Introduction
Menschliche Entwicklung des Nervenstörungen, wie Mikrozephalie, nur schlecht in Tiermodellen untersucht werden, aufgrund der Tatsache, dass das menschliche Gehirn haben eine erweiterte kortikalen Oberfläche, ein einzigartiges Merkmal der sich von nicht-menschlichen Tieren.
Dieser Aspekt macht die menschliche Entwicklung des Gehirns einen komplexen Prozess, der nicht ausreichend in einem 2D untersucht werden, in vitro Zellkultursystem. Schwellen 3D-Kulturtechniken ermöglichen die Erzeugung von gewebeähnlichen Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Die in - vitro - Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in einer 3D - Suspensionskultur ermöglicht die Bildung von verschiedenen Zelltypen in einer angemessenen und regionsspezifische Weise, was zu einem organisierten, geschichteten Gewebe 1, 2, 3. Dank Laboratorien, die 3D-Kulturtechnologien Pionierarbeit geleistet und die Komplexität der Organbildung entmystifiziert, aus Stammzellen beginnen,entwickeln wir eine robuste Methode Gehirn Organoide der Erzeugung frühe Ereignisse der menschlichen Gehirn Entwicklung zu beschreiben und Mikrozephalie in vitro 1, 2, 3 zu modellieren. Es ist bemerkenswert , dass wir die ursprüngliche Methode , entwickelt von Lancaster et al angepasst. zerebrale Organoide 1 zu erzeugen. Diese Methode wurde nach unseren experimentellen Anforderungen modifiziert.
Das Ziel einer Studie von Gabriel et al. war die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Stammzell Wartung während der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Um dies zu tun, wurde eine mechanistische Studie durch die Analyse von neuralen Vorläuferzellen (NSC) in 3D durchgeführt Gehirn Organoide von einem Patienten stammte Mikrocephalie 4. Dieser Patient trug eine Mutation in CPAP, ein konserviertes Protein zentrosomalen für Zentrosom Biogenese 5 erforderlich. Eine weithin akzeptierte hypoThese ist , dass Mikrocephalie das Ergebnis einer Erschöpfung des NPC - Pools ist, und dies könnte entweder zum Zelltod oder zu einem vorzeitigen Differenzierung 1, 6, 7, 8, 9 liegt.
Durch die Analyse der ventrikulären Zonen (VZs) von Mikrocephalie brain Organoiden, wurde gezeigt , dass eine beträchtliche Anzahl von NSC asymmetrischer Zellteilung zu unterziehen, im Gegensatz zu Gehirn Organoide von einem gesunden Spender stamm 4. Umfangreiche mikroskopische und biochemische Analysen von microcephalic Gehirn Organoide ergab eine unerwartete Rolle für CPAP in rechtzeitige Zilien Demontage 4. Insbesondere mutierte CPAP mit retardierten cilium Demontage- und verzögerte Zellzyklus - Wiedereintritt verbunden ist , auf die Differenzierung von vorzeitiger NSC führenden 4. Diese Ergebnisse legen nahe, eine Rolle für Zilien in Mikrozephalie und thEIR Beteiligung während der Neurogenese und Gehirngröße Kontrolle 10.
Der erste Teil dieses Protokolls ist eine Beschreibung eines dreistufigen Verfahrens homogene brain Organoiden zu erzeugen. Wie bereits erwähnt, wurde das ursprüngliche Lancaster Protokoll angepasst und modifiziert unser Ziel 1 zu entsprechen. Erstens sind menschliche iPSCs Kultur in einem definierten feeder freien Zustand auf Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix. Dieser Schritt vermeidet die Variationen von Feeder-abhängigen pluripotenten Stammzellkulturen. In diesem Protokoll zur Induktion neuronaler Differenzierung zu bilden direkt von iPSCs neuralen Epithel beginnt. Durch den Embryoidkörper (EB) Bildungsschritt übersprungen, die neurale Differenzierung erfolgt in einer kontrollierteren und Weise gerichtet. Dieser Ansatz begrenzt die spontane und ungerichteten Bildung anderer Keimzellschichten, wie Mesoderm und Endoderm. Durch dieses Protokoll anwenden, können Neurosphären neuronale Rosetten enthalten am Tag geerntet werden 5 für EHS-Matrix und Einbettung stationäre Suspensionskultur. Das organoiden Medium für den dritten Schritt unseres Protokolls verwendet wird mit Dorsomorphin und SB431542 ergänzt. Dorsomorphin ist ein niedermolekularer Inhibitor von knochenmorphogenes Protein (BMP) und SB431542 hemmt die TGF & bgr; / Activin / Knoten Signalweg. Die Kombination dieser Faktoren könnte neuronale Differenzierung mehr fördert effizienter als Retinsäure allein 11, 12, 13, 14.
Insgesamt ermöglichen diese Modifikationen die reproduzierbare Erzeugung von brain Organoide mit minimalen Variationen in Organoiden. Wichtig ist, dass diese Methode microcephalic Gehirn Organoide von Patienten zu iPSCs robust erzeugt aufgebracht, die Mutationen in Genen tragen, die Zentrosomen und Zellzyklusdynamik beeinflussen.
Der zweite Teil dieses Protokolls gibt Anweisungen br vorzubereitenain Organoide für die Analyse und Interpretation von zellulären Defekte in Mikrozephalie. Dazu gehören Fixierung, Kryoschneiden, Immunofluoreszenzfärbung und konfokale mikroskopische Analyse. Dieses Protokoll wird dem Leser eine detaillierte Beschreibung der erwarteten Ergebnisse liefern und mit Anleitung zur Interpretation.
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Protocol
1. Erzeugung von Brain Organoide (23 Tage)
- Initiierung von Neuroektoderms (5 Tage)
HINWEIS: Die folgenden Punkte sollten vor dem Beginn der Differenzierung in Betracht gezogen werden. Die Umprogrammierung Methode (lentiviral-, Sendai-Virus-, Episomen oder microRNA-Basis etc.) menschlichen iPSCs erhalten sollte idealerweise die gleiche für alle Patienten und iPSC Leitungen steuern. Verschiedene Umprogrammierung Kits und Anweisungen auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle sind 15, 16, 17, 18. Die Qualität der menschlichen iPSC Linien ist der Schlüssel für eine optimale Differenzierung zu erreichen. Überwachen Kolonie und der Zellmorphologie mit einem Mikroskop und validieren Pluripotenz durch Testen der Expression von Markern wie Oct3 / 4, Nanog oder TRA-1-60.- Kultur menschlicher iPSCs unter feeder freien Bedingungen in Medium A auf einem Teller beschichtet mit Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) Matrix.
HINWEIS: Wachsen menschliche iPSCs feeder freie und serumfreien Kultur mit einem definierten Zustand zu erhalten und einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) vor Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Die optimale Durchgangszahl für die menschlichen iPSCs zur Differenzierung im Bereich von Kanal 15 bei Neuprogrammierung zu Durchgang 70 insgesamt zu starten. Wenn Passagierung lösen hiPSC Kolonien als Zellen, die mit geringer mechanischer Belastung eine geeignete Zellentfernungslösung aggregate verwendet und eine 2-ml serologische Pipette Aggregate auf eine neue Schale zu übertragen. Vermeiden Sie Dissoziation auf einzelne Zellen, wie diese Differenzierung induzieren könnte und Apoptose in den meisten iPSC Linien. Es wurde berichtet , dass eine langfristige, Single-Cell - Passagierung genomische Veränderungen in der menschlichen 19 iPSCs erhöhen könnte, 20. Vermeiden Zellablösung Verfahren, die einen Zentrifugationsschritt erforderlich Entfernungslösung zu entfernen, da dies die Gesamtfähigkeit der iPSCs reduziert. Testalle Kulturen für mikrobielle Kontaminationen, insbesondere Mykoplasmen, auf einer regelmäßigen Basis, denn dies könnte die Qualität der iPS-Zellen und deren Differenzierungsfähigkeit verändern.- Mantel eine 60 mm-Gewebekulturschale mit EHS-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Auftauen eines Aliquots von 1 × 10 6 menschlichen iPSCs. Same ist das iPSCs in einer 60-mm - Gewebekulturschale in beschichtet EHS - Matrix und die 5 ml Medium A (siehe Materialien Tabelle). Ändern Sie das Medium täglich und Durchgang nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz.
HINWEIS: Die Passage die aufgetaute iPSCs bei 80% Konfluenz unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise die enzymfreie Ablösung von Kolonien 21, mindestens einmal , bevor die Differenzierung beginnt. Kurz gesagt, entfernen Sie das iPSC Medium, waschen Sie die einmal Zellen mit vorgewärmten 37 ° C Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12) und inkubieren Sie die iPS-Zellen nach Angaben des HerstellersReagenz A Anweisungen (siehe die Material Tabelle). Überschreiten Sie die empfohlene Inkubationszeit nicht um Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden. Menschliche iPS sollte abgelöst und variabel als Aggregate werden, nicht als einzelne Zellen. Sie können dann auf neue EHS-Matrix-beschichteten Schalen übertragen werden; iPSC beispielsweise Aggregate, die aus einer 60-mm-Schale zu 4 neuen Schalen mit 60 mm verteilt werden kann. - Überprüfen Sie für Mykoplasmen mit einem Mycoplasma Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur Mycoplasma frei iPSCs, wie Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von iPS-Zellen verändern können.
- Dissoziieren iPSCs (80% konfluent) und bereite Reagenz B. eine Einzelzellsuspension unter Verwendung von
- Waschen Sie die iPSCs einmal mit vorgewärmten (37 ° C) DMEM / F12.
- Fügen vorgewärmten Reagens B ( zum Beispiel 1 ml in einer 60 mm - Schale) und inkubiere die iPSCs für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Flick 20 mal mit einer Fingerspitze auf den Seiten und am Boden vondie Schale, die die iPSCs abzulösen. Überprüfen Sie für die Ablösung von Zellen unter dem Mikroskop.
- Pipette, um die Zellsuspension nach oben und unten in der Schüssel 5 mal mit einer 1-ml-Mikropipette.
- 3 ml Medium A 1 ml Reagens B zu verdünnen und die Zellsuspension in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.
- Spin-down vorsichtig die iPS-Zellen (500 × g) für 4 min bei Raumtemperatur.
- Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Medium B, und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.
Hinweis: Beachten Sie nur Medium B für Aufwirbelung mit. Vermeiden Medium A verwendet wird, da sie eine zu hohe Konzentration an bFGF enthält, die die Differenzierung inhibieren könnten.
- Verdünne die Zellsuspension auf 4,5 x 10 5 Zellen pro ml in Medium B , ergänzt mit 10 & mgr; M rho-assoziiertes Protein - Kinase - Inhibitor (Y-27632).
- Je 100 & mgr; l pro Vertiefung in einer nicht-haftenden, V-Boden, 96-Well-Platte.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im sus verteiltpension von der Röhre ausgeschüttelt, bevor 100 ul-Portionen Entnahme. Es ist wichtig, dass jede Vertiefung eine äquivalente Anzahl von Zellen, um Neurosphären enthalten sollte homogen in der Größe und Form (rund, definierten Oberflächen) zu erhalten. - Spin sanft die Platte mit den Zellen nach unten bei 500 xg und Raumtemperatur für 3 min und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Ändern Sie das Medium täglich um 50 & mgr; l Entfernen und Hinzufügen von 50 & mgr; l frischem Medium B in jede Vertiefung für die nächsten 5 Tage.
- Kultur menschlicher iPSCs unter feeder freien Bedingungen in Medium A auf einem Teller beschichtet mit Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) Matrix.
2. Embedding Neurosphären in EHS-Matrix (4 Tage)
- Bereiten Neurosphäre Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 ohne (w / o) Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / L insulin, und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
- Sammeln Sie die Neurosphären witha 200 & mgr; l Mikropipette eine ~ 2 mm Spitze zuvor geschnitten mit einer sterilen Schere verwenden.
- Platzieren Sie die Neurosphären etwa 5 mm voneinander entfernt auf Paraffinfilm (3 x 3 cm 2) in einer leeren 100 - mm - Schale und vorsichtig entfernen , so viel des verbleibenden Mediums wie möglich.
- Einen Tropfen (7 & mgr; l) von EHS Matrix auf jeden einzelnen Neurosphäre.
- Inkubieren der Matrix mit den EHS Neurosphären für 15 min in einem Inkubator abfällt.
- Waschen Sie die Neurosphären vorsichtig aus dem Paraffinfilm, indem sie mit Neurosphere Spülmedium. Zu spülen, verwenden, um eine 1 ml-Mikropipette und 100 mm-Petrischale, die 10 ml Medium Neurosphäre.
- Inkubiere die Neurosphären für die nächsten 4 Tage und mit 2 ml frischem Neurosphere Medium am Tag 2.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Regale in dem Inkubator flach sind, so dass die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären nicht zusammen auf einer Seite des Tellers verklumpen werden.
3. Organoide in einem Rotations SuspensionKultur (14 Tage)
- Bereiten brain organoiden Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 w / o Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / l Insulin, 0,5 uM Dorsomorphin, 5 & mgr; M SB431542 und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
- 100 ml Gehirn organoiden Medium zu jedem Zentrifugenkolben durch seine Seitenarme und sie in einem Inkubator für die Vorwärmung für mindestens 20 min.
- Stellen Sie ein mitreißendes Programm bei 25 Umdrehungen pro Minute auf, nach dem Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Bevor Sie die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären in Rotationskolben übertragen, stellen Sie sicher, dass sie alle voneinander getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch EHS-Matrix verbunden sind, trennen sie von der Verbindungsmatrix mit einem Skalpell geschnitten wird. - übertragen sorgfältig die EHS-Matrix eingebettet Neurosphären in Rotationskolben, enthaltend 100 ml Medium organoiden using eine 2 ml serologische Pipette. Verwenden, um die Seitenarme des Spinner-Flasche, die Neurosphären in den Kolben zu übertragen.
- Platzieren Sie die spinner flasks auf einem Magnetrührstab Plattform in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2; dies ist Tag 0 der organoiden Kultur.
- Ändern Sie das Medium einmal pro Woche (oder öfter, wenn es eine Farbänderung) um die Hälfte des Mediums entfernt und Zugabe der gleichen Menge an frischem Medium.
HINWEIS: aus dem Inkubator Wenn die Spinnerflaschen nehmen, warten 3-5 min die Organoide sinken bis auf den Boden des Kolbens zu lassen. Entfernen des Mediums durch die Glaspipettenspitze Platzierung (mit einer Pumpe) auf der Oberfläche der Flüssigkeit; anzusaugen, das Medium vorsichtig durch eine Seitenöffnung / Arm des Kolbens. Diese Manipulationen müssen unter der laminaren Haube erfolgen.
4. Analyse von Brain Organoide
- Fixierung von Organoiden
- Sammeln Sie die Organoide am Tag 14 der Rührflasche Kultur with einen Schnitt 1 mL Mikropipette (cut ~ 5 mm). Legen Sie alle von ihnen in einer 60-mm-Schale und waschen Sie sie einmal mit 5 ml warmem DMEM / F12 für 3 min.
- Vorbereiten ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 & mgr; l warm 4% Paraformaldehyd (PFA).
Achtung: Tragen Sie Haut- und Augenschutz und das Arbeiten unter der Schutzhaube bei PFA Fixativ Handhabung. - Platzieren jeder organoiden separat in jedem Röhrchen und fixieren sie für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sie nicht die Organoide länger als 60 min beheben. Um die Organoide zu bewegen, eine Impföse oder andere devise verwenden, die bequem ist.
- Entfernen Sie die PFA und wäscht die Fest Organoide zweimal für jeweils 10 min mit 1 ml PBS.
- Lagern Sie die Organoide in 1 ml PBS bei 4 ° C für bis zu 7 Tage, bis zur weiteren Verwendung.
- Das Einbetten der Organoide für Kryoschneiden
- Entfernen Sie die PBS und füge 1 ml 30% Saccharose in destilliertem Wasser Lösung pro Röhrchen der Organoiden zu entwässern, bevor sie cryofreezing; nach der Zugabe von Sucrose Lösung sollte die Organoide an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoide über Nacht in Saccharose-Lösung bei 4 ° C; am nächsten Tag haben die Organoide sollten den Boden des Röhrchens herabgesunken.
HINWEIS: Organoide kann für bis zu 3-5 Tage bei 4 ° C in einer Zuckerlösung bei Bedarf gespeichert werden. - Füllen eine Vinylprobenform mit 400 ul optimaler Schnitttemperatur (OAT) -Verbindung und die Verwendung eine Impföse eine organoiden in der Mitte der Form zu platzieren. Beschriften den Rand der Form mit dem Probennamen.
- Einfrieren die organoiden haltigen Form bei -80 ° C bis Kryoschneiden.
- Coat Glas cryoslides mit 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) in PBS für 5 min bei Raumtemperatur und ließ die Objektträger trocknen 3 Stunden. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C und erwärmen sie vor dem Gebrauch auf Raum gemäßigten bis.
HINWEIS: Die PLL-Beschichtung ist ein wichtiger Schritt, da er die organoiden Scheiben aus davonzuschweben zu verhindern. Sammeln und Speichern von PLL-Lösung bei 4 ° C für bis zu 3Monate. Vor der Wiederverwendung filtert es mit einer 0,22-um-Spritze und lassen Sie es auf Raumtemperatur warm. - Abschnitt cryofrozen Organoiden in 20-50 um dicke Scheiben auf PLL-beschichtete Glas cryoslides 22. Lassen Sie die Folien mit den Abschnitten 1 h bei Raumtemperatur trocknen. Speichern der Abschnitte bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
- Entfernen Sie die PBS und füge 1 ml 30% Saccharose in destilliertem Wasser Lösung pro Röhrchen der Organoiden zu entwässern, bevor sie cryofreezing; nach der Zugabe von Sucrose Lösung sollte die Organoide an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoide über Nacht in Saccharose-Lösung bei 4 ° C; am nächsten Tag haben die Organoide sollten den Boden des Röhrchens herabgesunken.
5. Immunfluoreszenzanfärbung von organoiden Sections
HINWEIS: Für die allgemeine Charakterisierung von Organoiden, mit nestin Färbung, ein neuralen Vorläufer Marker und TuJ1, ein pan-neuronalen Marker, wird empfohlen. Als weitere Beispiele, Immunofluoreszenzfärbung mit phospho-Vimentin (p-VIM), die mitotische apikalen radialen Gliazellen Etiketten und Arl13b, für Flimmer, werden beschrieben. Um zu testen, die Apoptose, verwenden Sie die Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) -Test. Legen Sie die Folien in einer Kunststoff-Box während der Inkubationen sie vor Staub zu schützen, Licht,und auszutrocknen.
- Tauen Sie die Folien für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen des Objektträgers zweimal mit 200 ul PBS-Glycin (0,225 g Glycin in PBS) für 3 min, um die PFA-induzierte Autofluoreszenz zu löschen.
- Permeabilisieren die Abschnitte mit 200 ul 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie sie zweimal mit 200 ul PBS-Glycin-Lösung für 3 min.
- Inkubieren sie mit 200 ul 0,5% Fischgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Bindung unspezifischer Antigen zu blockieren.
HINWEIS: Wenn ein TUNEL-Test erforderlich ist, führen Sie den Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Beginnen Sie mit dem TUNEL-Test vor der Immunfärbung durchgeführt wird, wie es mit sekundären Antikörpern stören könnten und Fluorophore löschen, wenn danach verwendet. - Verdünne die Antikörper in Blocking-Lösung in den folgenden Konzentrationen: Nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TuJ1, 1: 200;Arl13b, 01.20; und sekundärer Antikörper, 1: 1000.
- Inkubieren mit 200 & mgr; l der ersten primären Antikörpern (zB Nestin) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
- Verdünne die erste (anti-Maus 488) Sekundärer Antikörper: 1: 1000 in Blocking-Lösung und den Objektträgers in 200 & mgr; L für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Von nun an schützt immer die Folien aus Licht.
- Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
- Inkubieren mit 200 & mgr; l des nächsten primären Antikörper (zB TuJ1) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
- Füge 200 & mgr; L des nächsten sekundären Antikörpers (Anti-Kaninchen-647) für 1-2 h bei Raumtemperatur.
- Waschen 3 x 3 min. mit 200 ul Blockierungslösung.
- Füge 200 & mgr; l von 4' , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer 30 nM concentration in PBS für 15 min bei Raumtemperatur für die Kernfärbung.
- Waschen 2 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
- Wäsche 1 x 1 min mit 200 ul destilliertem Wasser und lassen die Abschnitte für 10-20 min trocknen, bis kein offensichtlicher Wassertropfen mehr sichtbar ist.
- Montieren der Schnitte mit Medium einbettet. Lagern Sie sie von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu mehreren Wochen.
- Fahren Sie mit der mikroskopischen Analyse zu Bild einen Überblick über die organoiden, ventrikulären Zone, primitive Kortikalplatte und andere Bereiche von Interesse.
- Verwenden , um ein konfokales Mikroskop mit einem Objektiv und 63X Ölfluoreszenzfilter, ausgewählt gemäß dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sekundärantikörper 1 verwendet wird , 10.
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Representative Results
Die Erzeugung von brain Organoide erfordert mindestens drei Wochen ununterbrochener Kultivierung (1A). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen, empfehlen wir, dass die Forscher jeden Schritt dokumentiert und, was wichtig ist, vermeidet jegliche Änderungen in Bezug auf Medienkomponenten, Zeitpunkte und die Handhabung von Zellen. Hier geben wir einen Überblick darüber, wie zu beurteilen, ob kritische Meilensteine erreicht, um sich Organoide von ausreichender Qualität am Ende des Experiments zu erhalten. Die Bildung von Neurosphären in einer 96-Well - Platte soll von Tag deutlich sichtbar sein 4. Neurosphären können als gut definierten Bereichen auf dem Boden jeder Vertiefung (1B, Schritt 1) erkannt werden.
Am Tag 5 sollte neurospheres ~ 500 & mgr; m im Durchmesser sein und eine glatte Oberfläche, mit einem hellen Rande weist eine dunkele Mitte umgibt. Es könnte möglich sein, bereits neuronale rosettenartigen erweitert stru zu beobachtenctures innerhalb dieser hellen Rand (1C, von Schritt 2 beginnen). Wenn die Neurosphären auseinander fallen oder erscheinen eher wie Zellaggregate, die Differenzierung soll nicht weiter fortgesetzt werden. Schließlich Organoide sollten eine ähnliche Größe während des Differenzierungsprozesses in Spinnerflaschen (1D, Schritt 3) erhöhen und zeigen. Siehe die Tabelle zur Fehlerbehebung (Tabelle 1) für weitere Informationen.
Die Qualität der Kindertages 14 Organoide sollte durch Lichtmikroskopie überprüft werden. VZs besteht aus dicken Schichten aus Nestin-positiver NSC / radial Gliazellen mit einer Palisade Kernform an der apikalen Seite. Auf der anderen Seite werden die primitiven Kortikalis reichlich TuJ1-positiven Neuronen auf der basalen Seite enthalten, räumlich getrennt von der apikalen Seite (Figur 1E). Wichtig ist, TuJ1-positive Neurone werden sollten nicht an der apikalen Seite der VZ gesehen.
(1F und G) 23,24. Wenn ausreichend ARG Expansion erreicht ist, beginnt die Neurogenese, ändern sich die teilender Zellen , ihre Ausrichtung auf das Lumen und die Teilungsebene schaltet von horizontalen (symmetrisch) zur Vertikalen (asymmetrisch) 4, 12, 24.
Abbildung 1: Erzeugung von Gehirn Organoide von Human iPS - Zellen. (A) Arbeitsablauf des Differenzier Protokolls. Schritt 1: Starten der Differenzierung. Während dieser Phase tritt die Bildung von Neurosphären aus menschlichem iPSCs in einer 96-Well-Platte. Die Zeitdauer beträgt 5 Tage. Schritt 2: Einbetten der Neurosphären in EHS Matrixtröpfchen. Ein stationärer Suspensionskultur von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären hat eine Zeitdauer von 4 Tagen. Schritt 3: Organoide in Spinnerflaschen. Die Übertragung von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären flasks Spinner erfolgt. Die Zeitdauer beträgt 14 Tage. (B) ein Neurosphäre in einer Multi-Well - Platte. Repräsentative Bild eines Neurosphere am Tag 4 in einer 96-Well-Platte in Schritt 1 dargestellt. Die Kugel sollte mit einer glatten, runden Oberfläche (rot arro auf dem Boden des Schachtes, deutlich sichtbar seinw). (C) Morphology of Neurosphären vor der EHS - Matrix Einbettung. Neurospheres am Tag gesammelt 5 von Schritt 1 sollte groß und weisen eine glatte Oberfläche mit einem hellen Rand (Halterung und Pfeil) gleichmäßig sein. (D) Organoide in Spinnerflaschen. Ein Rührkolben mit Gehirn Organoide während Schritt 3 (rote Pfeile) wird hier gezeigt. (E) Immunfluoreszenz - Bildgebung von gefriergeschnitten Organoide einen typischen VZ und primitive kortikale Platte anzeigt. Die linke Tafel zeigt die Kernfärbung von Zellen an der VZ. Die VZ erstreckt sich von der apikalen Seite (Lumen L) zu der basalen Seite (gelbe Linie). Man beachte, dass Zellen innerhalb der Anzeige VZ Palisade artigen Kerne, was darauf hindeutet, dass sie Gliazellen radial sind. Die rechte Tafel zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Nestin-positiver NSC (grün) innerhalb der VZ und TuJ1-positiver Neuronen (magenta) in der primitiven Kortikalis. Maßstabsbalken = 50 um. (F) Immunfluoreszenz - Bildgebung von Organoiden gefriergeschnitten. zwei Beispielevon VZs gefärbt mit p-Vim und Arl13b (I und III). Die durch weiße Quadrate markiert sind rechts für jede Bildeinfügung (ii und iv) vergrößert. Die Teilungsebene der Anaphase apikalen radialen Gliazellen (args). Dividieren apikalen radiale Gliazellen an der apikalen Seite der VZ sind p-Vim-positive (magenta). Beispiele für symmetrisch Dividieren args gezeigt sind (weiße Quadrate und -einsätze). Die Teilungsebene ist als eine weiße Linie angegeben. Die Teilungsebene eines der Anaphase Zelle ist horizontal an die Lumenoberfläche Linie (gelb gepunktete Linie) und wird durch Arl13b Färbung (grün) markiert. Maßstabsbalken = 50 um. (G) stellt diese schematisch die vertikale oder horizontale Ausrichtung des ARG in der Anaphase relativ zu dem Lumen. Die sich teilende Zellen von Kontroll Organoide am Tag 14 werden überwiegend horizontal ausgerichtet (0-30 °) relativ zu der Lumenoberfläche des VZ. Die apikalen Seite des Lumens durch die primären Zilien von args ausgekleidet, die die Lumenfläche der VZ (grüne Linie) angeben. Im Gegensatz dazu most die radialen Gliazellen Mikrocephalie Organoide zeigt eine vertikal ausgerichtete (60-90 °) Teilungsebene. Die weiße Linie zeigt die Achse der Teilungsebene. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Problem: | Mögliche Gründe: | Vorschläge: |
| Schritt 1.1.1.2 | Schlechte Effizienz der Reprogrammierung | Prüfen hiPSCs für Pluripotenz Marker: Wenn Qualität niedrig ist, manuell undifferenzierte Kolonien holen für einige Passagen pluripotente Kolonien zu bereichern |
| Menschliche iPS-Zellen differenzieren vor Beginn der Differenzierung | ||
| Stress aufgrund der frühen Passagierung oder passaging als einzelne Zellen | Nicht Passage vor Konfluenz von 80% erreicht ist. Passage als Aggregate, nicht einzelne Zellen | |
| Kontamination mit Mykoplasmen | Test für Mykoplasmen-Kontaminationen | |
| Schritt 2 | Schlechte Qualität des hiPSCs | Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) |
| Neurosphären überhaupt nicht oder nicht auseinander fallen am Tag 5 nach dem Beginn der Differenzierung bilden | Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung ist zu niedrig oder zu hoch | zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung |
| hiPSC Medium wurde anstelle von neuronalen Differenzierungsmedium verwendet, | Verwenden neuronaler Differenzierungsmedium | |
| Zentrifugationsschritt war zu hart oder zu mild | Spin 96-Well-Platte 500 × g für 3 min und prüfen, ob Zellen an dem zentral angesammeltBoden jeder Vertiefung | |
| Nein Y-27632 bei Beginn der Differenzierung | Verwenden Y-27632, um das Überleben der Zelle zu verbessern | |
| Die Zellen hafteten und wuchsen an der Unterseite der Platte | Stellen Sie sicher, dass eine nicht-haftende 96-Well-V-Bodenplatte verwendet wird. | |
| Schritt 2 | Kein täglicher Medienwechsel | Ändern halbe Menge des Mediums täglich |
| Neurosphären sind nicht homogen in der Größe | Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung nicht gleich war | Mischen Sie den Schlauch mit Einzelzellsuspension vor jeder Entnahme von 100 ul Zellsuspension |
| Mediumwechsel wurde nicht für jeden gut täglich durchgeführt | Stellen Sie sicher, erhält jeder gut tägliche Medienwechsel | |
| Schritt 2 | hiPSC wurden nicht int distanzierteo einzelne Zellen vor Beginn der Differenzierung | Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, wenn hiPSC auf einzelne Zellen nach Accutase Behandlung dissoziiert sind. Wenn es noch werden aggregiert, Pipettenzellen 10 mal auf und ab mit 100 ul Mikropipette und erneut prüfen oder wiederholen Accutase Behandlung |
| Neurospheres keinen hellen Rand oder runde Oberfläche anzuzeigen; sie bilden große Zysten an der Oberfläche | Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu hoch war | zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung |
| Mediumwechsel wurde für jede Vertiefung nicht täglich gemacht | Ändern Sie die Hälfte Medium täglich | |
| Schritt 2.7 | Schlechte Qualität des hiPSCs | Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) |
| EHS-Matrix eingebettet Neurosphären haften und verklumpen | Nicht genügend Medium (Volumen) | Zur Verfügung stellenMinimum von 10 ml Medium in einem 100 mm Petrischalen |
| Regal des Inkubators nicht einmal | Legen Schüssel auf einer ebenen Fläche | |
| Nachdem in Inkubator platziert, bewegen sich die Schale, so dass Neurosphären gleichmäßig verteilt sind |
Tabelle 1: Fehlerbehebung Tabelle.
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Discussion
MCPH ist eine komplexe menschliche Erkrankung des Nervensystems , die nicht in Tiermodellen in vivo oder in einfachen menschlichen Zellkulturansätze in vitro rekapituliert werden kann. Die klinische Manifestation der MCPH beginnt während des ersten Trimesters zu erscheinen, wenn sie früh beginnt die Neurogenese. Somit stellen die 3D Gehirn Organoide ein zuverlässiges experimentelles System MCPH Entwicklung zu modellieren. Darüber hinaus 3D menschliches Gehirn Organoide ist ein idealer Ansatz, da i) sie ermöglichen die Anpassung eines Spektrum von Patientenproben mit verschiedenen genetischen Hintergründen, ii) sie organisiertes Gewebe zeigen Typen unterschiedliche neuronale Zelle enthält, und, was wichtig ist, iii) verschiedene Differenzierung Stadien der Entwicklung des Nervensystems in diesem in vitro - Ansatz werden auf ihre in vivo Pendants verbunden 25, 26, 27. Zum Beispiel ist die neuronale Rosette eine äquivalente Struktur zu der Entwicklungs neuronalenTube.
Lancaster et al. die doppelte Anzahl von Patienten verwendet iPSCs iPSCs verglichen zu steuern, um bei der Erzeugung von Patienten Organoide erfolgreich zu sein. Bemerkenswert ist , mit dem Protokoll hier beschrieben, durch die bestehenden Methoden zu modifizieren, könnten wir 4 Startsteuerung und Mikrozephalie Gehirn Organoide aus den gleichen Zellzahlen generieren. Dies war möglich durch die definierten Kulturbedingungen iPSCs und aufgrund einer gerichteten Differenzierung. In diesem Protokoll wurde organoiden Generation verbessert, indem den häufigsten durchgeführten EB Bildungsschritt ersetzt durch neuronale Differenzierung direkt von iPSCs einleitet. Zweitens in Schritt 3 Dorsomorphin und SB431542 wurden in das Kulturmedium allein anstelle von Retinsäure ergänzt. Retinsäure isomerisiert wird leicht , wenn das Zellkulturmedium 28 angelegt. Daher ist seine biologische Aktivität weniger definiert als die von stabileren Verbindungen wie Dorsomorphin. Dorsomorphin hemmtder BMP4 Signalweg und SB431542 ist ein Inhibitor des Activin / Knoten Signalweg (TGF-β1 ALK-Inhibitor). Eine Kombination beiden Verbindungen führt zur Hemmung der BMP und das Aktivin / Knoten Signalweg induziert neuronale Differenzierung und reduziert die Differenzierung in andere Linien in verschiedenen Zelllinien aus menschlichem ES oder humanen iPS - Zellen mit einer ähnlichen Effizienz 29. Verbindung Stabilität und universelle Zellantwort auf eine Verbindung , sind wichtige Punkte für ein Protokoll zur Festlegung, die an verschiedene Zelllinien Patienten angewandt werden kann , um eine Krankheit in vitro zu modellieren. So organoiden ein robustes und effiziente Differenzierung Ergebnisse in homogenem Gehirn Kulturen und schließlich in reproduzierbaren Daten.
Mit diesen Modifikationen kritische Schritte in dem Protokoll zur Einleitung der Differenzierung in Schritt 1. An dieser Stelle minimiert werden, ist es wichtig, die iPSCs in eine Einzelzellsuspension eines sanft dissoziierennd zu verteilen, sie genau und gleichmäßig in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Rho-assoziiertes Protein-Kinase-Inhibitor (Y-27632) muss während der ersten 24 h zu Medium B zugegeben werden, da sie die Überlebenszeit von iPSCs bei ihrer Dissoziation einzelner Zellen unterstützt. Es ist wichtig, Zellen in engen Kontakt miteinander zu bringen, indem sie bis auf den Boden der Vertiefungen zu drehen. Sobald Neurosphären am Ende von Schritt 1 gebildet werden, kann der erfolgreiche Abschluss des weiteren experimentellen Verfahrens zu erwarten. Im Fall neurospheres die Pluripotenz der humanen iPS-Zellen nicht bilden, die Nichteinhaltung der Zellen in 96-Well-Platte, und die Schleudert Bedingungen zu prüfen. Das gesamte Verfahren am Tag 0 von Schritt 1 soll nicht länger als 1 h aufgrund der Empfindlichkeit der menschlichen iPS-Zellen. Medium Änderungen in den folgenden Tagen muss sorgfältig durchgeführt werden, Scherkräfte zu vermeiden, um nicht zu zerstören frisch gebildete Zellkontakte zwischen den Zellen.
Es ist bemerkenswert, dass centrosomal-Mutanten haben defekte Zellproliferation und veränderten Zellzyklus-Dynamik. Somit erfordert MCPH Modellierung ein leistungsfähiges Protokoll, das die Zellfunktionen beeinträchtigt standhalten kann. Daher erlaubt das aktuelle Protokoll für die Erzeugung von homogenen Organoide von hohen Qualität und dient als ein einzigartiges Werkzeug Stammzelle Homöostase im VZ zu studieren. Im Gegensatz zu anderen Protokollen ermöglicht dieses Protokoll, um die Erzeugung von Organoiden von Kontroll- und Patienten iPSCs mit gleichen Zellzahlen beginnen. Für Studien , basierend auf in vitro Differenzierung identische Kulturbedingungen für verschiedene iPSCs sind eine Grundvoraussetzung krankheitsbedingten Veränderungen und zu vermeiden Kultur-Zustand Artefakte zu identifizieren. Neben der Modellierung Mikrozephalie genetischen Ursprungs, kann dieses Protokoll auch auf Mikrozephalie von nicht-genetischem Ursprung angewandt werden, einschließlich von neurotrophic viralen Infektionen, Chemikalien oder Strahlung. 30 Darüber hinaus moderne Molekularbiologie - Tools wie CRISPR / Cas9 genom bearbeitening Technologien können auf 3D Organoide angewendet werden , um spezifische Aspekte des menschlichen Gehirns Entwicklungsparadigma in 31 vitro sezieren, 32, 33.
Auf der anderen Seite hat sich die Erzeugung von Gehirn Organoide bisher noch nicht über den ersten und frühen zweiten Trimester der menschlichen Entwicklung 34 gegangen. Überschreiten diese Einschränkung und ermöglicht die Erzeugung von reifen Gehirns Organoiden in vitro würden neue Wege öffnen , um neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren , die in späteren Stadien manifestieren, wie beispielsweise Parkinson oder Alzheimer-Krankheit. Für zukünftige Anwendungen, Protokolle Differenzierung spezifischer Regionen, wie das Vorderhirn oder das Mittelhirn zu leiten, könnte von Interesse sein , komplexe neurologische Störungen zu untersuchen wie Autismus und Schizophrenie 35, 36, 37, 38.
Wichtig ist, dass bestimmte Aspekte berücksichtigt werden, wenn Schlussfolgerungen aus organoiden Studien zeichnen. Die erste Einschränkung besteht darin, dass es keine offensichtliche Vaskularisierung in Organoiden ist. Somit Gasaustausch und Nährstoffversorgung in vitro nur annähernd in vivo Bedingungen. Zweitens, da Gehirn Organoide nicht zu komplexen Organsystemen verbunden ist, mangelt es das organoiden Modell eine vollständige Immun, Stoffwechsel- und Hormonsystem. Dennoch stellt das Fehlen dieser Aspekte manchmal einen Vorteil. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Organoide können immunsupprimierten in - vivo - Modelle ersetzen , wenn die Wirkung des Immunsystems in der Pathogenese von Erkrankungen des Gehirn Adressierung.
Mit dem Einsatz von Spinnerflaschen, kann eine große Anzahl von Organoiden für biochemische Experimente erzeugt wird, ganze Transkriptom-Sequenzierung Analyse und Hochdurchsatz-Drogenscreenings. Zusammengenommen mit usingt dieses aktuelle Protokoll kann ein Gehirn Organoide aus menschlichen iPS-Zellen erzeugen, die dann in einem breiten Spektrum von Anwendungen eingesetzt werden können, von Krankheit Modellierung Drogentestplattformen, um zuverlässig Tierversuche in Zukunft zu ersetzen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Fritz-Thyssen-Stiftung (Az.10.14.2.152) unterstützt. Wir sind dankbar, dass die Gewebeeinbettung Anlage und das Mikroskop Core Facility des ZMMK. Wir sind dankbar für die Diskussionen und technische von den Mitgliedern des Labors für Zentrosom und Zytoskelett Biologie unterstützt. Wir danken Li Ming Gooi das Manuskript für das Korrekturlesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
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