Summary
Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.
Abstract
Delucidazione delle proprietà dell'associazione di proteine della cromatina-targeting può essere molto impegnativa a causa della natura complessa della cromatina e la natura eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina. Per superare questi ostacoli, abbiamo adattato un'analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) per valutare le affinità relativa di legame dei complessi cromatina associato. Questo test semplice e può essere utilizzato da non esperti per valutare la differenza relativa affinità di due complessi correlati, i cambiamenti nell'affinità di un complesso quando una subunità viene persa o un singolo dominio è inattivato e il cambiamento in obbligatoria affinità di legame dopo alterazioni al paesaggio della cromatina. Sospendendo in sequenza nuovamente alla rinfusa della cromatina in quantità crescenti di sale, siamo in grado di profilare l'eluizione di una particolare proteina dalla cromatina. Utilizza questi profili, siamo in grado di determinare come le alterazioni in un complesso modificante la cromatina o alterazioni all'ambiente della cromatina influenzano interazione di legame. SSE di accoppiamento con altri saggi in vitro e in vivo , possiamo determinare i ruoli dei singoli domini e delle proteine sulla funzionalità di un complesso in una varietà di ambienti di cromatina.
Introduction
Regolamento del DNA in cellule eucariotiche è un sistema complesso e sofisticato che è strettamente controllato da un assortimento di proteine che coordinano le risposte agli stimoli intracellulari ed extracellulari. DNA è avvolto intorno octamers dell'istone di nucleosomi forma, che possono essere liberamente distribuiti lungo DNA o compattati in bobine stretto1. Questo arrangiamento strutturale del DNA e gli istoni è detta cromatina, che è regolata da una rete di proteine che leggere, scrivere e cancellare le modifiche post traduzionale (PTM) su istoni2. Alcune istone PTMs, quali acetilazione, cambiare la carica dell'amminoacido sono depositati, alterando le interazioni tra gli istoni e il DNA2. Istone PTMs servono anche a reclutare regolatori trascrizionali, remodelers della cromatina, apparato di riparazione di danni del DNA e replicazione del DNA a specifiche regioni del genoma3.
Maggior parte dei metodi per lo studio delle interazioni della cromatina o sonda interazioni su piccola scala o coinvolgere grandi analisi genoma. Studi di binding in vitro spesso utilizzano i singoli domini ricombinanti con istone peptidi o DNA in saggi quali analisi di spostamento di elettroforesi di mobilità (EMSA), calorimetria isotermica di titolazione, polarizzazione di fluorescenza e peptide trazioni alla lat machine. Perché queste analisi in genere concentrano su un dominio di singole proteine, essi facilitano la comprensione di un piccolo pezzo del puzzle, ma non ci permettono di capire la natura cooperativa di proteine multidominio, figuriamoci il loro ruolo in multi-proteina complessi. Dalla composizione eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina è aggiunto un ulteriore livello di complessità. Questa eterogeneità di proteina, in combinazione con la natura dinamica del paesaggio della cromatina, rende difficile per ricapitolare l' in vivo collegamento interazioni di proteine cromatiniche a cromatina in vitro.
Metodi in vivo hanno fatto progressi significativi; Tuttavia, sono spesso costoso, richiede tempo e tecnicamente impegnativo. Immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento (ChIP-seq) è molto utile per determinare la localizzazione delle proteine e modificazioni istoniche in tutto il genoma, ma richiede notevole ottimizzazione4. Le proteine sono spesso reticolato di cromatina per preservare interazioni; Tuttavia, questo può produrre interazioni artificiale e potrebbe causare epitopo5di mascheramento. Inoltre, l'immunoprecipitazione (IP) richiedono anticorpi altamente specifici e vasta ottimizzazione di taglio del DNA e condizioni IP da ChIP-qPCR utilizzando un sito di legame noto, che spesso non è disponibile a priori. Dopo l'ottimizzazione delle condizioni di ChIP, elaborazione dei campioni è costosa e richiede parecchie settimane ai mesi di sequenza e analizzare. Anche se questo metodo ha un valore inestimabile per identificare la localizzazione della cromatina associata proteine in tutto il genoma, il costo e impegno di tempo rendono proibitivo per utilizzare questo metodo per generare le ipotesi su come piccole modifiche possono influenzare le proprietà di associazione globale .
In questo articolo, descriviamo come un'analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) può essere usata per esaminare i profili di associazione globale di cromatina-proteine e distinguere come cambi in un profilo proteico, complesso, o globale PTM possono alterare le interazioni. Anche se le estrazioni sale sono una tecnica comunemente e ampiamente utilizzata, dimostriamo come questo metodo sequenza è altamente riproducibile e versatile. SSE permette di caratterizzare come una singola subunità di un complesso o anche un singolo dominio contribuisce l'affinità complessiva del complesso per cromatina alla rinfusa. SSE può essere utilizzata anche per determinare se l'associazione di una proteina è influenzato dai cambiamenti nel paesaggio della cromatina, fornendo interessanti ipotesi per istone mark targeting che possono essere confermate mediante ChIP-seq e altri studi di ampia del genoma.
Abbiamo adattato originariamente questo metodo da Wu et al., per esaminare la funzione di Polybromo1 (PBRM1) nell'associazione del PBAF della cromatina remodeler6,7. Utilizzando questa tecnica, abbiamo determinato il ruolo di PBRM1 per l'associazione di cromatina all'interno del complesso di rimodellamento della cromatina PBAF e quindi determinato il contributo relativo della sei bromodomains singoli per questa funzione7.
Qui descriviamo come ottimizzare questo metodo per esplorare associazione della cromatina in diversi tipi cellulari, per valutare l'affinità obbligatoria relativa della cromatina simile modifica complessi, per esaminare lo spostamento di una proteina dalla cromatina da un inibitore chimico, e per determinare gli effetti dell'associazione di cromatina dopo alterazioni al paesaggio della cromatina.
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Protocol
1. preparazioni
- preparare 100 mL di soluzione ipotonica Buffer a: 0,3 M saccarosio, 60 mM KCl, 60 mM Tris-HCl pH 8.0, 2mm EDTA e 0,5% NP-40. Conservare a 4 ° c.
Nota: Alcune linee cellulari, ad esempio di HEK293T, richiedono condizioni meno rigorose di lisante. Se i nuclei lisare facilmente, usare modifica Buffer a: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, EDTA 0,05 mM, 0,1% NP-40 e 10% glicerolo. - Preparare una soluzione madre di 250 mL di soluzione di x mRIPA 2: 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 2% NP-40 e 0,5% sodio desossicolato.
- Preparare una soluzione stock di 100 mL di 5 M NaCl.
- Con i 2 x mRIPA e 5m NaCl soluzioni, preparare 50 mL di soluzione di x mRIPA 1 per ciascuno dei sei concentrazioni saline: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM e 500 mM NaCl. Prima di iniziare l'esperimento, raffreddare tutte le soluzioni su Ice.
- Grow linee sotto condizioni desiderate cellulari.
Nota: Per determinare gli effetti di abbattere una proteina, SSE per la linea di colpo deve essere confrontata con le cellule wildtype. Questi SSE deve essere eseguita fianco a fianco. Per esempi di utilizzo di inibitori chimici o stimoli, fare riferimento alle sezioni 3-5.
2. Estrazione del sale sequenziale base
- raccolto 8 milioni di cellule di ogni condizione e lavare due volte con 5 mL di PBS freddo ghiaccio.
Nota: È fondamentale disporre di ugual numero di cellule ad avere concentrazioni di proteine equivalente. Il numero esatto delle cellule potrebbe essere necessario essere ottimizzato per linee cellulari individuali o particolari proteine. È importante non avere troppi, come l'aumento nelle concentrazioni di proteina impedirà osservazione della curva eluizione, che dipende dall'associazione di equilibrio. Tuttavia, con troppo poche cellule potrebbe non esserci abbastanza proteine per rilevare la curva e il pellet di cromatina è più difficile da isolare e possono essere persi tra frazioni. - Risospendere le cellule in 1 mL di tampone A + inibitori della proteasi, trasferimento in provette da 1,5 mL Centrifuga micro e ruota superiore sopra la parte inferiore a 4 ° c per 10 min.
- Isolare nuclei mediante centrifugazione a 6000 x g per 5 min a 4 ° c.
Nota: Dopo questo passaggio la busta nucleare dovrebbe essere ancora intatta. Se l'involucro nucleare è intatta, il pellet sarà risospendere completamente; Tuttavia, quando la busta viene lisata e la cromatina è rilasciata, il pellet non verrà nuovamente sospeso. Se la busta nucleare non è intatta dopo incubazione di tampone A, utilizzare per volta A. Buffer - Aggiungere 200 µ l di mRIPA 0 mM NaCl + proteasi inibitori ad ogni pellet di nuclei prima di ri-sospendere pellet. Omogeneizzare ogni campione pipettando 15 volte con una pipetta da 1 mL. Il pellet dovrebbe risospendere facilmente, tuttavia, i nuclei saranno lisare come esso è dispensato e il campione diventerà denso e appiccicoso e difficile da dispensare.
- Al fine di redigere il pellet nella punta, tocca alla fine della punta della pipetta contro il fondo della provetta centrifugo. Il pellet non si dissolva completamente una volta che il DNA viene rilasciato dai nuclei, ma pipettaggio romperà up.
- Quando tutti i campioni sono stati omogeneizzati, incubare tutti i campioni sul ghiaccio per 3 min.
Nota: Il tempo di incubazione potrebbe essere necessario essere ottimizzati a seconda della proteina di interesse. - Pellet di cromatina isolare mediante centrifugazione dei campioni per 3 min a 6500 x g a 4 ° c. Tubo
- surnatante di trasferimento ad una centrifuga pulito 1,5 mL. Questa sarà la frazione di 0 mM. Questa soluzione di mRIPA di 0 mM può agire come un passaggio di lavaggio alla lisi i nuclei e rimuovere eventuali proteine sciolti non associate con cromatina.
- Aggiungere 200 µ l di mRIPA 100 mM NaCl + proteasi inibitori per ogni pallina di cromatina prima di ri-sospendere pellet. Rompere il pellet di cromatina pipettando il pellet su e giù per 15 volte.
Nota: È fondamentale per essere coerente con il numero di volte il pellet in pipettato. - Incubare in ghiaccio per 3 min. Questa fase di incubazione consente di raggiungere uno stato di equilibrio, che è particolarmente importante quando ci sono più campioni tutti i campioni.
- Centrifuga a 6500 x g per 3 min a 4 ° c e trasferirlo surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
- Ripetere 2.6-2.10 per le restanti concentrazioni saline.
Nota: Dopo 400 mM NaCl, mRIPA il pellet dovrebbe essere chiaro e salse brodose e non rimarrà nella parte inferiore del tubo. Il pellet può essere posizionato nel coperchio della provetta da centrifuga mentre il surnatante isolato. - Aggiungere 70 µ l di 4 x carico di proteine tingere di ciascuna frazione e caricare 30 µ l di ciascuna frazione su un gel di acrilammide SDS per l'analisi western blot.
Nota: Per determinare il profilo di associazione della proteina, è fondamentale per caricare volumi equivalenti delle concentrazioni di proteina uguale lisato, piuttosto che carico. - Eseguire una macchia occidentale standard trasferendo su una membrana e utilizzare gli anticorpi primari per le proteine di interesse.
- Per quantificare le proteine eluite dalla cromatina, incubare la macchia in anticorpi secondari di fluorescenza a raggi infrarossi IRDye e immagine della macchia con un imager. Mentre possono essere utilizzati altri metodi di sviluppo, si consiglia di fluorescenza o imaging a raggi infrarossi, come è più quantitativa in natura.
- Uso ImageJ o software simili per calcolare l'intensità per la proteina eluita a ciascuna concentrazione salina. Rappresentando graficamente l'intensità di banda contro la concentrazione di sale, il modello di eluizione della vostra proteina di interesse può essere determinato.
3. Estrazione del sale sequenziale in presenza di un " lettore " inibitore
- raccolto due insiemi di celle (4 milioni) e isolare i nuclei come un standard SSE.
- Risospendere entrambi i set in 200 µ l di mRIPA 0 mM NaCl e incubare per 3 min. Questo permetterà per la rimozione di qualsiasi proteina libera nei nuclei.
- Aggiungere 200 µ l mRIPA 0 mM NaCl per ogni pallina. Aggiungere l'inibitore (2 µ l di 1 mM (+) JQ1) per un campione e DMSO al gruppo di controllo.
- Agitare il pellet di pipettaggio 15 volte e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Centrifuga a 6500 x g per 3 min a 4 ° c e trasferirlo surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
- Ripetere 3.3-4 per tutte le concentrazioni saline ed eseguire una macchia occidentale standard.
4. Estrazione del sale sequenziale in presenza di un " scrittore " inibitore
- trattare le cellule con l'inibitore (10 µM SAHA) o DMSO per 3 h.
- Raccogliere 4 milioni di cellule per ogni trattamento.
- Eseguire una standard SSE per i campioni con l'inibitore aggiunto a tutti i buffer.
5. Sequenziale sale estrazione seguente danno del DNA
- trattare le cellule con 1 doxorubicina µM per 1 h.
- Cambiare il supporto sulle cellule e consentire loro di recuperare per 3 h.
- Raccogliere 8 milioni di cellule ed eseguire lo SSE base.
6. Estrazione del sale non-sequenziale
- raccogliere le cellule 12 milioni e lavare con PBS.
- Dividere celle in modo che ci sono 2 milioni di cellule per micro provetta.
- Risospendere in 500 µ l di tampone A e incubare per 10 min.
- Isolare i nuclei mediante centrifugazione a 6000 x g.
- Risospendere pellet in un 200 µ l di ciascuno dei buffer di mRIPA + NaCl.
- Omogeneizzare ogni campione pipettando 15 volte con una punta di Pipetta 1ml.
- Incubare in ghiaccio per 3 min.
- Isolare la cromatina mediante centrifugazione a 6500 x g e trasferire il surnatante per pulire i tubi. Aggiungere 70 µ l di colorante di carico ed eseguire 30 µ l su un gel di SDS-page per l'analisi western blot.
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Representative Results
In questa carta, si dimostrano i vantaggi e le applicazioni del metodo di estrazione del sale comunemente usato sequenziale (SSE) che abbiamo adattato dalla letteratura6. Nella Figura 1, mettiamo a confronto la riproducibilità di SSE all'estrazione delle proteine non sequenziale rilevando i modelli di eluizione di ARID1a e PBRM1. Osserviamo costantemente che ARID1a, una subunità BAF, eluisce principalmente a 200mm NaCl e PBRM1, un'esclusiva della subunità PBAF, eluisce principalmente a 300 mM NaCl. Figura 1a Mostra tre replicati indipendente di SSE con 8 milioni OVCA429 cellule. Figura 1b raffigura un'estrazione del sale non sequenziale dove nuclei isolati da cellule 2 milioni sono stati risospesi in un singolo tampone salino. Anche se entrambi i metodi concludono che ARID1a eluisce a 200 mM e PBRM1 eluisce a 300mm, lo SSE produce un profilo ben definito associazione e consente una chiara distinzione di associazione di questi due complessi. Inoltre, nel metodo non-sequenziale, la quantità di proteine eluite nei 400 e 500 mM NaCl buffer è inferiore a 300 mM e non è coerente tra le tre repliche. Sebbene questo problema può essere risolto con ulteriore ottimizzazione della velocità di tempo e centrifugazione di incubazione, questo illustra il vantaggio di riproducibilità di SSE.
Attraverso la nostra ottimizzazione, abbiamo trovato che altri complessi cromatina possono richiedere più tempo per essere eluito. In Figura 2, dimostriamo che l'attivatore trascrizionale, PBAF, eluisce dalla cromatina costantemente tra SSEs con tempi di incubazione di 3 min e 10 min. Al contrario, eluizione del repressore trascrizionale, Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), indicato da BMI-1, richiede un tempo di incubazione più lungo per essere rilasciato da cromatina8. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto PRC1 essendo localizzato nelle regioni più compatte e inaccessibile del genoma, o potrebbe essere a causa di cinetica di legame differenziale per i due complessi.
Dopo l'ottimizzazione per una particolare proteina, SSEs può essere utilizzato per studiare come la forza del legame proteico cambia in diverse condizioni. SSE può essere utilizzata per esaminare l'efficacia di un inibitore delle interazioni proteina-proteina. Per illustrare questo concetto, abbiamo utilizzato (+) JQ1, che è un inibitore di bromodomain BRD4, per esaminare come è alterato BRD4 associazione (Figura 3a)9. Abbiamo isolato i nuclei da 4 milioni OVCA429 cellule. Per rimuovere qualsiasi BRD4 non associato, è stato effettuato un lavaggio iniziale 0 mM su entrambi i campioni. Quindi uno standard che SSE è stata effettuata con DMSO o 1 µM (+) JQ1 aggiunto per ogni frazione. I campioni sono stati incubati per 5 min. Osserviamo che BRD4 eluisce precedenza in presenza dell'inibitore rispetto a DMSO. Per visualizzare che tale JQ1 (+) è specifico per BRD4, abbiamo cancellato per ARID1a e ho visto alcun cambiamento a eluizione (Figura 3b).
Avanti che abbiamo esaminato come legame con le proteine può essere modificato quando viene modificato il paesaggio della cromatina. BRD4 contiene due bromodomains residui di lisina acetilata di riconoscere in istone Code10. Per aumentare il livello di acetilazione dell'istone, abbiamo trattato le cellule OVCA429 con 10 µM dell'acido di suberanilohydroxamic di inibitore deacetylase dell'istone (SAHA) per 3 h. SAHA (10 µM) è stato aggiunto a tutti i buffer durante lo SSE. Aumentando i livelli di acetilazione dell'istone globale, abbiamo osservato un aumento in BRD4 vincolanti (Figura 4a). Quando macchiare per ARID1a, osserviamo più stretto legame di ARID1a pure, che non è sorprendente perché subunità del BAF complesso, quali WK1, BRM e BRD9, tutti contengono bromodomains10,11 (Figura 4b).
Infine, per esibire come SSE può essere utilizzata per guardare come legame proteico cambia quando cellule sperimentare alterazioni genomiche, abbiamo indotto rotture del DNA incagliate doppie con l'inibitore della topoisomerasi II, doxorubicina12. Abbiamo trattato le cellule HEK293T con 1 µM di doxorubicina per un'ora e permise alle cellule di recuperare per tre ore. Dopo aver eseguito lo SSE, abbiamo cancellato per PBRM1, che è coinvolto nella riparazione di DNA danni13. Abbiamo osservato due picchi per PBRM1 associazione: uno a 300 mM e uno a 500 mM NaCl (Figura 5). Questo suggerisce che parte della popolazione PBRM1 è vincolante normalmente, ma un sottoinsieme di PBRM1 è più strettamente legato al cromatina seguendo il danno del DNA. Questo è solo un esempio di come utilizzare SSE per esaminare come le interazioni della cromatina sono alterati in risposta a diversi stimoli esterni.
Figura 1: Non-sequenziale rispetto alle estrazioni sequenziale sale in cellule di OVCA429
A) Immunoblots e quantificazione di tre indipendenti vengono replicati di ARID1a e PBRM1 profili di eluizione tramite il metodo di estrazione del sale sequenziale. B) Immunoblots e quantificazione delle tre repliche indipendenti dei profili di eluizione di ARID1a e PBRM1 nel metodo di estrazione del sale non sequenziali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto dei tempi di incubazione dei profili di eluizione di PBAF e PRC1
A) confronto dei profili di eluizione di PBAF (PBRM1) con tempi di incubazione 3 e 10 minuti. B) confronto tra PRC1 profili di eluizione (BMI-1) con tempi di incubazione 3 e 10 minuti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Efficacia di (+) JQ1 su inibendo BRD4 legame
A) modello eluizione di BRD4 in presenza di 1 µM (+) JQ1 rispetto al controllo di DMSO in cellule OVCA429. B) profilo eluizione di ARID1a in presenza di 1 µM (+) JQ1 rispetto al controllo di DMSO in cellule OVCA429. Intensità di banda è indicato per 0 mM - frazione di 500mm con DMSO o (+) JQ1.
Figura 4: Alterazioni nell'associazione quando viene modificata la cromatina paesaggistica
A) confronto di eluizione BRD4 dalle cellule OVCA429 trattati con 10 µM SAHA per 3 ore rispetto al trattamento di DMSO. B) profili di eluizione di ARID1a da OVCA429 cellule trattate con 10 µM SAHA rispetto a DMSO. Intensità di banda è indicato per frazione 0-500 mM con DMSO o SAHA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cambiamenti nell'associazione PBRM1 dopo il danno del DNA
Risultati di SSE per PBRM1 associazione da HEK293T cellule trattati con 1 µM doxorubicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Caratterizzazione delle interazioni della proteina e della cromatina attraverso estrazioni sale è un metodo comune che è stato impiegato per decenni14,15; Tuttavia, esso non è stato sistematicamente ottimizzato prima di rivelare la sua utilità completo. Dimostriamo come questo metodo sequenza consente di distinguere le modifiche nell'associazione della cromatina quando la proteina o per l'ambiente è alterata in modo rapido e poco costoso. SSE è altamente adattabile e ottimizzabile e d'importanza, è tecnicamente semplice e non richiede nessuna apparecchiatura specializzata. Gli aspetti chiavi che devono essere ottimizzate prima di iniziare sono: a partire di numero delle cellule, condizioni di buffer ipotonico e tempo di incubazione.
L'aspetto più importante del numero di cellule è che è coerenza tra tutti i campioni. Quando guardando complessi BAF, utilizzando cellule 8 milioni dà un buon profilo di come questi complessi sono vincolanti; Tuttavia, il numero di celle (o la quantità di tampone) potrebbe essere necessario essere regolato secondo l'abbondanza della proteina di interesse. È importante notare che utilizzando un minor numero di cellule è una sfida perché a 400 mM e 500 mM NaCl è difficile visualizzare il pellet di cromatina. È fondamentale per assicurarsi che il pellet non viene trasferito con il supernatante dopo 400 mM NaCl.
Per valutare con precisione le proteine nucleari, i nuclei devono rimanere intatto fino a quando vengono lisate con 0 mM NaCl mRipa soluzione. Molte soluzioni ipotoniche comunemente utilizzati sono troppo dure per linee cellulari quali cellule HEK293T e HeLa. Per queste linee cellulari, si raccomanda di utilizzare il Buffer modificato A.
Infine, il tempo di incubazione può variare a seconda dell'esperimento. Per le unità secondarie BAF il pattern di eluizione non cambia tra un 3 min e 10 min di incubazione; Tuttavia, l'eluizione del complesso PRC1 cambia drasticamente a seconda di quanto tempo i campioni sono incubati. Inoltre, quando si valuta l'effetto di un inibitore sul grippaggio della sua destinazione, il tempo di incubazione potrebbe essere necessario essere ottimizzato a seconda della cinetica di inibitore.
Quando si esegue l'esperimento, è importante essere più costanti possibile con il trattamento dei campioni. Per ogni frazione, il tampone salino dovrebbe aggiungersi per ogni campione prima dell'omogeneizzazione affinché ciascun campione è ugualmente esposti. Il punto di pipettaggio è per spezzare il rilascio della cromatina e aiuto le proteine associate. È importante assicurarsi che il pellet passa attraverso la punta della pipetta. Soprattutto quando si utilizza un numero maggiore di cellule, il pellet di cromatina è impegnativo di passare attraverso la punta della pipetta le prime volte. Abbiamo trovato che una mancia di 1 mL funziona meglio per questo, come con maschiatura minore della punta contro il fondo della provetta centrifugo micro, siamo in grado di aspirare il pellet in punta. Dopo aver superato il pellet di cromatina attraverso la punta quindici volte, il pellet dovrebbe muoversi agevolmente attraverso la punta, anche se non si dissolverà. Dopo incubazione dei campioni su ghiaccio e isolando la cromatina con centrifugazione, rimuovere il surnatante con una punta di pipetta 200 µ l permette massima rimozione senza interrompere il pellet di cromatina.
Se SSE richiede coerenza tecnica, è semplice e diretto e può essere eseguita con risorse di laboratorio comuni. È importante notare che la vera forza di questo metodo è quando è accoppiato con altri esami fenotipiche. Ad esempio, utilizzando questa tecnica, abbiamo confrontato i profili di associazione di PBRM1 quando ciascuno dei suoi sei bromodomains erano mutati, abbiamo determinato che tutti tranne uno il bromodomains sono stati coinvolti nel legame del PBRM1 a variare i gradi7. Intrigante, abbiamo trovato che la bromodomains che erano i più importanti per l'associazione erano anche essenziale per PBRM1 regolazione dell'espressione genica e di proliferazione delle cellule controllo7. Abbiamo validato anche le modifiche nell'associazione di questi mutanti per un locus genomico discreto quantitativi ChIP-qPCR7.
Abbiamo indicato solo alcuni esempi di come questa tecnica può essere utilizzata per studiare le interazioni della proteina-cromatina; Tuttavia, nel nostro laboratorio, abbiamo trovato che SSE è uno strumento versatile per una vasta gamma di domande riguardanti proteine cromatiniche lettore di indagare. In combinazione con altre analisi, questa tecnica facilita la nostra capacità delucidare la funzionalità dei componenti composto da questi elaborati complessi proteici. Comprendere l'importanza dei singoli domini, possiamo individuare se sono potenziali bersagli terapeutici per lo sviluppo di un inibitore che blocca l'associazione della cromatina.
Abbiamo dimostrato come SSE può essere espanso per valutare l'efficacia di un inibitore di piccola molecola il legame con le proteine di cromatina. Inoltre, inibendo epigenetici scrittori e cancellatori, SSE può determinare la relazione tra livelli di PTM e proteine di lettore. Inoltre abbiamo indicato che il SSE può essere utilizzato per determinare cambiamenti nell'associazione in risposta a stimoli esterni come il danno del DNA. Anche se si tratta di una tecnica semplice, quando applicato in condizioni adeguate, notevolmente può avanzare la nostra conoscenza della cromatina e sue proteine regolatrici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un premio di studioso di V (V2014-004) e un erudito V plus award (D2016-030) dalla Fondazione V for Cancer Research e un American Cancer Society istituzionale Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) al centro di Università di Purdue per cancro Ricerca. E. g. P. è stato sostenuto dal Borch Graduate Endowment Award al reparto di farmacologia molecolare e chimica farmaceutica di Purdue University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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