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Genetics

Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55370
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Institute for Drug Research (IDR), School of Pharmacy, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem (HUJI)
* These authors contributed equally

Summary

एक heterologously व्यक्त प्रणाली के माध्यम से अध्ययन आयन चैनल जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक कोर तकनीक बन गया है। इस पांडुलिपि में, हम एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण के तहत क्षणिक अभिकर्मक प्रदर्शन से कसकर नियंत्रित आयन चैनल अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक समय कुशल तरीका मौजूद है।

Abstract

अभिकर्मक, एक सेल में विदेशी न्यूक्लिक एसिड का वितरण, प्रोटीन अनुसंधान के क्षेत्र में एक शक्तिशाली उपकरण है। इस विधि के माध्यम से, आयन चैनल electrophysiological विश्लेषण, जैव रासायनिक लक्षण वर्णन, mutational अध्ययन, और सेलुलर प्रक्रियाओं पर उनके प्रभाव के माध्यम से जांच की जा सकती है। क्षणिक transfections एक साधारण प्रोटोकॉल जिसमें प्रोटीन दिनों के लिए कुछ ही घंटों के भीतर विश्लेषण के लिए उपलब्ध हो जाता है प्रदान करते हैं। हालांकि इस पद्धति का एक अपेक्षाकृत सरल और समय कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, महत्वपूर्ण घटकों में से एक शारीरिक प्रासंगिक स्तर या स्तर है कि विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं के लिए ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति औजार है। यह अंत करने के लिए कई अलग अलग दृष्टिकोण है कि ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने की क्षमता प्रदान करते उभरा है। कई स्थिर सेल अभिकर्मक प्रोटोकॉल एक तरह से स्थायी रूप से एक टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transcrip के नियमन के तहत सेलुलर जीनोम में ब्याज की एक जीन लागू करने के लिए प्रदान करते हैंराष्ट्रीय सक्रियण। हालांकि इस तकनीक विश्वसनीय अभिव्यक्ति के स्तर पैदा करता है, ब्याज की प्रत्येक जीन एक की हत्या की अवस्था की जांच, सेल कालोनियों के चयन, और समग्र और अधिक संसाधनों सहित कुशल काम के कुछ ही सप्ताह की आवश्यकता है। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल एक कारगर तरीका एक नियंत्रित तरीके से जो आयन चैनल विश्लेषण करने में आवश्यक है में एक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए के रूप में एक inducible प्रणाली में क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1) जीन के क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करता है प्रस्तुत करते हैं। हम दिखाना है कि इस तकनीक का उपयोग, हम नियंत्रित चैनल एक एकल अभिकर्मक के साथ डेटा संग्रह के प्रत्येक प्रकार के लिए आवश्यक स्तर के साथ कैल्शियम इमेजिंग, पूरे सेल, और एक चैनल विश्लेषण प्रदर्शन करने में सक्षम हैं। कुल मिलाकर, यह एक दोहराया कि तकनीक आयन चैनल संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

Heterologously व्यक्त सिस्टम सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक सेलुलर कार्यों 1 के एक भीड़ का अध्ययन करने से एक है। उनके कम अंतर्जात प्रोटीन प्रोफाइल, कम से कम रखरखाव आवश्यकताओं, विश्वसनीय विकास, और हाथ में ले लिया और विदेशी डीएनए व्यक्त करने की क्षमता में इस तरह के मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) और चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो) जैविक अनुसंधान के 2, 3 के लिए लगभग अनिवार्य रूप सेल लाइनों बना दिया है। heterologous सिस्टम का उपयोग कर अनुसंधान के क्षेत्रों झिल्ली प्रोटीन, intracellular संकेतन, और enzymatic गतिविधि में शामिल हैं। सेल में विदेशी डीएनए के अभिकर्मक के बाद के विश्लेषण के कई अलग अलग रूपों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, ratiometric कैल्शियम इमेजिंग, पश्चिमी धब्बा, आदि 4, 5, सहित किया जा सकता है।

heterologous अभिव्यक्ति की व्यवस्था के लिए संभावित आवेदनों की एक विस्तृत सरणी के लिए, कई विभिन्न कारणNT अभिकर्मकों और उत्पादों इन कोशिकाओं और उनके गुणों 6 उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है। डीएनए वितरण प्रणाली है कि क्षणिक या स्थायी रूप से कोशिकाओं में विदेशी डीएनए एकीकृत exogenous प्रोटीन का अध्ययन करने के जैविक अनुसंधान के लिए सबसे लोकप्रिय और उपयोगी उपकरणों में से एक बन गया है। अधिक विशेष रूप से, एक सेल में क्षणिक परासंक्रमित डीएनए व्यापक रूप से एक सरल, सीधे आगे की प्रक्रिया है कि अपेक्षाकृत कम समय और सामग्री की आवश्यकता के रूप में प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की सफलता दर है कि अभिकर्मक से गुजरना उच्च 7 है। यह तकनीक बहुत विश्वसनीय है जब इस तरह हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक जीन मार्कर के साथ संयुक्त, और जैसे कैल्शियम इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 5 के रूप में कई विभिन्न तकनीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, हालांकि, क्षणिक मेजबान कोशिकाओं में डीएनए को व्यक्त करने के कुछ प्रमुख नुकसान से, कम से कम नहीं है कि सेल प्रति अभिव्यक्ति के स्तर अविश्वसनीय है में आता है। प्लास्मिड डीएनए की प्रतियों की संख्या यू लियासेल प्रति पी बेकाबू है, इस प्रकार अलग-अलग प्रयोगों के बीच अभिव्यक्ति की बहुत 2 भिन्न हो सकते हैं। जब या तो शारीरिक शर्तों को दोहराने की कोशिश, या सटीक डेटा संग्रह तकनीकों प्रदर्शन कर इस मुद्दे महत्वपूर्ण हो जाता है।

जटिलताओं से ऊपर उल्लेख किया है, स्थिर अभिकर्मक प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया है, जिसमें ब्याज की एक जीन में इस तरह के एक टेट्रासाइक्लिन repressor अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में एक inducible प्रमोटर की तंग नियंत्रण के अधीन एक कोशिका के जीनोम में डाला जा सकता है के लिए एक समाधान है, एक भी सुनिश्चित रूप प्लाज्मिड की प्रतिलिपि प्रत्येक कोशिका के जीनोम में एकीकृत करता है और केवल प्रतिलेखन तंत्र के शामिल होने के बाद डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में, उदाहरण के लिए, व्यक्त की है। इस असंगत प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की बाधाओं को हल करती है, वहीं इस विधि क्षणिक transfections का त्वरित और अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल की सुविधा खो देता है। एक स्थिर सेल लाइन की स्थापना जो में कम से कम कुछ सप्ताह लग जाते हैंज एक एक की हत्या वक्र विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा निर्धारित प्रोटीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए और वेक्टर के एकीकरण को सुनिश्चित करने और कुशलता का चयन करें और सेल कालोनियों बढ़ने जांचना चाहिए। कुल मिलाकर यह एक कम सफलता दर 8 के साथ काफी अधिक समय और प्रयास लेता है।

यहाँ, हम एक मध्यवर्ती प्रोटोकॉल है कि लोकप्रिय अभिकर्मक विकल्पों में से दोनों की ताकत पर छोड़ता है किसी भी inducible सेल लाइन में अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करने के लिए परिचय। एक inducible tet प्रणाली के साथ कोशिकाओं को बनाए रखते हुए, हम क्षणिक ब्याज की हमारे जीन, क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1), एक वेक्टर कि homologously repressor प्रणाली के साथ गठबंधन कर सकते हैं में ligated transfect। इस तरह, जीन व्यक्त करने के लिए शुरुआत के बिना कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है। केवल डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा के साथ जीन प्रोटीन expr के स्तर को जांच करने के लिए हमें की अनुमति का इजहार करने के लिए शुरू होता है,तकनीक या शारीरिक स्थितियों में मनाया स्तर के अनुसार ession। हमारी प्रोटोकॉल भी एक स्थिरतापूर्वक व्यक्त सेल लाइन पैदा करने के साथ जुड़े लंबा जटिलताओं से बचा जाता है। हम से कैल्शियम इमेजिंग में TRPV1 सक्रियण के बदलते स्तर दिखा द्वारा शुरू करते हैं संयुक्त राष्ट्र प्रेरित प्रेरण और कैसे intracellular कैल्शियम के स्तर में वृद्धि संबद्ध के चार घंटे के माध्यम से। हम तो पैच दबाना तकनीक के पूरे सेल विन्यास में प्रोटोकॉल नकल, प्रेरण के समय में वृद्धि के साथ वर्तमान में वृद्धि को दर्शाता है। अंत में, हम एक चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, और दिखाने के लिए इस तकनीक को नियंत्रित अभिव्यक्ति के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि जब प्रोटीन की अलग-अलग इकाइयों के आधार पर सटीक डाटा संग्रह के लिए लग रही है। हमारे प्रोटोकॉल के माध्यम से, हम heterologous प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, जबकि लंबी सेल संस्कृति की जटिलताओं से बचने के लिए, इस प्रकार के प्रयोगों और प्रदान मो के बीच की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक तरह से उपलब्ध कराने की पेशकश करते हैंदोहराया परिणाम रहे हैं।

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Protocol

1. वेक्टर के repressible साइट में ब्याज की जीन ligating

  1. / के लिए इस तरह pcDNA5 / FRT / करने के लिए या pcDNA4 के रूप में एक inducible वेक्टर प्राप्त करते हैं।
  2. सिलिको डीएनए विश्लेषण सॉफ्टवेयर 4 में से जीन है कि भी चुना वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट में चित्रित कर रहे हैं के बीच में किसी भी संभावित अतिसंवेदनशील प्रतिबंध साइटों के लिए ब्याज की जीन का विश्लेषण।
  3. का उपयोग कर मानक ओवरलैप पीसीआर तकनीक 4, दो चयनित प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों (कि ब्याज की जीन में नहीं पाए जाते हैं) के साथ ब्याज की जीन, पहले शुरू कोडोन से पहले डाला, और स्टॉप कोडोन के बाद दूसरी दिशा।
  4. दोनों वेक्टर डाइजेस्ट और व्यवस्था स्वयं से बचने के लिए केवल 30 मिनट के लिए वेक्टर प्रतिक्रिया करने के लिए एक घंटे के लिए एंजाइमों 'काम कर रहे तापमान, एक इकाई बछड़ा आंत फॉस्फेट (सीआईपी) के अलावा द्वारा पीछा पर प्रतिबंध एंजाइमों (1.2 चरण में चुना) के साथ सम्मिलित बंधाव।
  5. एक 1% agarose जेल पर पचा डीएनए लोड और वैद्युतकणसंचलन 9 द्वारा cleaved खंडों अलग।
  6. पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करना, एक ब्लेड के साथ वेक्टर के वांछित खंडों युक्त जेल के टुकड़े में कटौती और ligated जा करने के लिए डालें।
  7. agarose जेल टुकड़े से डीएनए खंडों (वाणिज्यिक उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर) निकालने और 260 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा उनके अंतिम एकाग्रता को मापने।
  8. inducible चयन किया वेक्टर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर टी -4 ligase एंजाइम का उपयोग करने में ब्याज की जीन ligate। डालने का 1 दाढ़ अनुपात: वेक्टर आदेश डालने वेक्टर साथ ligating की संभावना बढ़ाने के लिए, एक 3 का उपयोग करें। नियंत्रण के लिए, एक बंधाव प्रतिक्रिया है कि केवल वेक्टर शामिल तैयार करते हैं।
  9. जीवाणु परिवर्तन के लिए, 50 μL सक्षम ई कोलाई में अकेले वेक्टर और वेक्टर + जीन की 10 एनजी जोड़ें। 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड ऊष्मायन द्वारा पीछा 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब सेते हैं। इसके तत्काल बाद वापस जगहदो मिनट के लिए बर्फ पर और 500 μL लेग माध्यम के लिए बदल बैक्टीरिया हस्तांतरण। 220 rpm पर आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए सेते हैं।
  10. सफलतापूर्वक तब्दील बैक्टीरिया के चयन के लिए, थाली तैयार लेग अगर उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त थाली पर प्रत्येक प्रतिक्रिया (1.9 में वर्णित) के 100 μL (जैसे, 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन pCDNA4 / टी.आर. का उपयोग करते समय)।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकसित करने की अनुमति दें। प्लेट्स कसकर उन्हें प्लास्टिक आयल फिल्म में लपेटकर द्वारा अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  12. व्यक्ति एक 10 μL टिप का उपयोग कर कालोनियों लिफ्ट, और रात में 220 rpm पर आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एमएल लेग + एंटीबायोटिक माध्यम में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। ब्याज की डीएनए के साथ बैक्टीरिया जमा किया जा सकता है (-20 डिग्री सेल्सियस) 11,000 XG पर पौंड और बैक्टीरिया centrifuging और सतह पर तैरनेवाला बाहर श्वास द्वारा लघु अवधि के भंडारण के लिए। दीर्घकालिक भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में बैक्टीरिया ठंड की आवश्यकता है।
  13. throu डीएनए निकालेंजीएच मिनी प्रस्तुत करने और 260 एनएम 5 पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा अंतिम एकाग्रता को मापने।
  14. शुद्ध निर्माण 4 अनुक्रमण द्वारा ब्याज की जीन के सफल प्रविष्टि की पुष्टि करें। वैकल्पिक रूप से, वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर काट खंडों को अलग किया और उनकी उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों और लंबाई से निर्माण के नैदानिक पाचन भी यह अंत करने के लिए 4 उपयोग किया जा सकता है।

2. संवर्धन सेल लाइन्स tetr जताते

  1. एक Tet repressor प्लाज्मिड उनकी जीनोमिक डीएनए में शामिल किया शरण देने के लिए एक सेल संस्कृति लाइन प्राप्त करते हैं। इस के साथ साथ प्रोटोकॉल मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं (HEK-293T) एक उदाहरण के रूप में pcDNA6 / टी.आर. प्लाज्मिड को शरण देने का उपयोग करते हुए लिखा जाएगा।
  2. Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) के साथ 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेट में बीज कोशिकाओं 10% FBS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, और 25 मिमी HEPES, पीएच 7.3 (यहाँ: पूर्ण DMEM) और हे सेते / 37 एवं निकोबार# 176; सेल्सियस और 5% सीओ 2। कोशिकाओं के साथ सभी काम बाँझ शर्तों के तहत एक जैविक हुड में किया जाना चाहिए।
  3. आदेश, Tet repressor जीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के मध्यम aspirate और 5 माइक्रोग्राम / एमएल blasticidin साथ पूरक पूर्ण DMEM के साथ इसे बदलने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. एक बार कोशिकाओं 80 तक पहुंच - 90% confluency, मध्यम aspirate और धीरे (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने के 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
  5. आदेश धीरे, यांत्रिक क्षति के कारण के बिना कोशिकाओं उठा DMEM 0.05% trypsin युक्त संस्कृति सेते में 1.5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
  6. पूर्ण DMEM के एक बराबर मात्रा के साथ trypsin कार्रवाई ब्लॉक। धीरे विंदुक ऊपर और व्यवस्था की कोशिकाओं उठा और उन्हें एक बाँझ ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए नीचे।
  7. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1 एमएल पूर्ण DMEM के साथ बदलें। कोशिकाओं के साथ समाधान ऊपर और नीचे पिपेट कोई तकसेल clumps देखा जा सकता है। गणना और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना।
  9. बीज 1 - 2 एक्स 10 100 मिमी टिशू कल्चर 5 माइक्रोग्राम / एमएल blasticidin के साथ 12 एमएल पूर्ण DMEM युक्त डिश में 6 कोशिकाओं। एक सप्ताह में दो बार कोशिकाओं के विभाजन के रूप में वे 90% confluency तक पहुँचने।

3. कोशिकाओं में ब्याज की प्लाज्मिड Transfecting

  1. ऊपर के रूप में एक 12 अच्छी तरह से थाली 0.9 एमएल पूर्ण DMEM के साथ तैयार में कुओं कोशिकाओं स्थानांतरण वर्णित है, बंटवारे कोशिकाओं की एक ही विधि का प्रयोग, पर्याप्त 50% मिला हुआ (~ 200,000 कोशिकाओं) बनाने के लिए और एक सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते इनक्यूबेटर।
  2. pcDNA4 के साथ एक अभिकर्मक मिश्रण तैयार / ब्याज की जीन युक्त करने के लिए, एक निष्क्रिय प्लाज्मिड कुल डीएनए राशि 1 माइक्रोग्राम (यदि आवश्यक हो), 3 μL लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक और DMEM के लिए अंतिम मात्रा 100 μL बनाने के लिए लाने के लिए। प्लास्मिड डीएनए के अधिकतम राशि का इस्तेमाल किया जा करने के लिए व्यापक रूप से भिन्न रूप में अलग अलग प्रोटीन दक्षता में व्यक्त करते हैं। चुनाव के लिएrophysiological प्रयोगों, आदेश कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक अभिकर्मक 4 गुजरना कल्पना करने में अभिकर्मक कॉकटेल में स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में EGFP शामिल हैं।
  3. 30 मिनट के लिए आरटी पर अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं।
  4. 12 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया कोशिकाओं पर अभिकर्मक मिश्रण pipetting बूंद के लिहाज से कोशिकाओं transfect और सख्ती की थाली रॉक डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक के एक समरूप फैलाव सुनिश्चित करने के लिए। प्रकोष्ठों ~ अभिकर्मक के समय में 80% मिला हुआ होना चाहिए।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं हे / एन सेते हैं और 5% सीओ 2।
  6. पुष्टि करें कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक निम्नलिखित सुबह यूवी दीपक के तहत EGFP के प्रतिदीप्ति संकेत अवलोकन यदि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रदर्शन से ट्रांसफ़ेक्ट थे।

4. पाली-डी lysine (पीडीएल) पर चढ़ाना कोशिकाओं Coverslips / वेल्स

  1. 70% isopropyl इथेनॉल समाधान के साथ dousing द्वारा 12 मिमी coverslips जीवाणुरहित। सूखी और एक ही जगह coverslelectrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में आईपी।
  2. प्रत्येक coverslip या एक कैल्शियम इमेजिंग कक्ष की अच्छी तरह पर 0.2 मिलीग्राम / एमएल पीडीएल समाधान - 0.1 का एक समाधान पिपेट।
  3. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें।
  4. सेल संस्कृति ग्रेड दोहरा आसुत जल (DDW) तीन बार से धो लें, प्रत्येक धोने के बीच श्वास। अंतिम धोने के बाद अच्छी तरह से सूखे और आरटी पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, 500 μL पूर्ण DMEM के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त एक पीडीएल लेपित coverslip भरने के 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
  6. जैसा कि ऊपर वर्णित ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को विभाजित करने की एक ही विधि का प्रदर्शन। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए प्रत्येक पीडीएल लेपित coverslip के केंद्र के लिए trypsin उपचार और अवरुद्ध, हस्तांतरण कोशिकाओं (या लगभग 30,000 कोशिकाओं) का 80 μL निम्नलिखित कोशिकाओं resuspending के बाद। कोशिकाओं में कम से कम 1.5 घंटे के लिए समझौता या एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते करने की अनुमति दें।
  7. अच्छी तरह से प्रत्येक पीडीएल लेपित कैल्शियम इमेजिंग के केंद्र के लिए कैल्शियम इमेजिंग हस्तांतरण और कोशिकाओं की जगह 20 μL (लगभग 20,000 कोशिकाओं) के लिए। कोशिकाओं को कम से कम 30 मिनट के लिए व्यवस्थित और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 180 μL पूर्ण DMEM जोड़ने की अनुमति दें।

5. उत्प्रेरण जीन एक्सप्रेशन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार DDW में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक डॉक्सीसाइक्लिन शेयर समाधान तैयार है। शेयर समाधान के लिए 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित रखें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर डॉक्सीसाइक्लिन शेयर समाधान रखें।
  2. एक ताजा 2 माइक्रोग्राम / एमएल (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) या पूर्ण DMEM में 3 माइक्रोग्राम / एमएल (कैल्शियम इमेजिंग) डॉक्सीसाइक्लिन समाधान तैयार है और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए यह गर्म है।
  3. electrophysiological रिकॉर्डिंग, पिपेट के लिए 2 माइक्रोग्राम से प्रत्येक के लिए / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन समाधान के 500 μL अच्छी तरह से 1 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए। कैल्शियम इमेजिंग के लिए, एक अंतिम concentra बनाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 3 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन समाधान के 100 μL जोड़ने1 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन के tion। नीचे प्रेरण के घंटे लिखें।
  4. वांछित 37 डिग्री सेल्सियस पर शामिल करने के लिए समय की राशि है और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।

6. प्रोटीन अभिव्यक्ति की टाइमलाइन औजार

  1. कैल्शियम इमेजिंग 5, 10 के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति औजार
    1. घंटी समाधान (140 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1.8 मिमी CaCl 2, 2 मिमी MgSO 4, 20 मिमी HEPES, पीएच NaOH के साथ 7.4 करने के लिए समायोजित) है और यह गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तैयार करें।
    2. घंटी समाधान में चैनल एगोनिस्ट की सांद्रता saturating तैयार करें। क्योंकि एगोनिस्ट की राशि जब कैल्शियम इमेजिंग कक्षों सेल और बाह्य समाधान युक्त करने के लिए जोड़ा पतला है, एगोनिस्ट के वांछित अंतिम एकाग्रता की राशि दोगुना है। यह भी एक अच्छी तरह से महत्वपूर्ण नियंत्रण करने में स्नान समाधान की राशि में आता है।
    3. गैर ईओण एफ 127 20% विकास में डब्ल्यू / वी के एक समाधान तैयारएमएसओ। जब तक गैर ईओण एफ 127 भंग कर रहा है 40 डिग्री सेल्सियस का हल हीट। स्टोर आरटी पर गैर ईओण एफ 127 समाधान और 40 डिग्री सेल्सियस के लिए यह प्रयोग करने से पहले गर्म। गैर ईओण एफ 127 फैलाने acetoxymethyl (AM) ऐसे Fura-2 जलीय समाधान के रूप में फ्लोरोसेंट आयन संकेतक के एस्टर मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    4. महाप्राण मध्यम और Fura-02:00 लोड हो रहा है समाधान के साथ बदलें (घंटी समाधान 2 के साथ पूरक - 3 माइक्रोन Fura-2 है, 0.02 मिलीग्राम / एमएल गैर ईओण एफ 127 और 10 मिमी डी ग्लूकोज)।
    5. अंधेरे में आरटी पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. घंटी + 10 मिमी डी ग्लूकोज समाधान के साथ महाप्राण Fura-02:00 समाधान और धोने कोशिकाओं को बाह्य डाई हटा दें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
    7. 200 μL घंटी + 10 मिमी प्रत्येक में डी ग्लूकोज समाधान अच्छी तरह से छोड़ दो और अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. माइक्रोस्कोप नाक टुकड़ा ऊपर मंच पर चैम्बर जगह है और धारक के साथ सुरक्षित।
    9. दीपक, कैमरा और माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और 510 एनएम wav पर उत्सर्जन का पता लगाने के लिए चयन Fura-2 फिल्टरelength।
    10. वांछित बढ़ाई के लिए समायोजित करें और चयनित क्षेत्र में कोशिकाओं ध्यान केंद्रित।
    11. अंधेरे में, पृष्ठभूमि प्रकाश घटाना और जोखिम समय निर्धारित किया है।
    12. वांछित दर और रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति 340 और 380 एनएम तरंगदैर्ध्य पर रोमांचक उनके द्वारा Fura -2 भरी हुई कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर चित्र नमूने निर्धारित करें। 340/380 संकेतों के अनुपात TRPV1 गतिविधि के लिए intracellular सीए 2 + एकाग्रता के लिए एक संकेत है और इस प्रकार भी है।
    13. आदेश TRPV1 की अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने में 1 माइक्रोन capsaicin के अंतिम saturating एकाग्रता बनाने के लिए pipetting द्वारा 200 μL घंटी समाधान में 2 माइक्रोन capsaicin जोड़ें।
    14. प्रेरण समय के अनुसार TRPV1 प्रतिक्रिया का विश्लेषण करें और ब्याज की प्रोटीन के लिए प्रोटोकॉल का निर्धारण।
  2. Heterologous प्रणालियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का समायोजन पैच दबाना तकनीक 4, 11 के पूरे सेल विन्यास का उपयोग कर।
    1. टी तैयारवह NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित (मिमी) 140 NaCl, 2.3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES, और 5 2- (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस), के समाधान के स्नान।
    2. कोशिकी समाधान में चैनल एगोनिस्ट की सांद्रता saturating तैयार करें।
    3. 4 MΩ - एक आंतरिक व्यास 1.10 मिमी (आईडी) और 2 के एक प्रतिरोध करने के लिए आग पॉलिश के साथ कांच इलेक्ट्रोड खींचो।
    4. (मिमी) 130 KCl, 4 सोडियम क्लोराइड की एक पिपेट समाधान तैयार 2 MgSO 4, 0.5 CaCl 2, 1 EGTA और 10 HEPES पीएच 7.2 KOH के साथ समायोजित। पिपेट समाधान का उपयोग करने से पहले फ़िल्टर। एक प्रयोग करने से पहले, एक एकल, आग पॉलिश कांच पिपेट वापस कम से कम एक मिनट के लिए पिपेट समाधान में टिप जलमग्न से भर जाता है, और फिर उसी पिपेट समाधान के साथ भरा एक सिरिंज के साथ पिघल गए और बढ़ाकर टिप का उपयोग कर भर दिया।
    5. धीरे से एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री आरटी पर लगभग 2 एमएल स्नान समाधान के साथ भरा डिश के लिए अच्छी तरह से चढ़ाया कोशिकाओं के साथ एक एकल पीडीएल लेपित coverslip उठा। एक ईपी के तहत निरीक्षणमैं फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप।
    6. एक EGFP सकारात्मक सेल जानें, के रूप में epifluorescent खुर्दबीन के साथ कल्पना, तैयार coverslip पर और कल्पना क्षेत्र के केंद्र के लिए कदम।
    7. micromanipulator के पिपेट धारक को भरा पिपेट देते हैं, और इस प्रणाली में सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि इंजेक्षन intracellular पिपेट समाधान के संक्रमण से बचने के लिए। सिर्फ GFP ऊपर करने के लिए यह कम - सकारात्मक सेल, उचित प्रतिरोध के लिए जाँच।
    8. पिपेट सेल से छू के रूप में, आदेश गिलास पिपेट और कोशिका झिल्ली के बीच एक GΩ मुहर बनाने में नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
    9. सक्शन की एक छोटी, तेज नाड़ी के साथ, कोशिका झिल्ली को तोड़ने, पिपेट सेल के intracellular सामग्री के साथ संपर्क में आने की इजाजत दी।
    10. पूरे सेल करने के लिए एम्पलीफायर मोड स्विच, और 1 के लिए बेसल फिल्टर और उत्पादन में लाभ कम - 5 किलोहर्ट्ज़ और 0.5α, क्रमशः।
    11. saturating के लिए वर्तमान प्रतिक्रिया रिकॉर्डवोल्टेज रैंप या खाई मुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके चैनल एगोनिस्ट की सांद्रता।
    12. अभिव्यक्ति क्षमता अलग प्रोटीन के बीच बदलने के कारण, अलग प्रेरण लंबाई बार का उपयोग कर रिकॉर्डिंग दोहराएँ।
  3. एक चैनल रिकॉर्डिंग 4 के लिए आदर्श प्रेरण समय निर्धारण।
    1. एक पिपेट समाधान के रूप में, (मिमी) 150 Na-gluconate, 15 सोडियम क्लोराइड, 5 EGTA, और 10 HEPES, NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित की एक समाधान तैयार है। नहाने के समाधान के लिए, कदम 6.2.1 से समाधान का उपयोग करें।
    2. पूरे सेल प्रक्रिया दोहराएँ का उपयोग कर आईडी 0.86 मिमी कांच pipettes 10 के एक प्रतिरोध करने के लिए आग पॉलिश - 12 MΩ और संभावित पकड़े एम वी -40 के लिए निर्धारित किया है।
    3. झिल्ली के रूप में पहले से वर्णित और झिल्ली टूटना पर एक मुहर बनाने।
    4. micromanipulator का प्रयोग, सेल से दूर झिल्ली पैच के साथ पिपेट उठा।
    5. छिड़काव प्रणाली सीधे झिल्ली पैच युक्त पिपेट करने के लिए अगले स्थिति।
    6. लोअर टीक्रमश: 5 और किलोहर्ट्ज़ 10α - वह 2 करने के लिए फिल्टर और आउटपुट लाभ बेसल।
    7. झिल्ली पैच पर एगोनिस्ट की सांद्रता saturating का मूल्यांकन करता है, तो पैच प्रतिक्रिया के अनुसार एक या एक से अधिक चैनल शामिल हैं छिड़कना।
    8. सफलतापूर्वक प्रेरण समय कोशिकाओं को लागू खिलाफ दर्ज एक चैनल पैच की संख्या का विश्लेषण। वांछित परिणाम के अनुसार प्रेरण समय समायोजित करें।

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Representative Results

जल्दी से एक inducible अभिव्यक्ति मॉडल बनाने के लिए, हम उस टेट्रासाइक्लिन repressor प्रोटीन (टीआर) को व्यक्त HEK293 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है (जैसे, टी-रेक्स-293) और वैक्टर कि सीएमवी प्रमोटर और कई क्लोनिंग साइट के बीच टेट्रासाइक्लिन ऑपरेटर दृश्यों (teto) होते हैं (जैसे, pcDNA4 / के लिए)। जब Trex 293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट, pcDNA4 / में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति दमित है, के रूप में टी.आर. teto को बांधता है। मध्यम करने के लिए डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ना TR-teto बातचीत से बचाता है, इस प्रकार ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की इजाजत दी। चूहे TRPV1 (rTRPV1) की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के पहले हम एक pcDNA4 में इस चैनल के जीन डाला / ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग वेक्टर के लिए। इसके बाद, टी-रेक्स-293 कोशिकाओं rTRPV1- pcDNA4 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे / प्रोटोकॉल के बिंदु 3 में कदम के अनुसार प्लाज्मिड। अभिकर्मक के बाद, rTRPV1 अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में कोशिकाओं incubating द्वारा प्रेरित किया गया था (1 μजी / एमएल) के लिए 1 - 4 h। महत्वपूर्ण बात है, विभिन्न डॉक्सीसाइक्लिन सांद्रता वांछित अभिव्यक्ति दर हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम अपनी एगोनिस्ट, capsaicin को लागू करने से हर समय बिंदु पर rTRPV1 अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के electrophysiological और कैल्शियम इमेजिंग तरीकों का इस्तेमाल किया। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, रहते सेल कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग, capsaicin आवेदन के बाद intracellular कैल्शियम के स्तर अब प्रेरण समय के साथ धीरे-धीरे बढ़ जाती है। uninduced कोशिकाओं की सक्रियता कोशिकाओं मीडिया घटकों में टी.आर. गतिविधि में एक बेसल रिसाव, प्लाज्मिड की overexpression, या अवशिष्ट टेट्रासाइक्लिन के कारण हो सकता है। अगला, हम पैच दबाना तकनीक 80 -80 एम वी के बीच वोल्टेज रैंप लागू करने के एम वी के पूरे सेल विन्यास का उपयोग कोशिकाओं से धाराओं में दर्ज की गई। चित्रा 2 से पता चलता है कि उच्च वर्तमान आयाम अब प्रेरण समय के साथ प्राप्त कर रहे हैं। 4 घंटे प्रेरण पर वर्तमान आयाम में संतृप्ति consiste हैसंतृप्ति कैल्शियम जवाब में देखा के साथ NT (चित्रा 1)। अंत में, हम पैच दबाना तकनीक के बाहर-बाहर विन्यास में rTRPV1 अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण किया। एक चैनल विश्लेषण के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति के स्तर तक पहुंच रहा है आयन चैनल संरचना समारोह का अध्ययन करने में बड़ी कठिनाइयों में से एक। प्रकाशित एकात्मक rTRPV1 प्रवाहकत्त्व 4 के आधार पर दर्ज की वर्तमान आयाम excised पैच में चैनलों की संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, डॉक्सीसाइक्लिन ऊष्मायन समय के लिए पैच बढ़ जाती है उसी अनुपात में चैनलों की संख्या। प्रेरण के एक घंटे के बाद, हम (8 से बाहर 0) किसी भी चैनल गतिविधि का पता लगाने में सक्षम नहीं थे। हालांकि, दोनों दो और तीन घंटे का समय अंक में हम इसी तरह की सफलता की दर में एक चैनल गतिविधि दर्ज की गई। ध्यान से, जबकि दो घंटे में सबसे अधिक पैच जवाब नहीं था, तीन घंटे में सबसे अधिक पैच दिखाया एकल करने वाली मल्टी चैनल गतिविधि। प्रेरण के तीन घंटे के बाद कई चैनलों की रिकॉर्डिंग की संभावना इष्टतम प्रेरण समय वर्तमान रिकॉर्ड करने के लिए से एक चैनल प्रस्तुत की शर्तों के तहत दो से तीन घंटे के बीच है अधिक है, इस प्रकार। एक साथ इन परिणामों कि आयन चैनल की अभिव्यक्ति कसकर नियंत्रित किया जा सकता है और इस प्रोटोकॉल का उपयोग क्षणिक अभिकर्मक के बाद विनियमित प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा प्रेरण समय के अनुसार TRPV1 एक्टिवेशन का बढ़ता 1. प्रतिक्रिया, के रूप में कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से कल्पना। (ए) टी-रेक्स-293 कोशिकाओं क्षणिक rTRPV1, पहले ( 'बेसल') व्यक्त की और capsaicin (2 माइक्रोन) के आवेदन के बाद छद्म रंग छवियों। सफेद सलाखों 30 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार intracellular कैल्शियम के स्तर को इंगित करता है। के रूप में दिखाया (बी) ट्रांसफ़ेक्ट टी-रेक्स-293 कोशिकाओं में इलाज में intracellular कैल्शियम के स्तर के समय के साथ परिवर्तनए में प्रत्येक ग्राफ 50 capsaicin संवेदनशील कोशिकाओं के एक औसत प्रतिनिधित्व करता है। नोट प्रेरण समय के संबंध में capsaicin प्रतिक्रियाओं में चरणबद्ध बढ़ जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. TRPV1 पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग में प्रेरण समय में वृद्धि का एक परिणाम के रूप में वर्तमान बढ़ जाती है। (ए) टी-रेक्स 293 से पूरे सेल रिकॉर्डिंग क्षणिक -40 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर rTRPV1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट। प्रकोष्ठों संकेत समय के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्रेरित किया गया और उसके बाद capsaicin से अवगत कराया (लाल पट्टी 'टोपी'; 1 माइक्रोन)। 11 स्वतंत्र रिकॉर्डिंग - दिखाया 6 के एक प्रतिनिधि का पता लगाने के लिए है। (बी) मतलब / तितर बितर डॉट साजिश पूरे सेल आयाम का प्रतिनिधित्व ए आँकड़ा में दिखाया पैदा रूप मेंसमूहों के बीच अल महत्व, कई तुलना के साथ एनोवा के साथ निर्धारित किया गया था, जहां *** पी ≤0.001 प्रतिनिधित्व करता है और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं ns- (एन = 6 - 11 कोशिकाओं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सफलता TRPV1 रिकॉर्डिंग में एक चैनल पैच की दर प्रेरण समय पर निर्भर है। (ए) टी-रेक्स 293 से बाहर-बाहर रिकॉर्डिंग क्षणिक 50 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर rTRPV1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट। प्रकोष्ठों संकेत समय के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्रेरित किया गया और capsaicin से अवगत कराया गया (लाल पट्टी 'टोपी'; 1 माइक्रोन)। 9 स्वतंत्र रिकॉर्डिंग - दिखाया 6 के एक प्रतिनिधि का पता लगाने के लिए है। (बी) मतलब / तितर बितर डॉट साजिश के रूप में excised पैच में चैनलों की संख्या का प्रतिनिधित्वसमूहों के बीच ए सांख्यिकीय महत्व में दिखाया गया है, कई तुलना के साथ एनोवा के साथ निर्धारित किया गया था, जहां *** पी ≤0.001 प्रतिनिधित्व करता है और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं ns- (एन = 6 - 9 कोशिकाओं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अभिकर्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति और अनुसंधान के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल, अभिव्यक्ति निरंतरता और स्थिरता में सुधार करने के लिए कई अलग अलग रूपों के साथ है। क्षणिक अभिकर्मक अभिकर्मकों एक सरल, आसान प्रोटोकॉल जहां सेल और ब्याज की प्रोटीन अभिकर्मक के समय से करने के लिए रात भर घंटे के भीतर विश्लेषण किया जा सकता का उपयोग करने के लिए प्रदान करते हैं। दुर्भाग्य से इस दृष्टिकोण अप्रत्याशित हो सकते हैं जब विश्लेषण के मोड ऐसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 2 में एक चैनल रिकॉर्डिंग के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति, के अनुरूप एक स्तर की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, टेट्रासाइक्लिन repressible अभिव्यक्ति प्रणाली के तहत स्थिर सेल लाइनों ब्याज 12 की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक तरह की पेशकश करने के लिए विकसित किया गया है। यह दृष्टिकोण इस तरह के डॉक्सीसाइक्लिन के रूप में एक टेट्रासाइक्लिन निकाली गई पूरक की शुरूआत के साथ एक संस्कृति में सभी कोशिकाओं के अनुरूप अभिव्यक्ति प्रदान करता है। इस प्रोटीन के स्तर के अनुरूप और सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, टीवह समय और प्रयास है कि एक स्थिर सेल लाइन की स्थापना करने के लिए जाने के लिए यह असुविधाजनक और हानिकर जब प्रोटीन 8 की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करता है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की पेशकश की वर्तमान अभिकर्मक प्रोटोकॉल के लिए एक मध्यम-ऑफ-द-सड़क समाधान प्रदान करता है। क्षणिक एक Tet repressor रखने की कोशिकाओं में एक चलाया प्रमोटर के तहत एक जीन परासंक्रमित करके, हम चलाया अभिव्यक्ति जबकि लंबी और जटिल प्रक्रियाओं से बचने के लक्ष्य को हासिल कर सकते हैं। यहाँ, हम कैल्शियम इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विश्लेषण के साथ गैर चयनात्मक केशन चैनल TRPV1 इस्तेमाल किया। हमने पाया है कि एक चैनल के विश्लेषण के लिए इस विशिष्ट प्रोटीन की नियंत्रित अभिव्यक्ति के लिए आदर्श प्रेरण समय 2 के बीच था - 1 माइक्रोग्राम डॉक्सीसाइक्लिन की / एमएल (- 3 आंकड़े 1) के साथ 3 घंटे ऊष्मायन। एक व्यापक पैमाने पर, इस तकनीक को भी ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल भी जब एक Lar अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक समाधान प्रदान करता हैविभिन्न प्रोटीन या प्रोटीन दृश्यों में म्यूटेशन की जीई रेंज रुचि के हैं और प्रत्येक संस्करण के लिए एक स्थिर सेल लाइन बनाने अव्यावहारिक है। महत्वपूर्ण बात है, जबकि यहाँ परिणाम इष्टतम समय और सांद्रता TRPV1 अभिव्यक्ति के लिए लागू प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रत्येक जीन अपने व्यक्तिगत और विशिष्ट अनुवाद और तस्करी गति, इस प्रकार प्रत्येक प्रोटीन की जांच और अभिव्यक्ति बार बहुत 13 अलग होगा है।

इस तकनीक को नियंत्रित अभिव्यक्ति के लिए एक सुविधाजनक समाधान प्रदान करता है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल Tet प्रणाली को शरण देने लाइनों इस प्रणाली है, जो एक समस्या प्रस्तुत करता है, तो इन विशेष सेल लाइनों विश्लेषण के प्रकार है कि प्रदर्शन किया जा करने के लिए अनुपयुक्त हैं के साथ प्रयोग किया जा सकता है। एक और ख़तरा स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट लाइनों की तुलना में नहीं है कि सभी कोशिकाओं अभिकर्मक से गुजरना है, और इस तरह नहीं सभी कोशिकाओं ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करते हैं। कुल मिलाकर, हम प्रोटीन ई को नियंत्रित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैंएक heterologous प्रणाली है कि जैव चिकित्सा अनुसंधान की एक विस्तृत सरणी के लिए लागू किया जा सकता है xpression में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन [अनुदान 1721-1712, 1368-1312, 1444-1416 और] (एपी) द्वारा समर्थित किया गया। एपी Brettler केंद्र और डेविड आर ब्लूम केंद्र, फार्मेसी के स्कूल, जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय के साथ संबद्ध है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118
NucleoSpin®plasmid Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1x), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

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References

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आनुवंशिकी अंक 120 अभिकर्मक HEK293 TET repressor एक चैनल पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटीन अभिव्यक्ति inducible अभिव्यक्ति heterologous अभिव्यक्ति कैल्शियम इमेजिंग
Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति
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Geron, M., Hazan, A., Priel, A.… More

Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

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