Summary
Последовательные добыча соли хроматина связаны белков является полезным инструментом для определения свойств привязки крупных белковых комплексов. Этот метод может использоваться для оценки роли отдельных подразделений или домены в общей схожести белкового комплекса для массового хроматина.
Abstract
Выяснения свойств привязки хроматина таргетинг белков может быть очень сложным из-за сложного характера хроматина и неоднородный характер наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы адаптировали assay последовательный добыча соли (SSE) для оценки относительной привязки сходство хроматина привязанных комплексов. Этот простой и простой assay может использоваться не-экспертов для оценки относительной разницы в обязательную силу сходства двух соответствующих комплексов, изменения в близость комплекса когда субъединицы теряется или инактивированная отдельный домен, и изменения в сродство после изменения ландшафта хроматина. Приостановив последовательно повторно массовых хроматина в увеличении количества соли, мы способны профиль элюции белка от хроматина. Используя эти профили, мы в состоянии определить, как изменения в комплексе chromatin изменения или изменения в окружающей среде хроматина влияют на привязки взаимодействия. Муфта SSE с другими в пробирке и в естественных условиях анализов, мы можем определить роли отдельных доменов и белков на функциональность комплекса в различных средах хроматина.
Introduction
Регулирование ДНК в эукариотических клеток является сложной и сложной системы, которая жестко контролируется ассортимент белков, которые координируют ответы на внутриклеточные и внеклеточной стимулы. ДНК оборачивают вокруг гистона octamers к форме нуклеосом, которые могут быть свободно распространяется вдоль ДНК или уплотняется в жесткой катушек1. Этот структурный механизм ДНК и гистонов известен как хроматина, которая регулируется сеть белков, которые читать, писать и стереть сообщение поступательные изменения (ПТМ) гистонами2. Некоторые гистона PTMs, таких как ацетилирования, изменить заряд аминокислоты, которые они оседают на, изменяя взаимодействие между гистонами и ДНК2. Гистона PTMs также служат для набирать транскрипционный анализ регуляторов, ремонтом хроматина, ДНК повреждения ремонт техники и механизма репликации ДНК для конкретных регионов генома3.
Большинство методов для изучения взаимодействия хроматина зонд взаимодействия малых масштабах или привлекать большие генома широкий анализ. В vitro исследования привязки часто используют отдельные рекомбинантных домены с гистонов пептидов или ДНК в анализов таких анализов сдвиг мобильность электрофореза (EMSA), изотермический титрования калориметрии, поляризации флуоресценции и pulldowns пептида. Потому что эти анализы обычно сосредоточены на домене индивидуальных белков, они облегчают понимание небольшой кусок головоломки, но не позволяют нам понять кооперативного характера многодоменной белки, не говоря уже о их роли в нескольких белка комплексы. Еще один слой сложность добавляется гетерогенных состав наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Эта разнородность белка, в сочетании с динамичный характер ландшафта хроматина, делает его сложно резюмировать в естественных условиях привязки взаимодействия белков хроматина хроматина в пробирке.
В естественных условиях методы добились значительных успехов; Однако они часто дорого, много времени и технически сложным. Иммунопреципитации Chromatin, следуют виртуализации (чип seq) является весьма полезной для определения локализации белков и изменения гистона по всему геному, однако она требует существенной оптимизации4. Белки являются часто высокоструктурированные chromatin для сохранения взаимодействия; Однако это может производить искусственные взаимодействий и может вызвать epitope маскировки5. Кроме того immunoprecipitations (IP) требуют весьма специфических антител и обширные оптимизации ДНК стрижка и IP условий по чип ПЦР с помощью известных привязки сайта, который часто не доступны априори. После оптимизации условий чип обработка образцов является дорогостоящим и требует нескольких недель до месяцев последовательности и анализировать. Хотя этот метод имеет неоценимое значение для выявления локализации хроматина привязывается белки по всему геному, стоимость и время обязательство сделать это непомерно использовать этот метод для генерации гипотез о как небольшие изменения могут повлиять на глобальные привязки свойства .
В этой статье мы описываем, как пробирного последовательный добыча соли (SSE) может использоваться для изучения глобальных привязки профили хроматина прыгните белков и различие, как изменения в профиль белка, сложные, или глобальной PTM может изменять взаимодействий. Хотя соль зубов часто и широко используемый метод, мы демонстрируем, как этот последовательный метод высокую воспроизводимость и универсальным. SSE позволяет характеризовать как один Субблок комплекс или даже одного домена способствует общий комплекс сродство для сыпучих хроматина. SSE может также использоваться для определения, если привязка белка находится под влиянием изменения в ландшафте хроматина, предоставляя интересные гипотезы для гистона Марк ориентации, которые могут быть подтверждены с помощью чип seq и другие исследования генома широкий.
Первоначально мы адаптировали этот метод из Wu et al., изучить функции Polybromo1 (PBRM1) в привязке PBAF хроматина remodeler6,7. Используя эту технику, мы определены роли PBRM1 для привязки хроматина в пределах PBAF хроматина, реконструкции комплекса и затем определить относительный вклад шести отдельных bromodomains этой функции7.
Здесь мы опишем, как оптимизировать этот метод для изучения привязки хроматина в различных типов клеток, чтобы оценить относительная сродство аналогичные хроматина, изменяя комплексы, для изучения перемещения белка от хроматина, химического ингибитор, и определить эффекты хроматина привязки после изменения ландшафта хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. препараты
- подготовить 100 мл гипотонический раствор A: буфера 0,3 М сахарозы, 60 мм KCl, 60 мм трис pH 8.0, 2 мм ЭДТА и 0,5% NP-40. Хранить при 4 ºC.
Примечание: Некоторые клеточные линии, такие как HEK293T, требуют менее строгие лизировать условий. Если ядер лизируют легко, использовать изменение буфера A: 25 мм HEPES рН 7,6, 25 мм KCl, 5 мм MgCl 2, ЭДТА 0,05 мм, 0,1% NP-40 и 10% глицерина. - Подготовить раствор 250 мл 2 x mRIPA раствора: 100 мм трис рН 8,0, 2% NP-40 и 0,5% Дезоксихолат натрия.
- Подготовить Стоковый раствор 100 мл по 5 М NaCl.
- С использованием 2 x mRIPA и 5 М NaCl решения, подготовить 50 мл раствора 1 x mRIPA для каждого из шести концентрация соли: 0 мм, 100 мм, 200 мм, 300 мм, 400 мм и 500 мм NaCl. Перед началом эксперимента, прохладно все решения на льду
- Рост клеток линии желаемых условиях.
Примечание: При определении последствий стучать вниз белок, SSE для линии нокдаун необходимо сравнить с wildtype клеток. Эти SSE должны быть выполнены бок о бок. Примеры с использованием химических ингибиторов или стимулы, обратитесь к разделам 3-5.
2. Основные последовательные добыча соли
- урожай 8 миллионов клеток каждого состояния и мыть дважды с 5 мл холодного льда PBS.
Примечание: Очень важно иметь равное количество клеток иметь эквивалентные белка концентрации. Точное количество клеток может потребоваться быть оптимизированы для отдельных клеточных линий или конкретной белков. Важно, чтобы не иметь слишком много, как увеличение концентрации белка будет препятствовать наблюдению элюции кривой, которая зависит от равновесия привязки. Однако, слишком мало клеток не может быть достаточно белка для определения кривой, и пеллетные chromatin труднее изолировать и может быть потеряно между фракциями. - Вновь приостановить клеток в 1 мл буфера A + ингибиторов протеазы, передачи в 1,5 мл пробирок микро и поворот сверху над нижней на 4 ° c на 10 мин
- Изолировать ядер центрифугированием в 6000 x g 5 мин на 4 ºC.
Примечание: После этого шага ядерная оболочка должна быть нетронутыми. Если ядерная оболочка нетронутыми, гранулы будут вновь приостановить полностью; Однако когда лизированы конверт и выпущен хроматина, гранулы будет не вновь приостановить. Если ядерная оболочка не нетронутыми после инкубации буфера A, используйте изменения буфера а. - Добавить 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl + протеазы ингибиторов для каждого ядра гранул до повторной приостановки Пелле. Однородный каждого образца, закупорить 15 раз с Пипетка 1 мл. Пелле следует вновь приостановить легко, однако, ядер будет лизируют как это накапаны и образец станет толстым и липкое и трудно Пипетка.
- Для того чтобы составить гранулы в наконечник, нажмите конце кончика пипетки против нижней части пластиковых пробирок. Гранулы не растворится полностью после того, как ДНК, освобождается от ядра, но закупорить будет разорвать его наверх
- Когда все образцы были гомогенизированные, Инкубируйте все образцы на льду на 3 мин
Примечание: Время инкубации может потребоваться быть оптимизированы в зависимости от протеина интереса. - Изоляции хроматина Пелле центрифугированием образцы для 3 мин при 6500 g x 4 ºC.
- Передачи супернатант в центрифугу чистой 1,5 мл трубки. Это будет 0 мм фракция. Это решение mRIPA 0 мм может выступать как мыть шаг лизис ядер и удалите любые свободные белки, не связанные с хроматином.
- Добавить 200 мкл mRIPA 100 мм NaCl + протеазы ингибиторов для каждого хроматина гранул до повторной приостановки Пелле. Разбить пеллетные chromatin, закупорить Пелле вверх и вниз по 15 раз.
Примечание: Важно соответствовать количество раз, гранулы в накапаны. - Инкубировать на льду на 3 мин. Этот шаг инкубации позволяет все образцы для достижения состояния равновесия, что особенно важно при наличии нескольких образцов.
- Центрифуг в 6500 x g 3 мин 4 ºC и передачи супернатанта чистой 1,5 мл.
- Повторить 2.6-2.10 для оставшихся концентрация соли.
Примечание: После 400 мм NaCl, mRIPA гранулы должны быть ясно и вязком и не будет оставаться в нижней части трубки. Таблетки могут быть помещены в крышке пластиковых пробирок, хотя изолированные супернатант. - Добавить 70 мкл 4 x белка загрузки краситель для каждой фракции и загрузить 30 мкл каждой фракции на Полимерность гелей SDS для Западный анализ помаркой.
Примечание: Чтобы определить профиль связывания белка, важно для загрузки эквивалент томов lysate, вместо загрузки равных белка концентраций. - Выполнять Стандартный западную помарку путем передачи на мембрану и использование первичных антител для протеинов интереса.
- Чтобы quantitate белков этого eluted от хроматина, инкубировать пятно в инфракрасной флуоресценции IRDye вторичные антитела и изображения пятно с формирователь изображений. В то время как другие методы разработки могут быть использованы, мы рекомендуем флуоресценции или инфракрасных изображений, так как это более количественный характер.
- Использование ImageJ или аналогичного программного обеспечения для расчета интенсивности для белков этого eluted на каждом концентрации соли. По графические интенсивности группы против концентрации соли, может быть определен характер элюции вашего протеина интереса.
3. Последовательные добыча соли в присутствии из " читатель " ингибитор
- урожая два набора клеток (4 миллиона) и изолировать ядер как стандартный SSE.
- Вновь приостановить оба набора в 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl и Инкубируйте 3 мин. Это позволит для удаления любого свободного белка в ядрах.
- Добавить 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl в каждой гранулы. Добавление ингибитора (2 мкл 1 мм (+) СВ1) один образец и ДМСО в наборе элементов управления.
- Взволновать гранулы, закупорить 15 раз и инкубировать на льду на 5 мин
- Центрифуг в 6500 x g 3 мин 4 ºC и передачи супернатанта чистой 1,5 мл.
- Повторить 3.3-4 для всех концентрация соли и выполнять стандартные западную помарку.
4. Последовательные добыча соли в присутствии из " писатель " ингибитор
- лечения клетки с ингибитором (10 мкм Саха) или ДМСО на 3 ч.
- Урожая 4 миллионов клеток для каждого лечения.
- Выполнять стандартные SSE для образцов с ингибитором, добавляются все буферы.
5. Последовательные соли извлечения следующие повреждения ДНК
- лечения клетки с 1 мкм доксорубицина на 1 ч.
- Измените СМИ на клетки и дать им возможность восстановить за 3 ч.
- Урожая 8 миллионов клеток и выполнять основные SSE.
6. Не-последовательных добыча соли
- урожая 12 миллионов клеток и мыть с PBS.
- Деление клетки так, что есть 2 миллион клеток в микро пластиковых пробирок.
- Вновь приостановить в 500 мкл буфера A и инкубировать на 10 мин
- Изолировать ядер центрифугированием в 6000 x g.
- Вновь приостановить гранул в 200 мкл каждого из mRIPA буферов + NaCl.
- Однородности каждого образца, закупорить 15 раз с 1 мл кончиком пипетки.
- Инкубировать на льду на 3 мин
- Изолировать хроматина центрифугированием при 6500 x g и передачи супернатант для очистки трубок. 70 мкл загрузки красителя и запуск 30 мкл на геля SDS-page для Западный анализ помаркой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье мы продемонстрировать преимущества и приложений часто используемых последовательных добыча соли (SSE) метода, который мы адаптировали от литературы6. На рисунке 1мы сравниваем воспроизводимость SSE для извлечения белков не последовательно, обнаруживая элюции моделей ARID1a и PBRM1. Мы последовательно соблюдать ARID1a, субъединицы BAF, elutes прежде всего на 200 мм, NaCl и PBRM1, эксклюзивный субъединица PBAF, elutes прежде всего на 300 мм NaCl. Рисунок 1a показывает три независимых реплицирует SSE с 8 миллионов OVCA429 клеток. Рисунок 1b изображена непоследовательных добыча соли, где ядер изолированных от 2 миллионов клеток были вновь приостановлено в один буфер соли. Хотя оба метода заключить, что ARID1a elutes на 200 мм и PBRM1 elutes в 300 мм, SSE производит четкой привязки профиль и позволяет для четкого различия привязки этих двух комплексов. Кроме того в методе непоследовательно, количество белка, этого eluted в буферы NaCl 400 мм и 500 мм ниже, чем на 300 мм и несогласованность между тремя реплицирует. Хотя этот вопрос может быть решен с дальнейшей оптимизации инкубации время и центрифугирования скорости, это иллюстрирует воспроизводимость преимуществом SSE.
Благодаря нашей оптимизации мы обнаружили, что другие хроматина комплексов может потребовать больше времени, чтобы быть этого eluted. На рисунке 2мы демонстрируем, что transcriptional активатор, PBAF, elutes от хроматина последовательно между МП с 3 мин и 10 мин инкубации раз. В отличие от элюции transcriptional репрессор Polycomb репрессивных комплекс 1 (PRC1), обозначается BMI-1, требует больше времени инкубации быть освобожденными от хроматина8. Это явление может из-за PRC1 локализуется в более компактной и труднодоступных регионах генома, или может быть вызвано дифференциальные привязки кинетики для двух комплексов.
После оптимизации для конкретного белка МП может использоваться для изучения, как прочность связывания белков изменения в различных условиях. SSE может использоваться для изучения эффективности ингибитор белок белковых взаимодействий. Чтобы продемонстрировать это понятие, мы использовали (+) СВ1, который является ингибитором bromodomain BRD4, чтобы изучить, как он изменен BRD4 привязки (Рисунок 3А)9. Мы изолированы ядра от 4 миллиона OVCA429 клеток. Чтобы удалить любые свободные BRD4, мыть начального 0 мм была выполнена на обоих образцах. Стандарт, выполненных SSE с ДМСО или 1 мкм (+) СВ1 добавляются для каждой фракции. Образцы инкубировали в течение 5 мин. Мы отмечаем, что BRD4 ранее elutes в присутствии ингибиторов, по сравнению с ДМСО. Чтобы показать, что (+) СВ1 специфичен для BRD4, мы смыты для ARID1a и увидели никаких изменений в элюции (Рисунок 3b).
Далее мы рассмотрели, как связывания белков может быть изменено при изменении пейзаж хроматина. BRD4 содержит два bromodomains, которые признают ацетилированный лизин остатков гистона хвосты10. Для увеличения уровня ацетилирование гистонов, мы относились к OVCA429 клеток с 10 мкм гистоновых деацетилаз ингибитор suberanilohydroxamic кислоты (Саха) за 3 ч. Саха (10 мкм) был добавлен для всех буферов при SSE. Путем увеличивать уровни ацетилирование гистона глобальной, мы наблюдали увеличение BRD4 привязки (рис. 4a). Когда промокательной для ARID1a, мы наблюдаем более жесткие привязки ARID1a также, что не удивительно, потому что субблоки BAF, сложные, такие как BRG1, BRM и BRD9, все содержат bromodomains10,11 (рис. 4b).
Наконец на выставку, как SSE может использоваться для взглянуть на как связывания белков меняется, когда клетки опыт геномных изменений, мы индуцированной двойной мель разрывы ДНК с ингибитором топоизомеразы II, доксорубицин12. Мы относились HEK293T клетки с 1 мкм доксорубицина в час и позволило клетки для восстановления на три часа. После выполнения SSE, мы смыты для PBRM1, который участвует в ДНК повреждения ремонт13. Мы наблюдали две вершины для привязки PBRM1: 300 мм и 500 мм NaCl (рис. 5). Это предполагает, что некоторые из PBRM1 населения обычно является обязательным, но подмножество PBRM1 более жестко привязан к хроматина, после повреждения ДНК. Это лишь один пример использования SSE для изучения, как взаимодействия chromatin изменяются в ответ на различные внешние раздражители.
Рисунок 1: Непоследовательных по сравнению с последовательным соли экстракции в OVCA429 клетках
A) иммуноблотов и количественной оценки трех независимых реплицирует профилями элюции ARID1a и PBRM1 методом последовательного добыча соли. B) иммуноблотов и количественной оценки трех независимых реплицирует из ARID1a и PBRM1 профилями элюции в методе непоследовательных добыча соли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Сравнение инкубации раз профилями элюции PBAF и PRC1
A) Сравнение профилей элюции PBAF (PBRM1) с 3 и 10-минутный инкубационных раз. B) сравнение PRC1 (ИМТ-1) элюции профили с 3 и 10-минутный инкубационных раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эффективность (+) СВ1 на угнетении BRD4 привязки
A) элюции шаблон BRD4 в присутствии 1 мкм (+) СВ1, по сравнению с контролем ДМСО в OVCA429 клетках. B) элюции профиль ARID1a присутствии 1 мкм (+) СВ1, по сравнению с контролем ДМСО в OVCA429 клетках. Группа интенсивности указывается для 0 мм - 500 мм фракция с ДМСО или СВ1 (+).
Рисунок 4: Изменения в привязке при изменении хроматина ландшафтный
A) сравнение элюции BRD4 из OVCA429 клеток лечение с 10 мкм Саха 3 часа, по сравнению с ДМСО лечения. B) элюции профили ARID1a из OVCA429 клеток лечение with10 мкм Саха, по сравнению с ДМСО. Группа интенсивности указывается для фракция 0-500 мм с ДМСО или Саха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Изменения в PBRM1 привязки после повреждения ДНК
SSE результаты для привязки PBRM1 из HEK293T клеток лечение с 1 мкм доксорубицина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Характеристика белков и хроматина взаимодействий через соль экстракции является общий метод, который был нанят для десятилетий14,15; Однако он не был оптимизирован систематически прежде чем раскрыть свою полезность. Мы демонстрируем, как этот последовательный метод обеспечивает быстрый и недорогой способ отличить изменения в привязке хроматина, при изменении белка или окружающей среды. SSE является очень гибкой и оптимизируемыми, и главное, это технически проста и не требует специализированного оборудования. Ключевые аспекты, которые необходимо прооптимизировать до начала: начальный номер ячейки, гипотонический буфера условия и время инкубации.
Наиболее важным аспектом количества клеток является согласованность между все образцы. При взгляде на BAF комплексов, используя 8 миллионов клеток дает хороший профиль как эти комплексы являются обязательными; Однако количество клеток (или количество буфера) может потребоваться корректироваться в зависимости от обилием протеина интереса. Важно отметить, что с помощью меньшего числа клеток сложным, потому что на 400 мм и 500 мм NaCl трудно визуализировать пеллетные chromatin. Жизненно важно, чтобы убедиться, что гранулы не переносится с надосадке после 400 мм NaCl.
Для того, чтобы точно оценить ядерных белков, ядра должны оставаться нетронутыми до тех пор, пока они будут анализироваться с 0 мм mRipa раствор NaCl. Многие часто используемые гипотонический решения являются слишком суровыми для клеточных линий, таких как HEK293T и НеЬа клетки. Для этих клеточных линий рекомендуется использовать измененные буфера а.
Наконец время инкубации может варьироваться в зависимости от эксперимента. Для BAF субблоков элюции шаблон не меняется между 3 мин и 10 минут инкубации; Однако элюции комплекса PRC1 резко меняется в зависимости от того, как долго Образцы инкубируют. Кроме того при оценке эффект ингибитора в привязке его цели, время инкубации может потребоваться быть оптимизированы в зависимости от ингибитор кинетики.
При выполнении эксперимента, важно быть как можно более последовательными с лечением образцов. Для каждой фракции соль буфера следует добавить для каждого образца до гомогенизации так, что каждый образец одинаково подвержены. Дозирование главное сломать вверх хроматина и помочь освободить связанных белков. Важно, чтобы убедиться, что гранулы проходит через наконечник пипетки. Особенно при использовании большее количество клеток, пеллетные chromatin сложно пройти через наконечник пипетки в первые несколько раз. Мы нашли, что кончик 1 мл работает лучше всего для этого, как с незначительными выстукивать кончика против нижней части микро пластиковых пробирок, мы можем составить гранулы в наконечник. После прохождения пеллетные chromatin через наконечник пятнадцать раз, Пелле должен плавно перемещаться по чаевые, хотя он не будет распустить. После инкубации пробы на льду и изоляции хроматина центрифугированием, удаление супернатант с 200 мкл кончиком пипетки позволяет для максимального удаления не нарушая пеллетные chromatin.
Хотя SSE требует технической согласованности, простой, простой и может быть выполнена с общими ресурсами лаборатории. Важно отметить, что истинная сила этого метода является, когда он сочетается с другими фенотипические экзаменов. Например используя эту технику, мы сравнили связывание профилей PBRM1, когда каждый из его шести bromodomains были мутировал, мы определили, что все, но один из bromodomains были вовлечены в привязке PBRM1 в той или иной степени7. Интригующе мы обнаружили, что bromodomains, которые являются наиболее важными для привязки также имеют важное значение для PBRM1 регуляции экспрессии генов и управления ячейки распространения7. Мы также утверждены изменения в привязке этих мутантов в дискретной геномной Локус количественных чип ПЦР-7.
Мы показали только несколько примеров как эта техника может использоваться для изучения взаимодействия протеин хроматину; Однако в нашей лаборатории, мы обнаружили, что SSE является универсальным инструментом для исследования широкий спектр вопросов, касающихся хроматина читателя белков. В сочетании с другими анализов, эта технология облегчает нашу способность пролить свет функциональность компонентов, составляющих эти разработки белковых комплексов. Понимая важность отдельных доменов, мы можем определить, являются ли они потенциальных терапевтических целей в области развития ингибитор, который блокирует хроматина ассоциации.
Мы продемонстрировали, как SSE может быть расширена оценить эффективность ингибитора маленькой молекулы белка привязке к хроматина. Кроме того запрещая эпигеномные писателей и ластики, SSE можно определить взаимосвязь между уровнями PTM и читатель белков. Мы также показали, что SSE может использоваться для определения изменений в привязку в ответ на внешние раздражители, такие как повреждения ДНК. Хотя это простой метод, когда применяется в надлежащих условиях, он может сильно заранее наши знания о хроматина и регуляторные белки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана премию ученый V (V2014-004) и V ученый плюс премии (D2016-030) от V Фонд исследований рака и американский рак общества институциональных исследовательский грант (ACS IRG Грант 58-006-53) к центру Университета Purdue для рака Исследования. E. G. P. было поддержано Borch выпускник Дотационный награду Purdue университета лекарственных химии и молекулярной фармакологии Департамента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes--many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
