Introduction
trastornos del neurodesarrollo humanos, como microcefalia, sólo pueden ser poco estudiados en modelos animales debido al hecho de que los cerebros humanos tienen una superficie cortical extendida, una característica única que difiere de los animales no humanos.
Este aspecto hace que el desarrollo del cerebro humano un proceso complejo que no puede ser suficientemente estudiada en un 2D, en el sistema de cultivo celular in vitro. Emergentes técnicas de cultivo 3D permiten la generación de organoides similar a un tejido a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). La diferenciación in vitro de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en 3D permite la formación de diversos tipos de células de una manera oportuna y específica de la región, dando lugar a una manera organizada, tejido estratificado 1, 2, 3. Gracias a los laboratorios que fueron pioneras en tecnologías de cultivo 3D y desmitificado la complejidad de la formación de órganos, a partir de células madre,hemos desarrollado un método robusto de generar organoides cerebrales para delinear los eventos tempranos de desarrollo del cerebro humano y para modelar microcefalia in vitro 1, 2, 3. Es de destacar que se adaptó el método original desarrollado por Lancaster et al. para generar organoides cerebrales 1. Este método fue modificado de acuerdo a nuestras necesidades experimentales.
El objetivo de un estudio de Gabriel et al. fue analizar los mecanismos celulares y moleculares de mantenimiento de células madre neuronales durante el desarrollo del cerebro. Con el fin de hacer esto, un estudio mecanicista se realizó mediante el análisis de las células progenitoras neurales (CPN) en organoides cerebrales 3D derivados de un paciente microcefalia 4. Este paciente lleva una mutación en CPAP, una proteína centrosomal conservado necesario para la biogénesis de centrosoma 5. Un hipo ampliamente aceptadotesis es que microcefalia es el resultado de un agotamiento de la reserva de la APN, y esto podría ser debido o bien a la muerte celular o a la diferenciación prematura 1, 6, 7, 8, 9.
Mediante el análisis de las zonas ventriculares (VZS) de organoides cerebrales microcefalia, se ha demostrado que un número significativo de NPC someterse a la división celular asimétrica, a diferencia de organoides cerebrales derivadas de un donante sano 4. Extensos análisis microscópicos y bioquímicos de organoides cerebrales microcefálicos revelan un papel inesperado para la CPAP en el desmontaje cilios oportuna 4. Específicamente, CPAP mutado se asocia con el desmontaje cilio retardado y ciclo celular re-entrada retardada, lo que lleva a la diferenciación prematura de NPC 4. Estos resultados sugieren un papel de los cilios en la microcefalia y THEIR participación durante la neurogénesis y el tamaño del cerebro de control 10.
La primera parte de este protocolo es una descripción de un método de tres pasos para generar organoides cerebrales homogéneos. Como se mencionó antes, el protocolo Lancaster original fue adaptado y modificado para adaptarse a nuestro propósito 1. En primer lugar, iPSCs humanos se cultivan en un estado libre de alimentador definido en matriz de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Este paso evita las variaciones de cultivos de células madre pluripotentes alimentadoras-dependiente. En este protocolo, la inducción de la diferenciación neural para formar epitelio neural comienza directamente desde iPSCs. Al saltarse la etapa de formación del cuerpo embrioides (EB), la diferenciación procede neural en una manera más controlada y dirigida. Este enfoque limita la formación espontánea y no dirigida de otras capas de células germinales, tales como el mesodermo y endodermo. Mediante la aplicación de este protocolo, neuroesferas contienen rosetas neurales pueden ser cosechadas en el día 5 para EHS incrustación matriz y cultivo en suspensión estacionaria. El medio organoide utilizado para el tercer paso de nuestro protocolo se complementa con dorsomorphin y SB431542. Dorsomorphin es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína morfogénica ósea (BMP), y SB431542 inhibe la ruta de TGF- / activina / nodal de señalización. La combinación de estos factores podría promover la diferenciación neural de manera más eficiente que el ácido retinoico solo 11, 12, 13, 14.
En conjunto, estas modificaciones permiten la generación reproducible de organoides cerebrales, con variaciones mínimas a través de organoides. Es importante destacar que, se aplicó este método para generar robustamente organoides cerebrales microcefálicos de iPSCs paciente, que llevan mutaciones en los genes que afectan a los centrosomas y la dinámica del ciclo celular.
La segunda parte de este protocolo da instrucciones para preparar brain organoides para el análisis y la interpretación de los defectos celulares en microcefalia. Esto incluye la fijación, cryosectioning, la tinción de inmunofluorescencia y análisis microscópico confocal. Este protocolo proporcionará al lector una descripción detallada de los resultados esperados y con la orientación para la interpretación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generación de cerebro organoides (23 días)
- Iniciación de neuroectodermo (5 días)
NOTA: Los siguientes puntos deben ser considerados antes del comienzo de la diferenciación. El método de reprogramación (etc. lentiviral-, basado en microRNA sendai-a virus, episomas, o) para obtener iPSCs humanos idealmente debería ser la misma para todos los pacientes y controlar las líneas de IPSC. Varios kits de reprogramación y las instrucciones en base a protocolos publicados están disponibles 15, 16, 17, 18. La calidad de las líneas de IPSC humanos es la clave para lograr una diferenciación óptima. Monitor de colonia y la morfología celular con un microscopio y validar pluripotencia mediante pruebas de la expresión de marcadores tales como Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60.- iPSCs Cultura humanos bajo condiciones libres de alimentador en medio A en un plato recubierto con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
NOTA: Grow iPSCs humanos-alimentador libre y para mantener una condición de cultivo definido y para evitar una etapa adicional para la eliminación de células alimentadoras de embriones de ratón (MEFs) antes del inicio de la diferenciación libre de suero. El número óptimo de paso para iPSCs humanos para iniciar rangos de diferenciación de paso 15 a la reprogramación de paso 70 en total. Cuando pases, separar colonias hiPSC como células agregadas utilizando una solución de desprendimiento celular apropiado con un bajo estrés mecánico y una pipeta serológica de 2 ml para transferir agregados a un nuevo plato. Evitar la disociación de células individuales, ya que esto podría inducir la diferenciación y la apoptosis en la mayoría de las líneas de IPSC. Se informó de que a largo plazo, pases de una sola célula podría aumentar alteraciones genómicas en iPSCs humano 19, 20. Evitar procedimientos desprendimiento de células, que requieren una etapa de centrifugación para eliminar la solución desprendimiento, ya que esto reduce la viabilidad general de iPSCs. Pruebatodas las culturas de contaminaciones microbianas, particularmente micoplasma, sobre una base regular, porque esto podría alterar la calidad de los iPSCs y su capacidad de diferenciación.- Escudo una placa de cultivo de tejidos de 60 mm con matriz EHS según las instrucciones del fabricante.
- Descongelar una alícuota de 1 x 10 6 iPSCs humanos. Sembrar el iPSCs en una placa de cultivo tisular de 60 mm recubierto en la matriz EHS y que contiene 5 ml de medio A (véase la Tabla de Materiales). Cambiar el medio a diario y el paso después de 5 a 7 días cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia.
NOTA: Passage las iPSCs descongelaron a 80% de confluencia usando métodos estándar, tales como el desprendimiento libre de enzimas de las colonias de 21, al menos una vez antes de iniciar la diferenciación. En breve, se elimina el medio iPSC, lavar las células una vez con pre-calentado 37 del ° C Dulbecco Medio de Eagle Modificado: Nutriente F12 de mezcla (DMEM / F12), e incubar los iPSCs siguiente al del fabricanteinstrucciones usando reactivo A (ver la Tabla de Materiales). No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación de células individuales. iPS humanas deben ser separados y flotando en forma de agregados, las células no como individuales. A continuación, pueden ser transferidos a nuevos platos de matriz recubierto EHS; por ejemplo, iPSC agregados de una placa de 60-mm se puede distribuir a 4 nuevos platos de 60 mm. - Compruebe si hay micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizar células iPS sólo libre de micoplasmas, como micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las células iPS.
- Disociar iPSCs (80% confluentes) y preparar una suspensión de una sola célula usando el reactivo B.
- Lavar las iPSCs una vez con pre-calentado (37 ° C) DMEM / F12.
- Añadir el reactivo B pre-calentado (por ejemplo, 1 ml en una placa de 60 mm) y se incuban las iPSCs durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO2.
- Flick 20 veces con un dedo en el lado y parte inferior deel plato para separar las células iPS. Comprobar la separación de las células bajo el microscopio.
- Pipeta de la suspensión de células arriba y abajo en el plato 5 veces con una micropipeta de 1 ml.
- Añadir 3 ml de medio A para diluir 1 ml de reactivo B y recoger la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 15 mL.
- girar suavemente la iPSCs (500 xg) durante 4 min a temperatura ambiente.
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio B y contar el número de células con un hemocitómetro.
NOTA: Tenga en cuenta de usar sólo el medio B para la resuspensión. Evitar el uso de medio A, ya que contiene una demasiado alta concentración de bFGF, lo que podría inhibir la diferenciación.
- Diluir la suspensión de células a 4,5 x 10 5 células por ml en medio B suplementado con asociado-rho 10 mM inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632).
- Añadir 100! L por pocillo en una placa de 96 pocillos no adherente, de fondo en v,.
NOTA: Asegúrese de que las células se distribuyen por igual en el SUSpensión agitando el tubo cada vez antes de sacar porciones de 100 mL. Es importante que cada pocillo debe contener un número de células equivalente con el fin de obtener neuroesferas homogéneas en tamaño y forma (redonda, superficies definidas). - Girar suavemente la placa con las células a 500 xg y temperatura ambiente durante 3 min y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2.
- Cambiar el medio a diario por la eliminación de 50 l y la adición de 50 l de medio fresco B en cada pocillo para los próximos 5 días.
- iPSCs Cultura humanos bajo condiciones libres de alimentador en medio A en un plato recubierto con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
2. Incorporación de neuroesferas en EHS Matrix (4 días)
- Preparar medio neurosphere mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de (v / v), 1 DMEM / F12 y C medio: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 sin (w / o) la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos no esenciales (MEM), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
- Recoger el ingenio neuroesferasja 200 micropipeta l usando una punta de ~ 2 mm cortada previamente con tijeras estériles.
- Colocar las neuroesferas aproximadamente 5 mm de distancia entre sí en la película de parafina (3 x 3 cm 2) en un vacío plato 100 mm y retirar con cuidado la mayor cantidad de medio restante como sea posible.
- Añadir una gota (7 l) de la matriz EHS sobre cada sola neurosphere.
- Incubar la matriz EHS gotas con las neuroesferas durante 15 minutos en una incubadora.
- Lavar las neuroesferas cuidadosamente de la película de parafina mediante el lavado con medio de neuroesferas. Para lavar, utilice un ml micropipeta 1 y un nuevo 100 mm placa de Petri que contiene 10 ml de medio de neuroesferas.
- Incubar las neuroesferas en los próximos 4 días y añadir 2 ml de medio de neuroesferas fresco en días 2.
NOTA: Asegúrese de que los estantes en la incubadora son planas para que las neuroesferas embebidos en matriz de EHS no van a aglutinarse en un lado del plato.
3. organoides en una suspensión RotaryCultura (14 días)
- Preparar cerebro medio organoide mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de DMEM / F12 y C medio (v / v), 1: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 w / o la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 M dorsomorphin, 5? M SB431542, y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
- Añadir 100 ml de cerebro organoide medio a cada matraz spinner a través de sus brazos laterales y colocarlos en una incubadora de pre-calentamiento durante al menos 20 min.
- Establecer un programa de agitación a 25 rpm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Antes de transferir las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación, asegúrese de que todos ellos están separados. Si dos o más están conectados a través de la matriz EHS, separarlos mediante la reducción de la matriz de conexión con un bisturí. - transferir cuidadosamente las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación que contenían 100 ml de medio organoide nosotrosing una pipeta serológica 2 mL. Usa los brazos laterales del matraz spinner para transferir las neuroesferas en el matraz.
- Colocar los matraces de agitación en una plataforma de agitación magnética en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2; este es el día 0 de la cultura organoid.
- Cambiar el medio una vez por semana (o más a menudo cuando hay un cambio de color) mediante la eliminación de la mitad del medio y añadiendo la misma cantidad de medio fresco.
NOTA: Al tomar los matraces de agitación de la incubadora, esperar 3-5 minutos para permitir que los organoides se hunden hasta el fondo del matraz. Eliminar el medio mediante la colocación de la punta de pipeta de vidrio (conectado a una bomba) en la superficie del líquido; aspirar el medio cuidadosamente a través de una abertura lateral / brazo del matraz. Estas manipulaciones deben realizarse bajo el capó laminar.
4. Análisis de organoides cerebrales
- La fijación de organoides
- Recoge los organoides en el día 14 del wi cultivo en matraz spinnerth un corte 1 ml micropipeta (corte ~ 5 mm). Ponga todos ellos en una placa de 60 mm y lavarlos una vez con 5 ml de DMEM caliente / F12 durante 3 min.
- Preparar un tubo de 1,5 ml con 500 l de tibia 4% de paraformaldehído (PFA).
Precaución: Use protección para los ojos y la piel y el trabajo bajo una campana de seguridad al manejar PFA fijador. - Colocar cada organoides por separado en cada tubo y fijar durante al menos 30 min a temperatura ambiente. No fijar los organoides durante más de 60 minutos. Para mover los organoides, utilizar un bucle de inoculación o cualquier otro legado que es conveniente.
- Retire el PFA y lavar los organoides fijos dos veces durante 10 min cada una con 1 ml de PBS.
- Almacenar los organoides en 1 ml de PBS a 4 ° C durante hasta 7 días, hasta su uso posterior.
- Incorporación de los organoides para cryosectioning
- Retire el PBS y añadir 1 ml de 30% de sacarosa en solución de agua destilada por tubo para deshidratar los organoides antes cryofreezing ellos; después de añadir Sucrosolución en sí, los organoides debe estar flotando en la superficie. Almacenar los organoides durante la noche en solución de sacarosa a 4 ° C; por el día siguiente, los organoides deberían haber hundido hasta el fondo del tubo.
NOTA: organoides se pueden almacenar para un máximo de 3-5 días a 4 ° C en solución de sacarosa, si es necesario. - Llenar un molde espécimen de vinilo con 400! L de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y el uso de un bucle de inoculación para colocar un organoide en el centro del molde. Etiquetar el borde del molde con el nombre de la muestra.
- Congelar el molde que contiene organoide a -80 ° C hasta cryosectioning.
- cryoslides de vidrio de capa con 0,1% de solución de lisina poli-l-(PLL) en PBS durante 5 min a temperatura ambiente y dejar que los portaobjetos se secan durante 3 h. Almacenar las diapositivas a 4 ° C y calentarlos a templado ambiente antes de su uso.
NOTA: PLL-recubrimiento es un paso importante, ya que evitará que las rodajas de organoides se vaya flotando. Recoger y almacenar solución de PLL a 4 ° C durante un máximo de 3meses. Antes de la reutilización, filtrarla con una jeringa 0,22-micras y dejar que se caliente a temperatura ambiente. - Organoides Sección cryofrozen en 20-50 rebanadas m de espesor sobre vidrio recubierto con PLL cryoslides 22. Deje que los portaobjetos con las secciones se secan durante 1 hora a temperatura ambiente. Almacenar las secciones a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.
- Retire el PBS y añadir 1 ml de 30% de sacarosa en solución de agua destilada por tubo para deshidratar los organoides antes cryofreezing ellos; después de añadir Sucrosolución en sí, los organoides debe estar flotando en la superficie. Almacenar los organoides durante la noche en solución de sacarosa a 4 ° C; por el día siguiente, los organoides deberían haber hundido hasta el fondo del tubo.
5. Inmunofluorescencia tinción de secciones organoides
NOTA: Para la caracterización general de organoides, la tinción con nestina, un marcador progenitoras neurales, y Tuj1, un marcador pan-neuronal, se recomienda. Como ejemplos adicionales, la tinción de inmunofluorescencia con fosfo-vimentina (p-Vim), que las etiquetas de las células gliales radiales apicales mitóticas, y Arl13b, por cilio, se describen. Para probar la apoptosis, utilice el ensayo desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) dUTP Nick Fin Etiquetado (TUNEL). Colocar los portaobjetos en una caja de plástico durante las incubaciones a protegerlos del polvo, luz,y la desecación.
- Descongelar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces con 200? L de PBS-glicina (0,225 g de glicina en PBS) durante 3 min para inactivar la autofluorescencia inducida por PFA.
- Permeabilizar las secciones con 200! L de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween en solución de PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con 200 l de solución de PBS-glicina durante 3 min.
- Incubar con 200! L de 0,5% de gelatina de pescado / 0,1% de Triton X100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para bloquear antígeno inespecífico de unión.
NOTA: Si se requiere un ensayo de TUNEL, lleve a cabo el ensayo según el protocolo del fabricante. Comience con el ensayo TUNEL antes de realizar la inmunotinción, ya que podría interferir con anticuerpos secundarios y saciar fluoróforos cuando se utiliza después. - Diluir los anticuerpos en solución a las concentraciones siguientes de bloqueo: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; y anticuerpos secundarios, 1: 1.000.
- Incubar con 200 l de la primera anticuerpo primario (por ejemplo, nestina) para 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
- Diluir la primera (anti-ratón 488) anticuerpo secundario 1: 1000 en solución de bloqueo y se incuba el portaobjetos en 200 l durante 1-2 h a temperatura ambiente. A partir de ahora, siempre proteger a las diapositivas de la luz.
- Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
- Incubar con 200 l de la siguiente anticuerpo primario (por ejemplo, Tuj1) durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
- Añadir 200? L de la siguiente anticuerpo secundario (anti-conejo 647) durante 1-2 h a temperatura ambiente.
- Lavar 3 x 3 min. con 200 l de solución de bloqueo.
- Añadir 200! L de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una nM conc 30entration en PBS durante 15 min a temperatura ambiente para la tinción nuclear.
- Lavar 2 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
- Lavar 1 x 1 min con 200 l de agua destilada y dejar que las secciones se sequen durante 10-20 min, hasta que no gota de agua obvia es visible más.
- Montar las secciones con el medio de inclusión. Almacenarlos protegidos de la luz a 4 ° C hasta por varias semanas.
- Proceder con el análisis microscópico de imagen una visión general de la zona organoide, ventricular, placa cortical primitivo, y otras áreas de interés.
- Utilice un microscopio confocal con un aceite 63X filtros objetivas y fluorescentes, elegido de acuerdo con los anticuerpos secundarios de tinte-etiquetados fluorescentes utilizados 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La generación de organoides cerebrales requiere al menos tres semanas de cultivo continuo (Figura 1A). Para lograr resultados reproducibles, se recomienda que el investigador documenta cada paso y, sobre todo, evita cualquier alteración con respecto a los componentes del medio, los puntos de tiempo, y la manipulación de células. A continuación, damos un resumen de cómo evaluar si se alcanzan los hitos críticos con el fin de obtener organoides de calidad suficiente al final del experimento. La formación de neuroesferas en una placa de 96 pocillos debe ser claramente visible desde el día 4. Las neuroesferas pueden ser reconocidos como esferas bien definidas en la parte inferior de cada pocillo (Figura 1B, paso 1).
En el día 5, neuroesferas deben ser ~ 500 m de diámetro y presentan una superficie lisa, con un borde brillante que rodea un centro oscuro. Podría ser posible observar ya neuronal estru extendida rosetactures dentro de este borde brillante (Figura 1C, inicio de la etapa 2). Si las neuroesferas se desmoronan o se parecen más a los agregados de células, la diferenciación no debe continuar más allá. Finalmente, organoides deben aumentar y exhiben un tamaño similar durante el proceso de diferenciación en matraces de agitación (Figura 1D, paso 3). Consulte la tabla de resolución de problemas (Tabla 1) para obtener más información.
La calidad del día 14 organoides debe ser verificada mediante microscopía de luz. VZS se componen de capas gruesas de CPN / células gliales radiales nestina positiva con una forma nuclear empalizada en el lado apical. Por otro lado, la placa cortical primitiva contendrá neuronas Tuj1-positivo abundantes en el lado basal, espacialmente distintas desde el lado apical (Figura 1E). Es importante destacar que, las neuronas Tuj1-positivas no deben ser vistos en el lado apical de la VZ.
(Figura 1F y G) 23,24. Cuando se alcanza la suficiente expansión Arg, comienza la neurogénesis, las células en división cambian su orientación hacia el lumen, y el plano de división cambia de horizontal (simétrica) a vertical (asimétrica) 4, 12, 24.
Figura 1: Generación de organoides del cerebro a partir de células iPS humano. (A) de flujo de trabajo del protocolo de diferenciación. Paso 1: Inicio de la diferenciación. Durante esta fase, la formación de neuroesferas de iPSCs humanos en una placa de 96 pocillos se produce. El tiempo de duración es de 5 días. Paso 2: Incorporación de las neuroesferas en gotitas la matriz EHS. Un cultivo en suspensión estacionaria de EHS neuroesferas embebidos en matriz tiene una duración de tiempo de 4 días. Paso 3: organoides en matraces de agitación. La transferencia de EHS neuroesferas embebidos en matriz a spinner matraces se lleva a cabo. El tiempo de duración es de 14 días. (B) A neurosphere en una placa de múltiples pocillos. se muestra imagen representativa de una neurosphere en el día 4 en una placa de 96 pocillos durante la etapa 1. La esfera debe ser claramente visible en la parte inferior del pozo, con una superficie lisa, redonda (arro rojow). (C) Morfología de neuroesferas antes de EHS incrustación matriz. Neurospheres recogidas en el día 5 de la etapa 1 deben ser uniformes en tamaño y mostrar una superficie lisa con un borde brillante (soporte y la flecha). (D) organoides en matraces de agitación. Un matraz de agitación con organoides cerebrales durante el paso 3 (flechas rojas) se muestra aquí. (E) de formación de imágenes de inmunofluorescencia de organoides cryosectioned que exhibe una VZ típica y la placa cortical primitivo. El panel izquierdo muestra la tinción nuclear de células en el VZ. El VZ se extiende desde el lado apical (lumen L) hacia el lado basal (línea amarilla). Tenga en cuenta que las células dentro de los núcleos en empalizada de la exhibición VZ, sugiriendo que son células gliales radiales. El panel derecho muestra la tinción de inmunofluorescencia de NPC nestina positiva (verde) en el VZ y neuronas Tuj1-positivos (magenta) de la placa cortical primitivo. Barra de escala = 50 m. (F) de formación de imágenes de inmunofluorescencia de organoides cryosectioned. dos ejemplosde VZS teñidas con p-Vim y Arl13b (I y III). Las regiones marcadas por cuadrados blancos se magnifican a la derecha para cada inserción de imágenes (II y IV). El plano de división de la anafase apical células gliales radiales (args). La división de las células gliales radiales apicales en el lado apical de la VZ son p-Vim-positivos (magenta). Ejemplos para args simétricamente en división se muestran (cuadrados blancos y inserciones). El plano de división se da como una línea blanca. El plano de división de una célula anafase es horizontal a la línea de superficie lumen (amarillo línea de puntos) y está marcada por tinción Arl13b (verde). Barra de escala = 50 m. (G) Este esquema proporciona la orientación vertical u horizontal de args en la anafase en relación con el lumen. Las células que se dividen de organoides de control en el día 14 son en su mayoría orientadas horizontalmente (0-30 °) con respecto a la superficie de la luz de la VZ. El lado apical del lumen está revestida por los cilios primarios de args, que especifican la superficie de la luz de la VZ (línea verde). En contraste, most de las células gliales radiales de organoides microcefalia mostrar una (60-90 °) plano de división orientado verticalmente. La línea blanca muestra el eje del plano de división. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Problema: | Posibles razones: | sugerencias: |
| paso 1.1.1.2 | Una pobre eficiencia de reprogramación | Compruebe hiPSCs para los marcadores de pluripotencia: si la calidad es baja, recoger manualmente las colonias no diferenciadas para los pocos pasajes para enriquecer colonias pluripotentes |
| iPS humanas se diferencian antes del inicio de la diferenciación | ||
| El estrés debido a los pases temprano o passaging células como individuales | No se alcanza pasaje que 80% de confluencia. Passage como agregados, células no solo | |
| La contaminación con micoplasma | Prueba para contaminación por micoplasma | |
| Paso 2 | La mala calidad de hiPSCs | Mejorar la calidad de hiPSCs (véase más arriba) |
| Neuroesferas no se forman en absoluto o se deshacen en el día 5 después del inicio de la diferenciación | A partir del número de células por pozo es demasiado bajo o demasiado alto | Precisa contar el número de células y distribuirlos por igual en cada pocillo |
| medio hiPSC se utilizó en lugar de medio de diferenciación neural | Utilizar un medio de diferenciación neuronal | |
| paso de centrifugación era demasiado dura o suave a | Girar placa de 96 pocillos 500 xg durante 3 min y comprobar si las células acumulan centralmente en elfondo de cada pocillo | |
| Sin Y27632 al inicio de la diferenciación | Use Y-27632 para mejorar la supervivencia de las células | |
| Células unidas y crecieron en la parte inferior de la placa | Asegúrese de que se utiliza un no adherente placas de 96 pocillos de fondo en v. | |
| Paso 2 | Sin cambio de medio diario | Cambiar la mitad de la cantidad diaria media |
| Neurospheres no son homogéneas en tamaño | A partir del número de células por pozo no era igual | Mezclar el tubo con suspensión de células individuales cada vez antes de sacar 100! L de suspensión celular |
| cambio de medio no se hizo para cada pozo diaria | Asegúrese de que todos los pozos se cambio de medio diario | |
| Paso 2 | hiPSC no se disociaron into células individuales antes del inicio de la diferenciación | Compruebe bajo el microscopio si hiPSC se disocian a células individuales después del tratamiento Accutase. Si todavía hay agregados, las células de pipeta 10 veces arriba y abajo con 100 micropipeta l y comprobar de nuevo o repetir Accutase tratamiento |
| Neurospheres no muestran un borde brillante o superficie redonda; forman quistes grandes en la superficie | A partir del número de células por pocillo era demasiado alto | Precisa contar el número de células y distribuirlos por igual en cada pocillo |
| el cambio medio no se realiza diariamente para cada pozo | Cambiar la mitad de la media diaria | |
| Paso 2.7 | La mala calidad de hiPSCs | Mejorar la calidad de hiPSCs (véase más arriba) |
| EHS matriz incrustada neuroesferas palo y se agrupan | Insuficiente de medio (volumen) | Proporcionar unamínimo de 10 ml de medio en una placa de Petri de 100 mm |
| Estantería de incubadora ni siquiera | Coloque el plato sobre una superficie plana | |
| Después de colocar en la incubadora, mover el plato de manera que neuroesferas se distribuyen uniformemente |
Tabla 1: Tabla de solución.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH es un trastorno del desarrollo neurológico humano complejo que no puede ser recapitulado en modelos animales in vivo o in sencilla cultivo de células humanas se acerca in vitro. La manifestación clínica de MCPH comienza a aparecer durante el primer trimestre, cuando comienza temprano neurogénesis. Por lo tanto, organoides cerebrales 3D representan un sistema experimental fiable para modelar el desarrollo MCPH. Además, 3D organoides cerebro humano son un enfoque ideal ya que i) que permiten la adaptación de un espectro de muestras de pacientes con diferentes fondos genéticos, ii) que muestran tejido organizado que contiene diferentes tipos de células neuronales, y, de manera importante, iii) diversos diferenciación etapas de desarrollo neurológico en este enfoque in vitro están vinculados a sus contrapartes en vivo 25, 26, 27. Por ejemplo, la roseta neural es una estructura equivalente a la neural en desarrollotubo.
Lancaster et al. se usa dos veces el número de iPSCs paciente comparación con el control iPSCs con el fin de tener éxito en la generación de organoides paciente. De nota, con el protocolo descrito aquí, mediante la modificación de los métodos existentes, podríamos generar control y organoides cerebrales microcefalia a partir de los mismos números de teléfono 4. Esto fue posible debido a las condiciones de cultivo definidas de iPSCs y debido a una diferenciación más dirigida. En este protocolo, la generación de organoide se mejoró mediante la sustitución de la etapa de formación de EB comúnmente realizado mediante el inicio de la diferenciación neural directamente de iPSCs. En segundo lugar, en el paso 3, dorsomorphin y SB431542 se complementaron en el medio de cultivo en lugar de ácido retinoico solo. El ácido retinoico se isomeriza fácilmente cuando se aplica a medio de cultivo celular 28. Por lo tanto, su actividad biológica es menos definida que la de los compuestos más estables, tales como dorsomorphin. inhibe Dorsomorphinla vía de señalización de BMP4, y SB431542 es un inhibidor de la vía de señalización de activina / nodal (TGF-β1 ALK inhibidor). Una combinación de ambos compuestos conduce a la inhibición de la BMP y la vía de señalización de activina / nodal, induce la diferenciación neural, y reduce la diferenciación en otros linajes en diversas líneas celulares de ES humanas o células iPS humanas con una eficiencia similar 29. Estabilidad Compuesto y respuesta de células universal a un compuesto son puntos importantes para el establecimiento de un protocolo que se puede aplicar a diferentes líneas de células de pacientes para modelar una enfermedad in vitro. Por lo tanto, un robusto y eficientes resultados de diferenciación en el cerebro homogénea organoides culturas y, eventualmente, en datos más reproducibles.
Con estas modificaciones, los pasos críticos en el protocolo se reducen al mínimo para la iniciación de la diferenciación en el paso 1. En este punto, es importante para disociar suavemente los iPSCs en una suspensión de una sola célula de unand para distribuir con precisión y de manera uniforme a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. asociada a Rho inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632) debe ser añadido a medio B durante las primeras 24 h, ya que soporta la supervivencia de iPSCs a su disociación de células individuales. Es importante traer células en estrecho contacto entre sí al girar hacia abajo hasta el fondo de los pozos. Una vez neuroesferas se forman al final de la etapa 1, la finalización con éxito de los procedimientos adicionales experimentales se puede esperar. En caso de que no forman neuroesferas, la pluripotencia de las iPSCs humanos, la no adherencia de las células en la placa de 96 pocillos, y las condiciones de centrifugación debe ser comprobado. Todo el procedimiento en el día 0 de la etapa 1 no más de 1 h debe tomar debido a la sensibilidad de iPSCs humanos. cambios de medio durante los siguientes días debe hacerse con cuidado, evitando fuerzas de cizallamiento, con el fin de no destruir células contactos recién formadas entre las células.
Es de destacar que centrosomAL mutantes tienen la proliferación celular defectuosa y la dinámica del ciclo celular alteradas. Por lo tanto, el modelado MCPH requiere un protocolo de gran alcance que puede soportar las funciones celulares comprometidas. Por lo tanto, el protocolo actual permite la generación de organoides homogéneos de alta calidad y sirve como una herramienta única para estudiar la homeostasis de células madre en el VZ. En contraste con otros protocolos, este protocolo permite la generación de organoides de iPSCs de control y de pacientes a partir de los números de células iguales. Para los estudios basados en la diferenciación in vitro, las condiciones de cultivo idénticas para diferentes iPSCs son un requisito básico para identificar alteraciones relacionadas con la enfermedad y para evitar artefactos de cultivo acondicionado. Además de modelo microcefalia de origen genético, este protocolo también se puede aplicar a la microcefalia de origen no genético, incluidos los de las infecciones virales neurotróficos, productos químicos o radiación. 30 Además, las herramientas de biología molecular modernas, como CRISPR / Cas9 genoma-editing tecnologías, se puede aplicar a organoides 3D para diseccionar los aspectos específicos del paradigma desarrollo del cerebro humano in vitro 31, 32, 33.
Por otro lado, la generación de organoides cerebrales hasta la fecha aún no se ha ido más allá de la primera y principios del segundo trimestre del desarrollo humano 34. Superando esta limitación y que permite la generación de organoides cerebrales maduras in vitro sería abrir nuevas vías para modelar trastornos neurodegenerativos que se manifiestan en etapas posteriores, como la de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Para futuras aplicaciones, los protocolos de dirigir la diferenciación a las regiones más específicos, como el prosencéfalo o cerebro medio, podría ser de interés para estudiar trastornos neurológicos complejos como el autismo y la esquizofrenia 35, 36, 37, 38.
Es importante destacar que ciertos aspectos deben tenerse en cuenta a la hora de sacar conclusiones de los estudios organoides. La primera limitación es que no hay vascularización obvia en organoides. Por lo tanto, el intercambio gaseoso y el suministro de nutrientes in vitro solamente aproximarse a las condiciones in vivo. En segundo lugar, desde organoides cerebrales no están conectados a los sistemas de órganos complejos, el modelo organoide carece de un inmune completa, metabólicas, y el sistema hormonal. Sin embargo, la ausencia de estos aspectos a veces proporciona una ventaja. Por ejemplo, los organoides descritos aquí podrían reemplazar inmunosuprimidos en modelos in vivo cuando frente a los efectos del sistema inmune en la patogénesis de trastornos cerebrales.
Con el uso de matraces de agitación, un gran número de organoides puede ser generado para experimentos bioquímicos, análisis de toda la secuenciación del transcriptoma, y exámenes de drogas de alto rendimiento. Tomados en conjunto, por ucantar este protocolo actual, se pueden generar organoides cerebrales de células iPSCs humanos, que luego se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones, desde la modelización de enfermedades a las plataformas de pruebas de drogas, con el fin de sustituir de forma fiable los ensayos con animales en el futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Estamos muy agradecidos a la instalación de la incrustación de tejidos y la facilidad de la base del microscopio de CMMC. Estamos muy agradecidos por las discusiones y soporte técnico proporcionados por los miembros del Laboratorio de Biología del centrosoma y el citoesqueleto. Agradecemos a Li Ming Gooi para la corrección del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
