Summary
أصبح يدرس القنوات الأيونية من خلال نظام معربا عن heterologously تقنية الأساسية في البحوث الطبية الحيوية. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم وسيلة فعالة وقت لتحقيق رقابة مشددة التعبير القناة الايونية عن طريق أداء ترنسفكأيشن عابرة تحت سيطرة المروج محرض.
Abstract
ترنسفكأيشن، وتسليم من الأحماض النووية الأجنبية في خلية، هو أداة قوية في مجال البحوث البروتين. من خلال هذه الطريقة، يمكن التحقيق القنوات الأيونية من خلال تحليل الكهربية، وتوصيف الكيمياء الحيوية، ودراسات طفرية، وتأثيرها على العمليات الخلوية. تعداء عابرة تقدم بروتوكول بسيط في الذي يصبح فيه البروتين المتاحة للتحليل في غضون بضع ساعات إلى أيام. على الرغم من أن يقدم هذا الأسلوب بروتوكول كفاءة واضحة والوقت نسبيا، واحدة من العناصر الأساسية ومعايرة التعبير عن الجينات التي تهم المستويات ذات الصلة الفسيولوجية أو المستويات التي هي مناسبة للتحليل. تحقيقا لهذه الغاية، وقد ظهرت العديد من الطرق المختلفة التي توفر القدرة على التحكم في التعبير عن الجينات في المصالح. توفر عدة مستقرة بروتوكولات خلية ترنسفكأيشن وسيلة لإدخال دائمة الجين في الجينوم الخلوي تحت تنظيم وtranscrip التي تسيطر عليها التتراسيكلينتفعيل tional. في حين أن هذا الأسلوب تنتج مستويات التعبير موثوق بها، كل الجينات في المصالح يتطلب بضعة أسابيع من العمل المهرة بما في ذلك معايرة منحنى القتل، واختيار من مستعمرات الخلايا، وأكثر عموما الموارد. هنا نقدم البروتوكول الذي يستخدم ترنسفكأيشن عابرة من المحتمل قناة الموجبة أعضاء فصيلة V جينات مستقبلات عابر 1 (TRPV1) في نظام محرض وسيلة فعالة للتعبير عن البروتين في الطريقة التي تسيطر عليها والتي لا غنى عنها في تحليل القناة الايونية. علينا أن نظهر أن استخدام هذه التقنية، ونحن قادرون على أداء التصوير الكالسيوم، خلية كاملة، وتحليل قناة واحدة مع مستويات قناة تسيطر المطلوبة لكل نوع من جمع البيانات مع ترنسفكأيشن واحد. وعموما، هذا يوفر تقنية قابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لدراسة هيكل القنوات الأيونية وظيفة.
Introduction
معربا عن Heterologously أنظمة هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لدراسة العديد من الوظائف الخلوية 1. جعلت لها الانظار الذاتية البروتين، ومتطلبات الحد الأدنى من الصيانة، والنمو موثوق بها، والقدرة على تناول وتعبير عن الحمض النووي الأجانب خطوط الخلايا مثل الجنينية البشرية الكلى (HEK293) والصينية الهامستر المبيض (CHO) تقريبا من الضروري ان الأبحاث البيولوجية 2 و 3. وتشمل مجالات البحث باستخدام أنظمة مغاير بروتينات الغشاء، مما يشير الى داخل الخلايا، والنشاط الأنزيمي. بعد ترنسفكأيشن من الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلية، والعديد من أشكال مختلفة من التحليل يمكن أن يؤديها، بما في ذلك الكهربية، والتصوير الكالسيوم ratiometric، لطخة غربية، الخ 4، 5.
ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة للأنظمة تعبير مغايرة، وكثير من احوقد وضعت الكواشف والمنتجات الشمالي للاستفادة من هذه الخلايا وصفاتهم 6. نظم تسليم الحمض النووي التي عابر أو دائم دمج الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلايا لدراسة البروتين دخيلة أصبحت واحدة من أكثر الأدوات شعبية ومفيدة للبحث البيولوجي. وبشكل أكثر تحديدا، ويستخدم على نطاق واسع transfecting عابر الحمض النووي في الخلية على أنها عملية بسيطة، مباشرة إلى الأمام التي تتطلب القليل نسبيا من الوقت والمواد. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة النجاح من الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن مرتفع 7. هذه التقنية هي موثوقة جدا عندما جنبا إلى جنب مع الجين علامة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، ويمكن استخدامها في العديد من التقنيات المختلفة مثل التصوير الكالسيوم والكهربية 5. للأسف، على الرغم من، معربا عن عابر الحمض النووي في الخلايا المضيفة يأتي مع بعض العثرات الرئيسية، وليس في الأقل مستوى التعبير في الخلية لا يمكن الاعتماد عليها. عدد النسخ من البلازميد اتخذت شص في الخلية لا يمكن السيطرة عليها، وبالتالي فإن التعبير بين التجارب الفردية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا 2. تصبح هذه قضية هامة عند أي محاولة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية، أو أداء تقنيات دقيقة لجمع البيانات.
كحل للمضاعفات المذكورة أعلاه، وقد تم تصميم بروتوكولات ترنسفكأيشن مستقرة يمكن من خلالها إدخال الجين في جينوم الخلية تحت رقابة مشددة من المروج محرض، مثل نظام التتراسيكلين التعبير كاظمة، وضمان واحد نسخة من البلازميد يدمج في جينوم كل خلية، ويعبر عنها إلا بعد تحريض آلية النسخ، على سبيل المثال، في حضور الدوكسيسيكلين. في حين أن هذا لا يحل العقبات من مستويات بروتين تعبير متناسقة، يفقد هذه الطريقة راحة بروتوكول سريعة وبسيطة نسبيا من تعداء عابر. إنشاء خط الخلية مستقرة يأخذ أسابيع قليلة على الأقل في حركتيح واحد يجب معايرة منحنى قتل من قبل المضادات الحيوية المحددة للحفاظ على التعبير البروتين وضمان التكامل بين ناقلات وبمهارة تحديد وتنمو المستعمرات الخلية. عموما هذا يأخذ مزيدا من الوقت والجهد مع انخفاض نسبة النجاح 8.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول المتوسطة التي تعتمد على نقاط القوة في كل من الخيارات ترنسفكأيشن شعبية لتوفير وسيلة بسيطة وفعالة للسيطرة على مستويات التعبير في أي خط الخلية محرض. مع الحفاظ على الخلايا مع نظام تيت محرض، نحن عابر transfect لدينا الجينات في المصالح، عابر مستقبلات المحتملة قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، ligated في ناقلات التي يمكن أن تجمع بين homologously مع نظام قامع. وبهذه الطريقة، يمكن إدخال الجين في الخلايا دون بدأوا يعبرون. فقط مع إضافة الدوكسيسيكلين لم تبدأ الجينات للتعبير، مما يسمح لنا لمعايرة مستويات البروتين EXPRession وفقا لتقنية أو المستويات التي سجلت في الظروف الفسيولوجية. كما يتجنب بروتوكول لدينا مضاعفات طويلة المرتبطة توليد خط خلية التعبير عن ثابت. نبدأ من خلال إظهار تغير مستويات تفعيل TRPV1 في التصوير الكالسيوم من الامم المتحدة التي يسببها من خلال أربع ساعات من تحريض وكيف ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يرتبط. نحن ثم تكرار البروتوكول في تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح، والتي تبين تيار متزايد مع زيادة الوقت من الاستقراء. وأخيرا، فإننا نقدم أمثلة من التسجيلات الكهربية قناة واحدة، وتبين أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتعبير تسيطر عليها عندما تبحث عن جمع البيانات الدقيقة على أساس الوحدات الفردية من البروتين. من خلال بروتوكول لدينا، ونحن نقدم وسيلة مريحة للسيطرة على التعبير البروتين في النظم مغاير مع تجنب المضاعفات زراعة الخلايا طويلة، وبالتالي توفير وسيلة للسيطرة على الأوضاع بين التجارب وتوفير موإعادة النتائج قابلة للتكرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ligating الجينات الاهتمام في الموقع كظوم من المتجهات
- الحصول على ناقلات محرض مثل pcDNA5 / FRT / للأو pcDNA4 / لل.
- تحليل الجينات في المصالح لأي تقييد مواقع يحتمل أن تكون عرضة في منتصف الجينات التي هي واردة أيضا في موقع استنساخ متعددة للناقلات التي اختارها في الحمض النووي SILICO تحليل البرمجيات 4.
- باستخدام تقنيات PCR تداخل معيار 4، تطويق الجينات في المصالح مع موقعين الاعتراف انزيم التقييد مختارة (التي لا توجد في الجين)، وهو أول إدراج قبل كودون البداية، والثاني بعد توقف كودون.
- هضم كل من ناقلات وتضاف مع الإنزيمات تقييد (المختار في الخطوة 1.2) في درجة حرارة الانزيمات 'لمدة ساعة واحدة، تليها إضافة حدة واحدة العجل الأمعاء الفوسفاتيز (CIP) إلى رد فعل ناقل فقط لمدة 30 دقيقة من أجل تجنب الذاتي ربط.
- تحميل الحمض النووي يهضم على هلام الاغاروز 1٪ وفصل قطاعات المشقوق من قبل الكهربائي 9.
- باستخدام الأشعة فوق البنفسجية، وقطع مع شفرة قطعة من هلام يحتوي على شرائح المرجوة من ناقلات وتضاف إلى أن ligated.
- استخراج شرائح الحمض النووي من القطع هلام الاغاروز (باستخدام المتاحة مجموعات استخراج الحمض النووي التجارية) وقياس تركيز النهائي من قبل معمل في 260 نانومتر.
- Ligate الجينات في المصالح في ناقلات مختارة محرض باستخدام T4 انزيم يغاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. من أجل زيادة احتمال إدراج ligating مع ناقلات، واستخدام نسبة 3: 1 المولي من إدراج: ناقل. للسيطرة، وإعداد رد فعل ربط يتضمن فقط النواقل.
- للتحول البكتيريا، إضافة 10 نانوغرام من ناقلات وحده، وناقلات + الجين في 50 ميكرولتر المختصة كولاي. احتضان أنبوب على الجليد لمدة 30 دقائق تليها 45 ثانية حضانة في درجة حرارة 42 درجة مئوية. المكان على الفور إلى الوراءعلى الجليد لمدة دقيقتين ونقل البكتيريا تتحول إلى 500 ميكرولتر LB المتوسطة. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة في 220 دورة في الدقيقة.
- لاختيار من البكتيريا تتحول بنجاح، لوحة 100 ميكرولتر من كل رد فعل (كما هو موضح في 1.9) على لوحة أجار LB مستعدة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند استخدام pCDNA4 / TR).
- السماح لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين عن طريق لف لهم بإحكام في فيلم البارافين البلاستيك.
- رفع المستعمرات الفردية باستخدام طرف 10 ميكرولتر، والسماح لتنمو بين عشية وضحاها في 3 مل LB + المتوسطة المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة في 220 دورة في الدقيقة. البكتيريا مع الحمض النووي من الفائدة قد يتم تجميد (-20 درجة مئوية) لمدة التخزين على المدى القصير بواسطة الطرد المركزي في LB والبكتيريا في 11000 x ج والشفط من طاف. يتطلب التخزين على المدى الطويل تجميد البكتيريا كما أسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي throuغ مصغرة الإعدادية وقياس تركيز النهائي من قبل معمل في 260 نانومتر 5.
- تأكيد الإدراج الناجح لجينة من الفائدة عن طريق تسلسل بناء تنقيته 4. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم الهضم التشخيص للبناء من الانزيمات تقييد استخدام الكهربائي لفصل قطع شرائح وتقييم وجودهم وطول لهذه الغاية (4).
2. زراعة خطوط خلية التعبير عن TetR
- الحصول على خط زراعة الخلايا إيواء البلازميد تيت كاظمة إدراجها في الحمض النووي الجيني. هنا سوف تكون مكتوبة بروتوكول باستخدام الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية (كلوة-293T) بإيواء pcDNA6 / TR البلازميد كمثال على ذلك.
- خلايا البذور في 100 ملم لوحة زراعة الأنسجة مع Dulbecco والنسور متوسطة التعديل (DMEM) تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ البنسلين، الستربتوميسين، 2 ملي لتر الجلوتامين، و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3 (هنا: DMEM كامل)، واحتضان O / N في 37 و# 176؛ ج و 5٪ CO 2. وينبغي أن يتم عن العمل مع الخلايا في غطاء محرك السيارة البيولوجي تحت ظروف معقمة.
- من أجل الحفاظ على التعبير عن الجينات تيت كاظمة، نضح في والمتوسطة واستبدالها مع DMEM كامل تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل blasticidin. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- مرة واحدة الخلايا تصل إلى 80-90٪ confluency، نضح المتوسطة ويغسل بلطف الخلايا مرتين مع DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- من أجل رفع بلطف الخلايا دون التسبب في الأضرار الميكانيكية، واحتضان الثقافة في DMEM تحتوي على 0.05٪ التربسين تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة.
- عرقلة عمل التربسين مع حجم مساو من DMEM كاملة. ماصة بلطف صعودا وهبوطا من أجل رفع الخلايا ونقلها إلى أنبوب العقيمة.
- الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف واستبدالها مع 1 مل كاملة DMEM. ماصة الحل مع الخلايا صعودا ونزولا حتى لاويمكن رؤية كتل الخلايا. عد وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- البذور 1-2 × 10 6 خلايا في 100 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 12 مل كاملة DMEM مع 5 ميكروغرام / مل blasticidin. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع لأنها تصل إلى 90٪ confluency.
3. Transfecting على البلازميد من الاهتمام إلى خلايا
- باستخدام نفس الأسلوب من خلايا تقسيم كما هو موضح أعلاه، نقل الخلايا إلى الآبار في لوحة 12-جيدا أعدت مع 0.9 مل كاملة DMEM، وتكون كافية لجعل 50٪ متموجة (~ 200000 خلايا)، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
- إعداد خليط ترنسفكأيشن مع pcDNA4 / TO تحتوي على الجينات في المصالح، البلازميد خامل، ليصبح إجمالي مبلغ الحمض النووي إلى 1 ميكروغرام (إذا لزم الأمر)، 3 ميكرولتر الدهون كاشف ترنسفكأيشن وDMEM لجعل الحجم النهائي 100 ميكرولتر. مبلغ الأمثل للDNA البلازميد ليتم استخدامها على نطاق واسع يختلف التعبير عن بروتينات مختلفة في فعالية مختلفة. للالمنتخبتجارب rophysiological، وتشمل EGFP في التعبير البلازميد الثدييات في كوكتيل ترنسفكأيشن من أجل رؤية الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن 4 بنجاح.
- احتضان الخليط ترنسفكأيشن في RT لمدة 30 دقيقة.
- Transfect الخلايا بواسطة pipetting الخليط ترنسفكأيشن قطرة من الحكمة على الخلايا مطلي في 12 لوحة جيدا والصخور لوحة بقوة لضمان تشتت متجانس من الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن. يجب أن تكون الخلايا ~ 80٪ متكدسة في وقت ترنسفكأيشن.
- احتضان خلايا transfected O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تأكد من أن الخلايا و transfected بنجاح من خلال مراقبة إشارة مضان EGFP تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في صباح اليوم التالي إذا أداء الكهربية.
4. خلايا الطلاء على بولي-D-ليسين (PDL) Coverslips / ويلز
- تعقيم 12 ملم coverslips من إخماد مع 70٪ من محلول الإيثانول الأيسوبروبيل. الجافة ووضع coversl احدالملكية الفكرية في كل بئر من 24 لوحة جيدا لتسجيل الكهربية.
- ماصة حل 0،1-0،2 ملغ / مل حل PDL على كل ساترة أو بئر من غرفة التصوير الكالسيوم.
- السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- يغسل مع ثقافة خلية الصف الماء المقطر المزدوج (أحواض دبي الجافة العالمية) ثلاث مرات، الشفط بين كل غسل. بعد غسل النهائي، يجف تماما والسماح للجلوس في RT.
- لالكهربية، وملء تحتوي كل منها على جانب ساترة PDL المغلفة مع 500 ميكرولتر كاملة DMEM تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
- تنفيذ نفس طريقة تقسيم خلايا transfected كما هو موضح أعلاه. بعد إعادة التعليق الخلايا بعد العلاج التربسين والحجب، ونقل 80 ميكرولتر من الخلايا (أو ما يقرب من 30000 الخلايا) إلى مركز كل ساترة PDL المغلفة لتسجيل الكهربية. تسمح للخلايا ليستقر على 1.5 ساعة على الأقل أو احتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- للكالسيوم نقل التصوير والبقعة 20 ميكرولتر من الخلايا (حوالي 20،000 الخلايا) إلى مركز كل PDL التصوير الكالسيوم المغلفة جيدا. تسمح للخلايا ليستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل، وإضافة 180 ميكرولتر DMEM الكامل إلى كل بئر.
5. تحريض التعبير الجيني
- يعد حل الأسهم الدوكسيسيكلين من 1 ملغ / مل في أحواض دبي الجافة العالمية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حافظ على حل الأسهم محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. للتخزين على المدى الطويل الحفاظ الدوكسيسيكلين الحل السهم عند -20 درجة مئوية.
- إعداد الطازجة 2 ميكروغرام / مل (الكهربية) أو 3 ميكروغرام / مل (التصوير الكالسيوم) حل الدوكسيسيكلين في DMEM كاملة ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- للتسجيلات الكهربية، ماصة 500 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين حل كل بئر لجعل تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. للتصوير الكالسيوم، إضافة 100 ميكرولتر من 3 ميكروغرام / مل من محلول الدوكسيسيكلين إلى كل بئر لجعل concentra النهائينشوئها من 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. أكتب ساعة الاستقراء.
- احتضان لكمية من الوقت المطلوب لتحريض عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
6. المعايرة الجدول الزمني للتعبير البروتين
- معايرة تعبير البروتين من خلال التصوير الكالسيوم 5، 10
- يعد حل رينغر (140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl 2، 2 ملي MgSO 4 و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم) ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد تشبع تركيزات قناة ناهض في حل رينغر. لأنه يخفف من كمية ناهض عندما تضاف إلى غرف التصوير الكالسيوم التي تحتوي على الخلايا وحل خارج الخلية، مضاعفة كمية التركيز النهائي المطلوب من ناهض. وهذا أيضا يجعل كمية من حل حمام في كل حاسمة جيدا للسيطرة.
- يعد حل غير الأيونية F-127 20٪ W / V في Dهيئة علماء المسلمين. الحرارة الحل إلى 40 درجة مئوية حتى يذوب غير الأيونية F-127. تخزين غير الأيونية F-127 حل في RT ودافئة إلى 40 درجة مئوية قبل الاستخدام. يستخدم غير الأيونية F-127 للمساعدة في تفريق acetoxymethyl (ص) استرات مؤشرات أيون الفلورسنت مثل FURA-2 في المحاليل المائية.
- نضح المتوسطة واستبدالها حل FURA-02:00 تحميل (حل رينغر تستكمل مع 2-3 ميكرومتر FURA-02:00، 0.02 ملغ / مل غير الأيونية F-127 و 10 ملم مد الجلوكوز).
- احتضان لمدة 60 دقيقة في RT في الظلام.
- نضح FURA-02:00 الحل وغسل الخلايا مع + 10 ملي حل مد الجلوكوز رينغر لإزالة الصبغة خارج الخلية. كرر هذه الخطوة مرتين.
- ترك + 10 ملي حل مد الجلوكوز 200 ميكرولتر قارع الأجراس في كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
- ضع دائرة على خشبة المسرح فوق المجهر الأنف قطعة وثبته مع حامل.
- تشغيل مصباح، وكاميرا ومجهر وحدد FURA-2 فلتر للكشف عن الانبعاثات في 510 نانومتر الرعاياelength.
- ضبط التكبير المطلوب وتركز الخلايا في الحقل المحدد.
- في الظلام، وطرح ضوء الخلفية وتعيين وقت التعرض.
- تعيين أخذ العينات الصورة في معدل وسجل مضان الاستجابة المطلوبة من FURA-2 خلايا تحميلها بواسطة مثيرة لهم في 340 و 380 نانومتر موجات. نسبة 340/380 إشارات مؤشرا للداخل الخلايا تركيز الكالسيوم 2+، وبالتالي أيضا للنشاط TRPV1.
- إضافة 2 ميكرومتر كشافات في حل 200 ميكرولتر رينغر قبل pipetting لخلق تركيز تشبع النهائي من 1 ميكرومتر كشافات من أجل تقييم مستوى التعبير عن TRPV1.
- تحليل استجابة TRPV1 وفقا لآخر الاستقراء وتحديد بروتوكول للبروتين من الفائدة.
- ضبط تعبير البروتين في النظم مغاير باستخدام تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح 4 و 11.
- إعداد رانه استحمام حل (ملم) 140 كلوريد الصوديوم، 2.3 بوكل، 2 MgSO 4، 5 HEPES، و 5 2- (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد تشبع تركيزات قناة ناهض في حل خارج الخلية.
- سحب أقطاب الزجاج مع القطر الداخلي (ID) من 1.10 ملم وقذائف تلميع لمقاومة 2-4 MΩ.
- يعد حل ماصة (ملم) 130 بوكل، 4 كلوريد الصوديوم، 2 MgSO 4، 0.5 CaCl 2، 1 EGTA و 10 HEPES تعديلها لدرجة الحموضة 7.2 مع KOH. تصفية حل ماصة قبل استخدامها. قبل كل تجربة، وملأت واحد، وإطلاق النار مصقول ماصة الزجاج الخلفي عن طريق غمر طرف في حل ماصة لمدة دقيقة على الأقل، ثم شغل باستخدام طرف ذاب وامتدت مع حقنة مليئة نفس الحل ماصة.
- رفع بلطف ساترة واحدة PDL المغلفة مع الخلايا مطلي من البئر إلى 35 مم طبق بتري بلاستيكية مملوءة ما يقرب من 2 حل حمام مل في RT. نلاحظ في ظل الجيش الشعبيالمجهر ط الفلورسنت.
- تحديد موقع الخلية إيجابية EGFP، كما تصور مع المجهر epifluorescent، على ساترة المعدة والانتقال إلى وسط الميدان تصور.
- إرفاق ماصة شغل لصاحب ماصة للmicromanipulator، وحقن كمية صغيرة من الضغط الإيجابي في النظام لتجنب التلوث من الحل ماصة داخل الخلايا. خفضه إلى ما فوق GFP - خلية إيجابية، والتحقق من المقاومة الصحيحة.
- كما اللمسات ماصة الخلية، وتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي من أجل إنشاء ختم GΩ بين ماصة الزجاج وغشاء الخلية.
- مع ذلك، نبضة قصيرة حادة من الشفط، وكسر غشاء الخلية، مما يتيح للماصة لتتلامس مع محتويات الخلايا من الخلية.
- تشغيل وضع مكبر للصوت لخلية كاملة، وخفض مرشح والإخراج مكاسب بسل إلى 1-5 كيلو هرتز و0.5α، على التوالي.
- تسجيل الاستجابة الحالية لتشبعتركيزات قناة ناهض باستخدام سلالم الجهد أو بروتوكول مجانا الفجوة.
- لأن الكفاءات التعبير تتغير بين مختلف البروتينات، كرر التسجيلات باستخدام مختلف الأوقات طول الاستقراء.
- تحديد زمن التحريض المثالي للتسجيلات قناة واحدة (4).
- يعد حل (ملم) 150 نا غلوكونات، 15 كلوريد الصوديوم، 5 EGTA، و 10 HEPES، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، كحل ماصة. من أجل حل الحمام، استخدام الحل من الخطوة 6.2.1.
- كرر الإجراء خلية كاملة باستخدام الرقم 0.86 ملم الماصات الزجاج المصقول النار على المقاومة من 10-12 MΩ ووضع عقد إمكانية -40 بالسيارات.
- إنشاء ختم على الغشاء كما هو موضح سابقا وتمزق الغشاء.
- باستخدام micromanipulator، ورفع ماصة مع التصحيح غشاء بعيدا عن الخلية.
- وضع نظام نضح مباشرة بجوار ماصة تحتوي على التصحيح الغشاء.
- ر أقلانه بسل تصفية والانتاج الربح إلى 2-5 كيلو هرتز و10α، على التوالي.
- يروي تشبع تركيزات ناهض على التصحيح الغشاء، وتقييم إذا كان التصحيح يحتوي على قنوات واحد أو أكثر وفقا لاستجابة.
- تحليل عدد من بقع قناة واحدة سجلت بنجاح ضد الساعة الحث تطبيقها على الخلايا. ضبط الوقت الاستقراء وفقا للنتائج المرجوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بسرعة لخلق نموذج التعبير محرض، التي قطعناها على أنفسنا استخدام الخلايا HEK293 التي تعبر عن بروتين التتراسيكلين كاظمة (TR) (على سبيل المثال، T-REX-293) وناقلات التي تحتوي على تسلسل المشغل التتراسيكلين (تيتو) بين المروج CMV وموقع استنساخ متعددة (على سبيل المثال، pcDNA4 / TO). عندما transfected إلى تريكس-293 الخلايا، وقمع التعبير عن الجينات في المصالح في pcDNA4 / لل، كما يربط TR إلى teto. مضيفا الدوكسيسيكلين إلى متوسطة يمنع TR-تيتو التفاعل، مما يسمح للتعبير عن بروتين transfected. للسيطرة على التعبير عن الفئران TRPV1 (rTRPV1) ونحن إدراج أول الجين هذه القناة إلى pcDNA4 / إلى المتجه باستخدام بروتوكول المبين أعلاه. بعد ذلك، و transfected T-REX-293 الخلايا مع rTRPV1- pcDNA4 / للالبلازميد وفقا للخطوات في النقطة 3 من البروتوكول. بعد ترنسفكأيشن، وكان المستحث rTRPV1 التعبير التي يحتضنها الخلايا في وجود الدوكسيسيكلين (1 μز / مل) 1 - 4 ساعات. الأهم من ذلك، تركيزات الدوكسيسيكلين مختلفة يمكن استخدامها لتحقيق معدل التعبير المطلوب. استخدمنا أساليب التصوير الكهربية والكالسيوم لتقييم مستوى التعبير rTRPV1 في كل نقطة زمنية من خلال تطبيق ناهض لها، كشافات. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وذلك باستخدام خلايا حية التصوير الكالسيوم، يتم زيادة مستوى الكالسيوم داخل الخلايا بعد تطبيق كشافات تدريجيا مع أوقات تحريض أطول. تنشيط الخلايا uninduced قد يعزى إلى تسرب القاعدية في النشاط TR، overexpression من البلازميد، أو التتراسيكلين المتبقية في مكونات الخلايا وسائل الإعلام. بعد ذلك، سجلنا التيارات من الخلايا باستخدام تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح تطبيق سلالم الجهد بين -80 بالسيارات إلى +80 بالسيارات. ويبين الشكل 2 أن يتم الحصول على سعة الحالية أعلى مع أوقات تحريض أطول. التشبع في السعة الحالية في 4 ساعات الاستقراء هو consisteالإقليم الشمالي مع تشبع ينظر في استجابة الكالسيوم (الشكل 1). وأخيرا، قمنا بتحليل مستويات التعبير rTRPV1 في التكوين الخارجي من تقنية التصحيح، المشبك. واحدة من صعوبات كبيرة في دراسة القناة الايونية هيكل الوظائف والوصول إلى مستويات التعبير مناسبة للتحليل على قناة واحدة. على أساس نشرت الوحدوي rTRPV1 تصرف 4، تم استخدام السعة الحالية المسجلة لتحديد عدد من القنوات في التصحيح المستأصل. كما هو مبين في الشكل (3)، وعدد من القنوات في زيادة رقعة بما يتناسب مع الوقت الدوكسيسيكلين الحضانة. بعد ساعة واحدة من تحريض، لم نكن قادرين على الكشف عن أي نشاط قناة (0 من أصل 8). ومع ذلك، في كل نقطة زمنية يومين وثلاث ساعات سجلنا النشاط قناة واحدة في معدلات نجاح مماثلة. وتجدر الإشارة، في حين ساعتين فإن معظم بقع لا تستجيب، في ثلاث ساعات وأظهرت معظم بقع احد إلى متعدد النشاط-قناة. فرص تسجيل قنوات متعددة بعد ثلاث ساعات من تحريض عالية، وبالتالي فإن الوقت الحث الأمثل لتسجيل التيار من قناة واحدة ما بين 2-3 ساعات في ظل الظروف المقدمة. معا تثبت هذه النتائج أن التعبير من القنوات الأيونية يمكن السيطرة عليها بإحكام وينظم بعد ترنسفكأيشن عابرة باستخدام هذا البروتوكول.
الشكل 1. استجابة الزيادات تفعيل TRPV1 وفقا لالتعريفي الوقت، كما تصور من خلال التصوير الكالسيوم. (A) الصور الزائفة الملون من T-REX-293 الخلايا معربا عن عابر rTRPV1، قبل ( 'بصل') وبعد كبخاخات التطبيق (2 ميكرومتر). تمثل أشرطة بيضاء 30 ميكرون. يشير شريط مقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. (ب) يتغير مع الزمن من مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في transfected T-REX-293 الخلايا المعالجة كما هو موضحفي A. يمثل كل رسم بياني في المتوسط من الخلايا الحساسة 50 كشافات. لاحظ الزيادة التدريجية في الردود كشافات فيما يتعلق الاستقراء الوقت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. TRPV1 الزيادات الحالية كنتيجة لزيادة الحث الوقت في كامل الخلية المشبك التصحيح تسجيلات. (A) تسجيلات خلية كاملة من T-REX-293 transfected عابر مع rTRPV1 في إمكانية عقد -40 بالسيارات. وقد حثت الخلايا مع الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل) للمرة المحددة ومن ثم تتعرض لكشافات ( 'كاب'؛ شريط أحمر، 1 ميكرومتر). يظهر هو تتبع ممثل من 6-11 تسجيلات المستقلة. (ب) متوسط / مبعثر مؤامرة نقطة تمثل السعة خلية كاملة أثار كما هو مبين في A. الإحصاءتم تحديد آل أهمية بين الجماعات مع أنوفا مع مقارنات متعددة، حيث *** يمثل ص ≤0.001 وns- يست ذات أهمية إحصائية (ن = 6-11 خلايا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. نسبة النجاح من واحدة تصحيح القناة في TRPV1 تسجيلات يعتمد على الحث الوقت. (A) تسجيلات خارج الخروج من T-REX-293 transfected عابر مع rTRPV1 في إمكانية عقد +50 بالسيارات. وقد حثت الخلايا مع الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل) للمرة المحددة وتعرضوا لكشافات ( 'كاب'؛ شريط أحمر، 1 ميكرومتر). يظهر هو تتبع ممثل من 6-9 تسجيلات المستقلة. (ب) متوسط / مبعثر نقطة مؤامرة يمثل عدد من القنوات في التصحيح المستأصل كماهو مبين في A. أهمية إحصائية بين مجموعات تقرر مع أنوفا مع مقارنات متعددة، حيث *** يمثل ص ≤0.001 وns- يست ذات أهمية إحصائية (ن = 6-9 خلايا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ترنسفكأيشن هو بروتوكول يستخدم على نطاق واسع للتعبير البروتين والبحوث، مع العديد من الأشكال المختلفة لتحسين الاتساق التعبير والاستقرار. توفر الكواشف ترنسفكأيشن عابرة بسيطة وسهلة لاستخدام بروتوكول حيث يمكن تحليل الخلايا والبروتين من الفائدة خلال ساعات ليلة وضحاها من وقت ترنسفكأيشن. للأسف هذا النهج لا يمكن التنبؤ عندما طريقة التحليل يتطلب مستوى ثابت من التعبير البروتين، مثل تسجيلات قناة واحدة في الكهربية 2. بدلا من ذلك، وقد وضعت خطوط الخلايا مستقرة في ظل نظام التعبير كظوم التتراسيكلين لتقديم وسيلة للتحكم في مستوى التعبير عن بروتين من الفائدة 12. ويوفر هذا النهج التعبير ثابت من جميع الخلايا في الثقافة مع الأخذ التتراسيكلين المستمدة ملحق، مثل الدوكسيسيكلين. في حين أن هذا يسمح للسيطرة متسقة ودقيقة من مستويات البروتين، رانه الوقت والجهد الذي يذهب في لانشاء خط الخلية مستقرة يجعل من غير مريح وغير صالحها عند دراسة مجموعة واسعة من البروتينات 8.
بروتوكول المعروضة هنا يقدم حلا وسط من بين الطرق إلى البروتوكولات ترنسفكأيشن الحالية المقدمة. قبل transfecting عابر الجينات تحت المروج التحكم في الخلايا التي تمتلك قامع تيت، يمكننا تحقيق التعبير السيطرة عليها مع تجنب إجراءات طويلة ومعقدة. هنا، استخدمنا غير انتقائي TRPV1 قناة الموجبة مع التصوير الكالسيوم وتحليل الكهربية. لقد وجدنا أن الوقت تحريض مثالية للتعبير يسيطر هذا البروتين محددة لتحليل قناة واحدة كان بين 2-3 ساعات الحضانة مع 1 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين (الشكلان 1-3). على نطاق أوسع، ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية إلى أي بروتين من الفائدة. كما يوفر هذا البروتوكول إلى حل للسيطرة على التعبير عندما لارجنرال الكتريك مجموعة من البروتينات أو الطفرات في تسلسل البروتين المختلفة والمصالح وإنشاء خط خلية مستقر لكل البديل هو غير عملي. الأهم من ذلك، في حين أن النتائج هنا يمثل الوقت الأمثل وتركيز ينطبق على التعبير TRPV1، كل جين له الفرد ومحددة الترجمة والاتجار سرعة، وبالتالي فإن المعايرة والتعبير الأوقات من كل من البروتين تختلف إلى حد كبير (13).
في حين أن هذا الأسلوب يوفر حلا ملائما في التعبير تسيطر عليها، فإنه ليس من دون قيود. تجاريا فقط من خطوط الخلايا المتاحة إيواء نظام تيت يمكن استخدامها مع هذا النظام، الذي يمثل مشكلة إذا كانت هذه خطوط الخلايا معينة غير مناسبة لنوع من التحليل الذي يتعين القيام بها. مأزق آخر بالمقارنة مع خطوط ستابلي هو أن ليس كل الخلايا تخضع ترنسفكأيشن، وبالتالي ليس كل الخلايا التعبير عن بروتين من الفائدة. عموما، ونحن نقدم وسيلة مريحة للسيطرة على البروتين هxpression في نظام مغاير التي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من البحوث الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل [المنح 1721-1712، 1368-1312، و1444-1416] (لا ف ب). ويتبع AP مع مركز Brettler وديفيد ر مركز بلوم، كلية الصيدلة، جامعة العبرية في القدس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
