Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Summary

Studerer ionekanaler gjennom et heterologt uttrykke systemet har blitt en sentral teknikk i biomedisinsk forskning. I dette manuskriptet presenterer vi en tidseffektiv metode for å oppnå kontrollert ionekanal ekspresjon ved å utføre transient transfeksjon under kontroll av en induserbar promoter.

Abstract

Transfeksjon, levering av utenlandske nukleinsyrer i en celle, er et kraftig verktøy i protein forskning. Gjennom denne fremgangsmåte, kan ionekanaler undersøkes ved elektrofysiologisk analyse, biokjemiske karakterisering, mutasjonsstudier, og deres virkninger på celleprosesser. Forbigående transfeksjoner har en enkel protokoll hvori proteinet blir tilgjengelig for analyse i løpet av noen timer til dager. Selv om denne fremgangsmåten gir en relativt enkel og tidseffektiv protokollen, er en av de kritiske komponentene kalibrering av ekspresjon av genet av interesse for fysiologiske relevante nivåer eller nivåer som er egnet for analyse. For dette formål er mange forskjellige tilnærminger som tilbyr muligheten til å styre ekspresjonen av genet av interesse dukket opp. Flere stabile celle transfeksjonsteknologier protokoller gir en måte å introdusere fast et gen av interesse i det cellulære genomet under regulering av en tetracyklin-kontrollerte transcripelle aktivering. Selv om denne teknikken gir pålitelige uttrykk nivåer, hvert gen av interesse krever et par uker med dyktige arbeid inkludert kalibrering av et drap kurve, valg av cellekolonier, og generelt mer ressurser. Her presenterer vi en protokoll som bruker transient transfeksjon av Transient Receptor Potential kation kanal-underfamilien V medlem 1 (TRPV1) -genet i et induserbart system som en effektiv måte for å uttrykke et protein på en kontrollert måte, som er essensielt i ionekanal analyse. Vi viser at ved hjelp av denne teknikken, er vi i stand til å utføre kalsium bildebehandling, hele cellen, og én kanal analyse med kontrollerte kanalnivå for hver type datainnsamling med et enkelt transfeksjon. Alt i alt gir dette en replikerbar teknikk som kan brukes til å studere ionekanaler struktur og funksjon.

Introduction

Heterologt uttrykke systemer er en av de mest brukte teknikker for å studere en rekke cellulære funksjoner ^1. Deres lav endogen protein profil, minimalt vedlikeholdsbehov, pålitelig vekst, og evne til å ta opp og uttrykke fremmed DNA har gjort cellelinjer som humane embryonale nyre (HEK293) og kinesiske hamstere (CHO) nesten avgjørende for biologisk forskning ^{to, tre.} Områder i forskning ved hjelp av heterologe systemer inkluderer membranproteiner, intracellulære signal og enzymatisk aktivitet. Etter transfeksjon av fremmed DNA inn i cellen, kan mange forskjellige former for analyse skal utføres, herunder elektrofysiologi, ratiometrisk avbildning kalsium, western blot, etc. ^{4, 5.}

På grunn av det brede utvalget av mulige bruksområder for heterologe ekspresjonssystemer, mange different reagenser og produkter er blitt utviklet for å utnytte disse cellene og deres kvaliteter ^6. DNA leveringssystemer som forbigående eller permanent integrere fremmed DNA i cellene til å studere eksogent protein har blitt en av de mest populære og nyttige verktøy for biologisk forskning. Nærmere bestemt er forbigående transfeksjon av DNA inn i en celle mye brukt som en enkel, likefrem prosess som krever forholdsvis liten tid og materialer. Videre er suksessraten av celler som gjennomgår transfeksjon høy ^7. Denne teknikken er meget pålitelig når det kombineres med et markør-gen, slik som grønt fluorescent protein (GFP), og kan brukes til mange forskjellige teknikker så som kalsium avbildning og elektro ^5. Dessverre, men forbigående uttrykker DNA inn i vertsceller kommer med noen store fallgruvene, ikke i det minste at uttrykket nivået per celle er upålitelig. Antallet kopier av plasmid DNA tatt up per celle er ukontrollerbare, således uttrykket mellom de enkelte eksperimenter kan variere sterkt ^2. Dette problemet blir betydelig når en prøver å gjenskape fysiologiske forhold, eller utføre presise datainnsamling teknikker.

Som en løsning på de komplikasjoner som er nevnt ovenfor, stabil transfeksjon protokoller er utviklet i hvilken et gen av interesse kan settes inn i genomet til en celle under streng kontroll av en induserbar promoter, for eksempel en tetracyklin repressor ekspresjonssystem, noe som sikrer en enkel kopi av plasmidet integreres inn i genomet til hver celle, og er bare uttrykt etter induksjon av transkripsjon mekanisme, for eksempel i nærvær av doksycyklin. Selv om dette løser hindringer av inkonsistente protein uttrykk nivåer, mister denne metoden bekvemmeligheten av rask og relativt enkel protokoll av forbigående trans. Etablering av en stabil cellelinje tar minst et par uker i hh man må kalibrere et drepende kurve satt av bestemte antibiotika for å opprettholde den proteinekspresjon og sørge for integrering av vektoren og dyktig velge ut og dyrke cellekolonier. Samlet er dette tar betydelig mer tid og krefter med en lavere suksessrate ^8.

Her introduserer vi en mellom protokoll som trekker på styrken av både av de populære transfeksjonsagensene alternativer for å gi en enkel og effektiv måte å kontrollere uttrykk nivåer i en induserbar cellelinje. Samtidig opprettholde celler med en induserbar tet system, vi forbigående transfektere vår genet av interesse, Transient Receptor Potential kasjon kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), ligert inn i en vektor som homologously kan kombinere med repressor system. På denne måten, kan genet bli introdusert inn i cellene uten begynner å uttrykke. Bare med tillegg av doksycyklin har genet begynne å uttrykke, tillater oss å kalibrere nivåer av protein expression i henhold til teknikken eller nivåene observert i fysiologiske betingelser. Vår protokoll unngår også langvarige komplikasjoner forbundet med å generere et stabilt uttrykkende cellelinje. Vi begynner med å vise de endrede nivåer av TRPV1 aktivering i kalsium avbildning fra un-indusert gjennom fire timer med induksjon og hvordan økningen i intracellulære kalsiumnivå korrelerer. Vi deretter kopiere protokollen i hele cellekonfigurasjon av plasteret klemmeteknikken, som viser økende strøm med økende tid av induksjon. Til slutt presenterer vi eksempler på enkeltkanalelektrofysiologi opptak, og viser at denne teknikken er spesielt nyttig for kontrollert uttrykk når vi leter etter nøyaktig datainnsamling basert på individuelle enheter av protein. Gjennom vår protokoll, kan vi tilby en enkel måte å kontrollere protein uttrykk i heterologe systemer og samtidig unngå lange cellekultur komplikasjoner, og dermed gi en måte å kontrollere forholdene mellom eksperimenter og gi more kopier resultater.

Protocol

1. ligere genet inn i repressible Site of Vector

1. Skaff en induserbar vektor som pcDNA5 / FRT / TO eller pcDNA4 / TO.
2. Analyser genet av interesse for noen potensielt følsomme restriksjonsseter i midten av genet som er også omtalt i flere kloning området av valgt vektor av i silico DNA analyse programvare ^4.
3. Ved hjelp av standard PCR-teknikker overlappings ^4, flankerer genet av interesse med to utvalgte restriksjonsenzymgjenkjenningsseter (som ikke finnes i genet av interesse), den første er satt inn før startkodonet, og den andre etter stoppkodonet.
4. Fordøye både vektoren og sett med restriksjonsenzymer (valgt i trinn 1.2) ved enzymer 'arbeidstemperatur i en time, etterfulgt av tilsetning av en enhet kalvetarm-fosfatase (CIP) til vektoren reaksjonen bare 30 minutter for å unngå selv ligering.
5. Legg den fordøyd DNA på en 1% agarosegel og skille de spaltede segmenter av elektroforese ^9.
6. Ved hjelp av UV-lys, kuttet med en kniv til stykker av gelen inneholdende de ønskede segmenter av vektor og sette inn for å bli ligert.
7. Pakk ut DNA-segmenter fra agarosegel stykker (ved hjelp av kommersielt tilgjengelige DNA ekstraksjon kits) og måle deres endelig konsentrasjon av spektrofotometer ved 260 nm.
8. Ligere genet av interesse inn i den induserbare valgte vektoren ved anvendelse av T4-ligase-enzym ved romtemperatur i 20 minutter. For å øke sannsynligheten for innsatsen ligering med vektoren ved å bruke et 3: 1 molart forhold av innsatsen: vektoren. For kontroll, utarbeide en ligation reaksjon som inkluderer bare vektoren.
9. For bakteriell transformasjon, legger 10 ng av vektor alene og vektor + genet i 50 mL kompetente E. coli. Inkuber røret på is i 30 minutter etterfulgt av 45 sekunder inkubering ved 42 ° C. Umiddelbart plassere tilbakepå is i to minutter, og overfører de transformerte bakterier på 500 ul LB-medium. Inkuber i en time ved 37 ° C under omrøring ved 220 rpm.
10. For valg av vellykket transformerte bakterier, plate 100 ul av hver reaksjon (som beskrevet i 1.9) på en preparert LB agarskål inneholdende det passende antibiotikum (for eksempel 100 ug / ml ampicillin ved bruk pCDNA4 / TR).
11. Tillat å vokse over natten ved 37 ° C. Platene kan lagres ved 4 ° C i opptil to uker med tett innpakning dem i plast parafin film.
12. Løfte individuelle kolonier ved bruk av en 10 ul spiss, og tillater å vokse over natten i 3 ml LB + antibiotikum medium ved 37 ° C under omrøring ved 220 rpm. Bakterier med DNA av interesse kan være frosset (-20 ° C) for korttidslagring ved sentrifugering av LB og bakterier ved 11 000 xg og aspire ut supernatanten. Langtidslagring krever frysing bakterier som glyserol aksjer ved -80 ° C.
13. Pakk DNA igjennomgh mini-prep og måle den endelige konsentrasjonen ved spektrofotometer ved 260 nm ^5.
14. Bekreft vellykket innsetting av genet av interesse ved sekvensering av renset konstruere ^fire. Alternativt diagnostisk fordøyelse av konstruksjonen av restriksjonsenzymer ved hjelp av elektroforese for å separere de kuttede segmentene og vurdere deres tilstedeværelse og lengde kan også benyttes for dette formål ^fire.

2. dyrking av cellelinjer som uttrykker Tetr

1. Få tak i en cellekultur linje huse en Tet repressor plasmid inkorporert i deres genomisk DNA. Heri protokollen vil bli skrevet med menneske embryonale nyre 293T celler (HEK-293T) husing pcDNA6 / TR plasmid som et eksempel.
2. Seed celler i 100 mm vevskulturskål med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin og 25 mM HEPES, pH 7,3 (her: Fullt DMEM) og inkuber O / N ved 37 &# 176, C og _5% CO2. Alt arbeid med celler bør gjøres i en biologisk hette under sterile betingelser.
3. For å opprettholde ekspresjon av Tet repressor-genet, aspirere mediet og erstatte den med full DMEM supplert med 5 ug / ml blasticidin. Inkuber cellene ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Når cellene nå 80 - 90% konfluens, aspirere mediet og forsiktig vaske cellene to ganger med DPBS (uten kalsium og magnesium) oppvarmet til 37 ° C.
5. For å forsiktig løft cellene uten å forårsake mekanisk skade, inkubere kulturen i DMEM inneholdende 0,05% trypsin oppvarmet til 37 ° C i 1,5 min.
6. Blokker trypsin handling med et like stort volum av full DMEM. Forsiktig pipettere opp og ned for å løfte cellene og overføre dem til et sterilt rør.
7. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 minutter.
8. Aspirer supernatanten og erstatte den med en ml Full DMEM. Pipetter løsningen med cellene opp og ned til det ikkecelleklumper kan sees. Telle og beregne antall celler ved hjelp av et hemocytometer.
9. Seed 1 - 2 x 10 ⁶ celler i 100 mm vevskulturskål inneholdende 12 ml Full DMEM med 5 ug / ml blasticidin. Splitte cellene to ganger i uken som de når 90% konfluens.

3. trans plasmidet av interesse i celler

1. Ved å bruke den samme fremgangsmåte for å splitte cellene som beskrevet ovenfor, overføre celler til brønner i en 12-brønns plate fremstilt med 0,9 ml Fullstendig DMEM, tilstrekkelig til å gjøre 50% sammenflytende (~ 200.000 celler) og inkuberes over natten ved 37 ° C i en CO ₂ kuvøse.
2. Forbered en transfeksjon blanding med pcDNA4 / TO inneholder genet av interesse, en inert plasmid å bringe den totale DNA beløpet til 1 mikrogram (om nødvendig), 3 pl lipid transfeksjon reagenvolumer og DMEM å ta den endelige volumet 100 mL. Den optimale mengden av plasmid-DNA som skal brukes varierer som uttrykker forskjellige proteiner i forskjellig effektivitet. for utvalgterophysiological eksperimenter inkluderer EGFP i pattedyr-ekspresjonsplasmidet i transfeksjon cocktail for å visualisere celler som vellykket transfeksjon gjennomgår ^fire.
3. Inkuber transfeksjon blandingen ved romtemperatur i 30 minutter.
4. Transfektere celler ved å pipettere transfeksjon blandingen dråpevis på de pletterte celler i 12-brønns plate og bunnplate kraftig for å sikre en homogen dispersjon av DNA og transfeksjon reagens. Cellene bør være ~ 80% konfluent på tidspunktet for transfeksjon.
5. Inkuber de transfekterte celler O / N ved 37 ° C og _5% CO2.
6. Bekrefte at cellene ble transfektert med hell ved å observere fluorescensen signal av EGFP under UV-lampe følgende morgen hvis utføre elektrofysiologi.

4. Plating Celler på Poly-D-lysin (PDL) Dekk / Wells

1. Steriliser 12 mm Dekk av gjengen med 70% isopropyl etanol løsning. Tørr og legg en enkelt coverslip i hver brønn av en 24-brønners plate for elektrofysiologisk opptak.
2. Pipetter en oppløsning av 0,1 til 0,2 mg / ml PDL løsningen på hver dekkglass eller brønn av en kalsium-avbildning kammer.
3. La det stå i 30 minutter ved 37 ° C i en _5% CO2 inkubator.
4. Vask med cellekulturkvalitet dobbeltdestillert vann (DDW) tre ganger, aspirere mellom hver vask. Etter siste vask, tørk godt og la det sitte på RT.
5. For elektrofysiologi, fylle hver brønn inneholdende en PDL-belagte dekkglass med 500 ul DMEM Full oppvarmet til 37 ° C.
6. Utføre den samme fremgangsmåte for å splitte de transfekterte celler som beskrevet ovenfor. Etter resuspendering av cellene etter trypsinbehandling og blokkering, overføre 80 ul av celler (eller omtrent 30 000 celler) til midten av hvert PDL belagte dekkglass for elektro opptak. Tillat celler å bosette i minst 1,5 timer eller ruge over natten ved 37 ° C i en 5% CO ₂ inkubator.
7. For kalsium avbildning overføring og flekk 20 ul av celler (ca. 20.000 celler) til midten av hvert PDL kalsium avbildning brønnen. Tillat celler å bosette i minst 30 minutter og tilsett 180 mL komplett DMEM til hver brønn.

5. Induksjon Gene Expression

1. Forbered en doksycyklin stamløsning av 1 mg / ml i DDW i henhold til produsentens instruksjoner. Hold stamløsning beskyttes mot lys ved 4 ° C i opptil 3 uker. For langtidslagring holde doksycyklin stamløsning ved -20 ° C.
2. Fremstille en frisk 2 mg / ml (elektro) eller 3 ug / ml (kalsium imaging) doksycyklin-oppløsning i full DMEM og varme den til 37 ° C.
3. For elektro innspillinger, pipettes 500 ul av 2 mg / ml doksycyklin-løsning til hver brønn for å lage en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml doksycyklin. For kalsium bildebehandling, tilsett 100 mL av 3 mg / ml doksycyklin løsning til hver brønn for å ta en endelig konsensjon av en mikrogram / ml doksycyklin. Skriv ned timen for induksjon.
4. Inkuber i den ønskede mengde av tid for induksjon ved 37 ° C og _5% CO2.

6. Kalibrering Tidslinje av Protein Expression

1. Kalibrering protein uttrykk gjennom Kalsium Imaging ^{5, 10}
   1. Fremstille Ringers oppløsning (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM _CaCl2, 2 mM _MgSO4, 20 mM HEPES, pH justert til 7,4 med NaOH), og varme den til 37 ° C.
   2. Forbered mette konsentrasjoner av kanal agonist i Ringer løsning. Fordi mengden av agonist fortynnes når de tilsettes til kalsiumavbildnings kammere inneholdende celler og ekstracellulær løsning, doble av den ønskede endelige konsentrasjon av agonist. Dette gjør også mengden av badoppløsningen i hver brønn kritisk å kontrollere.
   3. Forbered en løsning av ikke-ionisk F-127 20% W / V i DMSO. Oppvarm løsningen til 40 ° C inntil ikke-ionisk F-127 er oppløst. Lagre det ikke-ioniske F-127 oppløsning ved romtemperatur og varme den til 40 ° C før bruk. Ikke-ioniske F-127 anvendes for å bidra til å spre acetoksymetyl (AM) estere av fluoriserende ion indikatorer som Fura-2 i vandige oppløsninger.
   4. Aspirer medium og erstatte den med Fura-2AM lasteløsning (Ringers oppløsning supplert med 2-3 mikrometer Fura-2AM, 0,02 mg / ml ikke-ionisk F-127 og 10 mM D-glukose).
   5. Inkuber i 60 minutter ved romtemperatur i mørke.
   6. Sug Fura-2AM løsning og vask celler med Ringer + 10 mM D-glukoseoppløsning for å fjerne ekstracellulære fargestoff. Gjenta dette trinnet to ganger.
   7. Gitt 200 pl Ringers + 10 mM D-glukose-løsning i hver brønn og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i mørke.
   8. Plasser kammer på scenen over mikroskopet nesestykket og fest den med holderen.
   9. Slå på lampen, kamera og mikroskop og velg Fura-2 filter for å oppdage utslipp på 510 nm wavelength.
   10. Juster for ønsket forstørrelse og fokus cellene i det valgte feltet.
   11. I mørket, subtrahere bakgrunnslys og sette eksponeringstiden.
   12. Sett bildet prøvetaking på ønsket hastighet og registrering fluorescens respons av Fura-2 lastet celler ved spennende dem ved 340 og 380 nm bølgelengder. Forholdet mellom 340/380 signaler som er en indikator for intracellulær Ca2 ⁺ konsentrasjonen og dermed også for TRPV1 aktivitet.
   13. Tilsett 2 uM kapsaicin i 200 ul Ringers løsning ved pipettering for å skape en metnings endelig konsentrasjon på 1 uM capsaicin for å behandle uttrykket nivået av TRPV1.
   14. Analyser TRPV1 respons i henhold til induksjons tid og bestemme protokoll for protein av interesse.
2. Justering av proteinekspresjon i heterologe systemer bruker hele cellekonfigurasjon av plasteret klemmeteknikken ^{4, 11.}
   1. Forbered than bade oppløsning av (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 _MgSO4, 5 HEPES, og 5 2- (N-morfolino) etansulfonsyre (MES), justert til pH 7,4 med NaOH.
   2. Forbered mette konsentrasjoner av kanal agonist i ekstracellulært løsning.
   3. Trekke glasselektroder med en indre diameter (ID) på 1,10 mm og brann-polish til en motstand på 2 - 4 Megohm.
   4. Fremstille en pipette oppløsning av (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 _MgSO4, 0,5 _CaCl2, 1 EGTA og 10 HEPES justert til pH 7,2 med KOH. Filtrer pipetten løsning før bruk. Før hvert forsøk, er et enkelt, brann-polert glass pipette tilbake fylt ved å senke spissen i pipetten løsningen i minst ett minutt, og deretter fyllt med smeltet og strukket spissen med en sprøyte fylt med samme pipette løsning.
   5. Løft forsiktig en enkelt PDL belagt dekkglass med de pletterte celler fra brønnen til en 35 mm petriskål av plast fylt med ca. 2 ml bad oppløsning ved romtemperatur. Observere under en epi-fluorescerende mikroskop.
   6. Lokalisere en EGFP positiv celle, som visualisert med epifluorescent mikroskop, på den preparerte dekkglass og flytte til midten av visualisert felt.
   7. Fester den fylte pipette til pipetten innehaveren av mikromanipluatoren, og injisere en liten mengde positivt trykk i systemet for å unngå forurensning av det intracellulære pipette-løsning. Senke den til like over GFP - positiv celle, sjekker for riktig motstand.
   8. Som pipetten berører cellen, anvende en liten mengde av negativt trykk for å skape en GΩ tetning mellom glass og cellemembran pipette.
   9. Med en kort, kraftig puls av sug, bryter cellemembranen, slik at pipetten for å komme i kontakt med de intracellulære innholdet i cellen.
   10. Slå forsterkeren modus til hele cellen, og senk filter og utgang gevinst Bessel til 1-5 kHz og 0.5α hhv.
   11. Ta opp den aktuelle reaksjon på metningskonsentrasjoner av kanal agonist ved hjelp av spenning ramper eller gap gratis protokollen.
   12. Fordi uttrykk effektivitet bytte mellom forskjellige proteiner, gjenta opptakene ved hjelp av ulike induksjon lengde ganger.
3. Bestemme ideell induksjonstiden for enkeltkanalopptak ^4.
   1. Fremstille en løsning av (mM) 150 Na-glukonat, 15 NaCl, 5 EGTA, og 10 HEPES, regulert til pH 7,4 med NaOH, som en pipette-løsning. For bad løsning, bruke løsningen fra trinn 6.2.1.
   2. Gjenta hele cellen prosedyren med ID 0,86 mm glass pipetter brann-polert til en motstand på 10 - 12 Megohm og satt holder potensial til -40 mV.
   3. Danner en tetning på membranen som er beskrevet tidligere og revne membranen.
   4. Ved hjelp mikromanipluatoren, løfter pipette med membranen lapp bort fra cellen.
   5. Plasser perfusjon systemet rett ved siden av pipetten som inneholder membranen patch.
   6. nedre than Bessel filter og utgang gevinst til 2-5 kHz og 10α hhv.
   7. Perfuse mettende konsentrasjoner av agonist på membranen plasteret, evalueringen hvis plasteret inneholder en eller flere kanaler i henhold til reaksjon.
   8. Analyser antall enkeltkanal flekker hell ført mot induksjonstiden brukt på celler. Juster induksjons tid i henhold til de ønskede resultater.

Representative Results

For raskt å opprette en induserbar uttrykk modell, har vi gjort bruk av HEK293 celler som uttrykker Tetracycline Repressor protein (TR) (for eksempel T-Rex-293) og vektorer som inneholder tetracyklin operatorsekvenser (Teto) mellom CMV promoteren og multiple kloningssete (f.eks pcDNA4 / TO). Når transfektert inn Trex-293 celler, er uttrykket av genet av interesse i pcDNA4 / TO trykt, som TR binder seg til Teto. Tilsetning av doxycycline til mediet forhindrer TR-Teto interaksjon, og dermed tillater ekspresjon av det transfekterte proteinet. For å kontrollere uttrykk for rotte TRPV1 (rTRPV1) vi først satt inn denne kanalen gen inn i en pcDNA4 / til vektor ved hjelp av den ovenfor beskrevne protokollen. Deretter ble T-Rex-293 celler transfektert med rTRPV1- pcDNA4 / plasmid i henhold til fremgangsmåten i punkt 3 i protokollen. Etter transfeksjon ble rTRPV1 ekspresjon indusert ved inkubering av cellene i nærvær av doksycyklin (1 μg / ml), 1 - 4 timer. Viktigere, kan forskjellige doxycycline konsentrasjoner anvendes for å oppnå ønsket hastighet ekspresjon. Vi brukte elektrofysiologiske og kalsiumsavbildningsmetoder for å evaluere rTRPV1 ekspresjonsnivået ved hvert tidspunkt ved å anvende dets agonist, capsaicin. Som vist i figur 1, ved hjelp av levende celle kalsium bildebehandling, er intracellulær kalsiumnivået etter capsaicin søknad økes gradvis med lengre induksjons ganger. Aktivering av ikke-induserte celler kan skyldes en basal lekkasje i TR aktivitet, overekspresjon av plasmidet, eller rest-tetracyklin i cellenes mediekomponenter. Deretter registrerte vi strøm fra celler med hel-celle konfigurasjon av plasteret klemme teknikken søker spenning ramper mellom -80 mV til 80 mV. Figur 2 viser at høyere strøm amplituder fremkommer med lengre induksjonstider. Metning i gjeldende amplitude på 4 h induksjon er consistent med metning sett i kalsium-respons (figur 1). Til slutt, vi analysert rTRPV1 uttrykk nivåer i utenfor-out konfigurasjonen av patch-clamp teknikken. En av de store vanskeligheter med å studere ionekanal struktur-funksjon er å nå ekspresjonsnivåer egnete for én-kanals analyse. Basert på publisert enhetlige rTRPV1 konduktans ^4, ble det registrert strømamplituden brukt til å bestemme antallet av kanaler i det utskårede plasteret. Som vist i figur 3, antallet kanaler i koblings øker proporsjonalt med doksycyklin inkubasjonstid. Etter en time med induksjon, var vi ikke i stand til å oppdage eventuelle kanal aktivitet (0 av 8). Men i begge to- og tre-timers tidspunkter registrerte vi enkelt kanal aktivitet i lignende suksessrater. Av notatet, mens i to timer fleste flekker svarte ikke, i tre timer fleste flekker viste én-til-multi-kanal aktivitet. Sjansene for å ta opp flere kanaler etter tre timer med induksjon er høy, og dermed den optimale induksjons tid til å spille inn strøm fra en enkelt kanal er mellom to til tre timer under de presenterte forhold. Sammen viser disse resultatene at ekspresjon av ionekanaler kan bli kontrollert og regulert etter transient transfeksjon ved bruk av denne protokollen.

Figur 1. Response av TRPV1 Aktivisering Øker ifølge Induksjon Time, som Visualisert gjennom Kalsium Imaging. (A) Pseudo-farget bilder av T-Rex-293 celler forbigående uttrykker rTRPV1, før ( 'Basal') og etter capsaicin (2 mm) søknad. Hvite stolper representerer 30 mikrometer. Scale bar viser nivåer av intracellulært kalsium. (B) Endrer med tiden av intracellulære kalsiumnivåer i transfekterte T-Rex-293 celler behandlet som visti A. Hver kurve som representerer et gjennomsnitt av 50 capsaicin følsomme celler. Legg merke til de trinnvise økninger i capsaicin responser i forhold til induksjon tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. TRPV1 Nåværende øker som følge av økende Induksjon Tid i hele cellen Patch Clamp Recordings. (A) Hel-celle opptak fra T-Rex-293 transient transfektert med rTRPV1 på en holder potensial på -40 mV. Celler ble indusert med doksycyklin (1 pg / ml) i den angitte tid og deretter eksponert for capsaicin ( 'Cap'; 1 uM; rød bar). Vist er en representant spor av 6 - 11 uavhengige opptak. (B) Mean / scatter-prikkplott som representerer den hel-celle amplitude fremkalt som vist i A. statistikkal betydning mellom grupper ble bestemt med ANOVA med flere sammenligninger, der *** representerer p ≤0.001 og NS ikke statistisk signifikante (n = 6 - 11 celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. suksess rate Single Channel Patch i TRPV1 Recordings er avhengig Induksjon Time. (A) Utenfor ut opptak fra T-Rex-293 transient transfektert med rTRPV1 på en holder potensial på 50 mV. Celler ble indusert med doksycyklin (1 pg / ml) i den angitte tid og ble utsatt for capsaicin ( 'Cap'; 1 uM; rød bar). Vist er en representant spor av 6 - 9 uavhengige opptak. (B) Mean / scatter-prikkplott representerer antall kanaler i utskåret patch somvist i A. Statistisk signifikans mellom gruppene ble bestemt med ANOVA med flere sammenligninger, der *** representerer p ≤0.001 og NS ikke statistisk signifikante (n = 6 - 9 celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Transfeksjon er en mye brukt protokoll for protein uttrykk og forskning, med mange forskjellige varianter for å bedre uttrykk konsistens og stabilitet. Forbigående transfeksjon reagenser tilbyr en enkel, lett å bruke protokoll der cellen og protein av interesse kan analyseres i løpet av timer til over natten fra tidspunktet for transfeksjon. Dessverre denne tilnærmingen kan være uforutsigbar når modusen for analyse krever et konsistent nivå av protein uttrykk, for eksempel enkeltkanalopptak i elektro ^to. Alternativt har stabile cellelinjer under tetracyklin repressible uttrykket system blitt utviklet for å gi en måte å kontrollere ekspresjonsnivået av proteinet av interesse ^12. Denne tilnærmingen gir konsistent ekspresjon av alle celler i en kultur med innføringen av et tetracyklin avledet supplement, såsom doksycyklin. Selv om dette gjør for konsekvent og nøyaktig kontroll av protein nivåer, than tid og krefter som går inn for å etablere en stabil cellelinje som gjør det upraktisk og ufordelaktig når man studerer en rekke forskjellige proteiner ^8.

Protokollen presenteres her gir en middle-of-the-road løsning til dagens transfeksjon protokoller som tilbys. Ved forbigående transfeksjon av et gen under en kontrollerbar promoter inn i celler som innehar en Tet repressor, kan vi oppnå kontrollerbar uttrykk og samtidig unngå lange og kompliserte prosedyrer. Her har vi brukt ikke-selektive cation kanal TRPV1 med kalsium bildebehandling og elektro analyse. Vi har funnet at den ideelle induksjonstiden for regulert ekspresjon av dette spesifikt protein for enkeltkanal-analyse var mellom 2 - 3 timers inkubasjon med 1 ug / ml doksycyklin (figurene 1 - 3). På en bredere skala, kan denne teknikk også anvendes til hvilket som helst protein av interesse. Denne protokollen har også en løsning for å kontrollere uttrykk når en large rekke forskjellige proteiner eller mutasjoner i proteinsekvenser er av interesse, og å skape en stabil cellelinje for hver variant er upraktisk. Viktigere, mens resultatene her representerer det optimale tidspunktet og anvendbare konsentrasjoner for TRPV1 uttrykk, har hvert gen sin individuelle og spesifikke oversettelse og trafficking tempo, og dermed kalibrerings og uttrykk tider av hvert protein vil variere sterkt ^13.

Selv om denne teknikken gir en praktisk løsning for kontrollert uttrykk, er det ikke uten begrensninger. Eneste kommersielt tilgjengelige cellelinjer som bærer Tet-system kan anvendes sammen med dette systemet, noe som utgjør et problem hvis disse spesielle cellelinjer er uegnet for den type analyse som skal utføres. En annen fallgruve i forhold til stabilt transfekterte linjer er at ikke alle celler som gjennomgår transfeksjon, og således ikke alle celler som uttrykker proteinet av interesse. Samlet sett kan vi tilby en enkel måte å kontrollere protein eXpression i et heterologt system som kan brukes til en lang rekke av biomedisinsk forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1x), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL)	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225