רציפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השוואה של דגירה פעמים של פרופילים • תנאי PBAF ו- PRC1
א) השוואה של PBAF (PBRM1) • תנאי פרופילים עם הדגירה 3 עד 10 דקות פעמים. B) השוואה של PRC1 (BMI-1) • תנאי פרופילים עם הדגירה 3 עד 10 דקות פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: היעילות של (+) JQ1 על עיכוב איגוד BRD4
א) • תנאי דפוס של BRD4 בנוכחות 1 מיקרומטר (+) JQ1 לעומת שליטה דימתיל סולפוקסיד בתאים OVCA429. ב) • תנאי פרופיל של ARID1a בנוכחות 1 מיקרומטר (+) JQ1 לעומת שליטה דימתיל סולפוקסיד בתאים OVCA429. עוצמת להקה מצוינת עבור מ מ 0 - 500 מ מ שבר עם דימתיל סולפוקסיד או (+) JQ1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שינויים באיגוד כאשר משתנה כרומטין מעוצבים
א) השוואה של BRD4 • תנאי מתאי OVCA429 מטופלים עם 10 מיקרומטר סאהה 3 שעות לעומת דימתיל סולפוקסיד טיפול. ב) • תנאי פרופילים של ARID1a מתאי OVCA429 שטופלו with10 מיקרומטר סאהה בהשוואה דימתיל סולפוקסיד. הלהקה בעוצמה הוא הצביע עבור מ מ 0-500 מ מ שבר עם דימתיל סולפוקסיד או סאהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שינויים באיגוד PBRM1 לאחר נזק לדנ א
SSE תוצאות עבור איגוד PBRM1 מתאי HEK293T שטופלו 1 מיקרומטר דוקסורוביצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אפיון של אינטראקציות חלבון וכרומטין באמצעות עקירות מלח היא שיטה נפוצה זה כבר מועסקים במשך עשרות שנים14,15; עם זאת, זה לא באופן שיטתי מוטבה לפני כדי לחשוף את השירות המלא שלה. נדגים כיצד רציפים בשיטה זו מספק דרך מהירה וזולה כדי להבחין בין שינויים באיגוד כרומטין כאשר החלבון או הסביבה היא שונה. SSE ממוטב וניתנת להתאמה במיוחד, חשוב, היא טכנית פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד. היבטים מרכזיים שצריך להיות מותאם לפני הפעלת הם: החל מספר הטלפון הנייד, מאגר היפוטוניק תנאים, זמן הדגירה.
ההיבט החשוב ביותר של מספר הטלפון הנייד הוא עקבי בין כל הדגימות. כאשר מסתכלים על מתחמי BAF, באמצעות 8 מיליון תאים מעניקה פרופיל טוב של איך קומפלקסים אלה מחייבות; עם זאת, מספר התאים (או כמות מאגר) ייתכן שיהיה עליך יותאם בהתאם השפע של החלבון עניין. חשוב לציין כי שימוש פחות תאים הוא מאתגר כי ב 400 מ"מ ו 500 מ"מ NaCl קשה לדמיין בגדר כרומטין. זה חיוני כדי לוודא שבגדר לא מועברים עם תגובת שיקוע לאחר 400 מ NaCl.
על מנת להעריך במדויק חלבונים גרעיניים, הגרעינים צריכה להישאר ללא פגע עד שהם נמצאים lysed עם 0 מ מ פתרון mRipa NaCl. פתרונות היפוטוניק נפוצים רבים הם קשים מדי עבור שורות תאים כגון תאים HEK293T והלה. עבור שורות תאים אלה, מומלץ להשתמש המאגר ששונה א
סוף סוף, זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם הניסוי. עבור BAF subunits התבנית • תנאי אינו משתנה בין 3 דקות הדגירה 10 דקות; עם זאת, • תנאי של המתחם PRC1 באופן דרסטי משתנה בהתאם כמה זמן מודגרת הדגימות. בנוסף, בעת הערכת ההשפעה של מעכב על הכריכה של המטרה שלו, זמן הדגירה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים בהתאם קינטיקה מעכב.
בעת ביצוע הניסוי, חשוב להיות עקבי ככל האפשר עם טיפול של הדגימות. עבור כל שבר, מאגר מלח צריך להתווסף בכל דגימה לפני המגון כך כל מדגם חשוף באותה מידה. המטרה של pipetting היא לשבור את המהדורה כרומטין ולעזור החלבונים מאוגד. חשוב לוודא שבגדר עובר דרך הקצה פיפטה. במיוחד כאשר באמצעות מספר גדול יותר של תאים, בגדר כרומטין הוא מאתגר לעבור הטיפ פיפטה בפעמים הראשונות. אנחנו גילינו כי טיפ 1 מ"ל עובד הכי טוב בשביל זה, כמו עם קטין הקשה של הקצה בתחתית הצינורית צנטריפוגה מיקרו, אנחנו יכולים למשוך למעלה בגדר לתוך הקצה. אחרי שעברו בגדר כרומטין דרך הקצה חמש עשרה פעמים, בגדר תנוע בצורה חלקה דרך הטיפ, אבל זה לא יהיה לפזר. לאחר המקננת הדגימות על הקרח ובידוד של כרומטין על ידי צנטריפוגה, הסרת את תגובת שיקוע עם טיפ פיפטה µL 200 מאפשר הסרה מקסימאלית מבלי לשבש את פעולת בגדר כרומטין.
למרות SSE דורש עקביות טכני, שזה פשוט, פשוט, ניתן לבצע באמצעות מעבדה משאבים משותפים. חשוב לציין כי הכוח האמיתי של שיטה זו הוא כאשר. זה משולב עם אחרים בחינות פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר. לדוגמה, באמצעות טכניקה זו, השווינו את הפרופילים איגוד של PBRM1, כאשר כל אחד שלה bromodomains שש היו מוטציה, קבענו כי כל פרט לאחד bromodomains היו מעורבים הכריכה של PBRM1 כדי משתנה מעלות7. מסקרן, מצאנו כי bromodomains היו החשובים ביותר עבור איגוד היו גם חיוני PBRM1 רגולציה של ביטוי גנים ושליטה תא התפשטות7. אנחנו גם לאמת את השינויים באיגוד של המוטנטים האלה לוקוס גנומית דיסקרטית על ידי שבב-qPCR כמותיים7.
הראו לנו רק מספר דוגמאות כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד אינטראקציות חלבון-כרומטין; עם זאת, במעבדה שלנו, מצאנו כי SSE הוא כלי רב-תכליתי עבור חוקרים מגוון רחב של שאלות הנוגעות כרומטין קורא חלבונים. בשילוב עם ניתוחים אחרים, טכניקה זו מקלה על היכולת שלנו להבהיר את הפונקציונליות של הרכיבים המרכיבים אלה לפרט מתחמי חלבון. על ידי הבנת חשיבותה של תחומים נפרדים, אנו מסוגלים לזהות אם הם מטרות טיפולית פוטנציאל לפיתוח של מעכב החוסמת האגודה כרומטין.
הראו כיצד ניתן להרחיב SSE כדי להעריך את האפקטיביות של מעכב מולקולה קטנה על חלבון מחייב כרומטין. בנוסף, על ידי עיכוב סופרים epigenetic ומחקים, SSE ניתן לקבוע את הקשר בין רמות PTM קורא חלבונים. אנחנו הראו גם שמז יכול לשמש כדי לקבוע שינויים באיגוד בתגובה לגירויים חיצוניים כגון נזק לדנ א. למרות ששיטה זו טכניקה פשוטה, בעת החלת בתנאים נאותים, זה מאוד יכול לקדם את הידע שלנו כרומטין וחלבונים רגולטוריים שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך על ידי פרס מלומד V (V2014-004) מלומד V בתוספת פרס (D2016-030) מטעם קרן V לחקר הסרטן, וגרנט אמריקאי סרטן החברה מוסדי מחקר (ACS IRG גרנט 58-006-53) למרכז האוניברסיטאי Purdue לסרטן מחקר. א ז. עמ' נתמכה על ידי פרס הקרן לתואר שני Borch כימיה המרפא של אוניברסיטת פרדו, המחלקה לפרמקולוגיה מולקולרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
