Introduction
פרעות התפתחותיות אדם, כגון ממיקרוצפלוס-, ניתן ללמוד בצורה גרועה רק במודלים של בעלי חיים בשל העובדה כי מוח האנושי יש משטח קליפת מוח מורחב, תכונה ייחודית ושונת חיות לא אנושיות.
היבט זה עושה התפתחות המוח האנושי תהליך מורכב כי לא ניתן ללמוד מספיק בתוך 2D, במערכת תרבית תאים במבחנה. מתעוררים טכניקות התרבות 3D לאפשר לדור של organoids דמויי רקמה מתאי גזע מושרים (iPSCs). במבחנת הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבות השעית 3D מאפשר ההיווצרות של סוגי תאים שונים במועד ובאזור ספציפי, והוליד רקמות מאורגנות, מרובדת 1, 2, 3. הודות מעבד כי חלוץ בטכנולוגיות תרבות 3D ו demystified המורכבת של היווצרות איברים, החלה מתאי גזע,פתחנו שיטה חזקה של יצירת organoids המוח להתוות אירועים מוקדמים של התפתחות מוח אנושית מודל ממיקרוצפלוס- במבחנה 1, 2, 3. ראוי לציין כי התאמנו בשיטה המקורית שפיתח לנקסטר ואח. 1 כדי ליצור organoids מוחין. שיטה זו שונתה על פי דרישות הניסוי שלנו.
מטרת מחקר מ ואח 'גבריאל. היה לנתח את המנגנונים התאיים ומולקולריים של תחזוקת תאי גזע עצבית במהלך התפתחות המוח. על מנת לעשות זאת, מחקר המכניסטי בוצע באמצעות ניתוח ובתאים עצביים (NPCs) ב organoids מוח 3D נגזר חולה ממיקרוצפלוס- 4. החולה הזה נשא מוטציה CPAP, חלבון centrosomal נשמר הנדרשים biogenesis centrosome 5. היפו מקובלהתזה היא כי ממיקרוצפלוס- הוא התוצאה של דלדול של ברכת NPC, זה עלול לנבוע גם למוות של תאים או בידול מוקדם 1, 6, 7, 8, 9.
על ידי ניתוח אזורי חדרית (VZs) של organoids המוח ממיקרוצפלוס-, הודגם כי מספר משמעותי של NPCs לעבור חלוקת התא סימטרית, בניגוד organoids המוח נגזר מתורם בריא 4. ניתוחים מיקרוסקופים וביוכימיים נרחבים של organoids מוח microcephalic חשפו תפקיד לא צפוי עבור CPAP מבולגן ריסים בזמן 4. באופן ספציפי, CPAP מוטציה מזוהה עם פירוק cilium מפגר מחדש כניסת מחזור התא מתעכבת, מה שמוביל את הבידול המוקדם של NPCs 4. תוצאות אלו מצביעות על תפקיד עבור ריסים ב ממיקרוצפלוס- ו המעורבות EIR במהלך מלא הנוירוגנזה גודל המוח 10.
חלקו הראשון של פרוטוקול זה הוא תיאור של שיטת שלושת השלבים ליצירת organoids המוח הומוגנית. כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול לנקסטר המקורי הותאם ו שונה שמתאים למטרות שלנו 1. ראשית, iPSCs אדם מתורבת מצב מזין ללא מוגדר על Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) מטריקס. צעד זה ימנע את הווריאציות של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מזין תלוי. בפרוטוקול זה, בדומה להשפעת בידול העצבי להקים אפיתל עצבית מתחילה ישירות iPSCs. אם תדלג גוף embryoid (EB) צעד ההיווצרות, את ההתמיינות העצבית בצורה מבוקרת יותר וביים. גישה זו מגבילה את ההיווצרות הספונטנית undirected של שכבות תאי ניבט אחרות, כגון המזודרם ו endoderm. על ידי יישום פרוטוקול זה, neurospheres המכיל רוזטות עצבית ניתן לקצור ביום 5 עבור EHS הטבעת מטריקס ותרבות השעיה נייחת. מדיום organoid המשמש את הצעד השלישי של הפרוטוקול שלנו הוא השלים עם dorsomorphin ו SB431542. Dorsomorphin הוא מעכב מולקולות קטנות של חלבון העצם morphogenic (BMP), וכן SB431542 מעכב את TGFβ / Activin / מסלול איתות קטרים. השילוב של גורמים אלה יכול לקדם בידול עצבי בצורה יעילה יותר מאשר חומצה רטינואית לבד 11, 12, 13, 14.
בסך הכל, שינויים אלה מאפשרים לדור לשחזור של organoids המוח, עם וריאציות מינימאליות ברחבי organoids. חשוב לציין, שיטה זו יושמה כדי ליצור organoids המוח microcephalic וחסונה מן iPSCs החולה, הנושאות מוטציות בגנים המשפיעים centrosomes והדינמיקה מחזור התא.
החלק השני של פרוטוקול זה נותן הוראות להכנת brAin organoids לניתוח ופרשנות של ליקויים הסלולר ממיקרוצפלוס-. זה כולל קיבוע, cryosectioning, מכתים immunofluorescent, ואת ניתוח מיקרוסקופי confocal. פרוטוקול זה יספק את הקורא עם תיאור מפורט של תוצאות צפויות ובליווי לפרשנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דור 1. של המוח Organoids (23 ימים)
- ייזום של neuroectoderm (5 ימים)
הערה: לשים לב לנקודות הבאות יש לשקול לפני תחילת הבידול. שיטת תכנות מחדש (lentiviral-, Sendai-virus-, episomal-, או microRNA מבוסס וכו ') כדי להשיג iPSCs האנושי באופן אידיאלי צריכה להיות זהה עבור כל המטופל ולשלוט קווי iPSC. ערכות והוראות התכנות מחדש שונים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו זמינים 15, 16, 17, 18. איכות קווי iPSC האנושי הוא המפתח להגשמת בידול אופטימלי. נטר מורפולוגיה המושבה ואת התא עם מיקרוסקופ ולאמת מגוונת" ידי בדיקת הביטוי של סמנים כגון Oct3 / 4, Nanog, או TRA-1-60.- האדם תרבות iPSCs בתנאים מזין ללא במדיום על צלחת מצופה Engelbreth-הולם-נחילמטריקס (EHS).
הערה: Grow iPSCs אדם מזין חופשי סרום ללא לשמור על מצב התרבות מוגדר להימנע צעד נוסף להסרת תאי מזין עכבר עוברי (MEFs) לפני תחילת הבידול. מספר המעבר האופטימלי עבור iPSCs האדם להתחיל טווחי בידול מפסוק 15 על תכנות מחדש למעבר 70 בסך הכל. כאשר passaging, לנתק מושבות hiPSC כתאי המצרפי באמצעות פתרון ניתוק התא מתאים עם לחץ מכאני נמוך טפטף סרולוגיות 2-מיליליטר להעביר אגרגטים תבשיל חדש. הימנע ניתוק תאים בודדים, כמו זה עלול להשרות התמיינות אפופטוזיס ברוב קווי iPSC. עוד נמסר כי לטווח ארוך, passaging מתא בודד יכול להגדיל שינויים הגנומי האנושי iPSCs 19, 20. הימנע נהלי תא ריחוק, אשר דורשים צעד צנטריפוגה להסיר פתרון ריחוק, כמו זה מקטין את הכדאיות הכללית של iPSCs. מִבְחָןכל התרבויות עבור זיהומים מיקרוביאליים, במיוחד mycoplasma, על בסיס קבוע, כי זה עלולה לשנות את איכות iPSCs ויכולת הבידול שלהם.- מעיל צלחת תרבות 60 מ"מ רקמת עם מטריקס EHS לפי הוראות היצרן.
- להפשיר aliquot של 1 x 10 6 iPSCs האנושי. זרעים iPSCs בצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ מצופה מטריצה EHS ו המכיל 5 מ"ל של מדיום (ראה טבלה חומרים). שינוי המדיום יומי המעבר לאחר 5 עד 7 ימים כאשר מגיעים תאים ~ 80% confluency.
הערה: פרוזדור, iPSCs מופשר ב 80% confluency באמצעות שיטות סטנדרטיות, כגון ניתוק האנזים ללא מושבות 21, לפחות פעם אחת לפני תחילת הבידול. בקיצור, להסיר את מדיום iPSC, לשטוף את התאים פעם עם 37 מחומם מראש ° של בינוני נשר Modified של C Dulbecco: F12 מזין תערובת (DMEM / F12), דגירת iPSCs הבאה היצרןהוראות שימוש ריאגנט (ראו טבלת חומרים). אין לעבור את זמן דגירה המומלצת כדי למנוע ניתוק תאים בודדים. iPSCs אדם צריך להיות מנותק צף כמו אגרגטים, לא תאים בודדים כמו. הם יכולים להיות מועברים לאחר מכן מנות מצופות מטריקס חדשים EHS; למשל, iPSC אגרגטים מן המנה 60 מ"מ אחד יכולה להיות מופצת 4 מנות 60 מ"מ חדשים. - בדוק mycoplasma עם ערכת גילוי mycoplasma על פי הוראות היצרן. השתמש רק iPSCs mycoplasma-חופשי, כמו mycoplasma יכול לשנות את יכולת הבידול של iPSCs.
- לנתק iPSCs (80% ומחוברות) ולהכין השעית תא בודד באמצעות B. ריאגנט
- שטפו את iPSCs פעם עם מחומם מראש (37 ° C) DMEM / F12.
- להוסיף B מגיב מחומם מראש (למשל, 1 מ"ל בצלחת 60 מ"מ) דגירה iPSCs עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
- פליק 20 פעמים עם אצבע על הצד התחתון שלהמנה לנתק את iPSCs. בדקו את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ.
- פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה בצלחת 5 פעמים עם micropipette 1 מ"ל.
- להוסיף 3 מ"ל של מדיום לדלל 1 מ"ל של B מגיב ולאסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- בעדינות לסובב את iPSCs (500 XG) במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
- Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של B בינוני לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
הערה: שימו לב באמצעות B בינוני בלבד עבור resuspension. המנעו משימוש בינוני, מכיוון שהיא מכילה ריכוז גבוה מדי של bFGF, אשר עלול לעכב את הבידול.
- לדלל את ההשעיה התא 4.5 x 10 5 תאים לכל מ"ל ב B בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Rho-מזוהה מעכב חלבון קינאז (Y-27,632).
- הוספת 100 μL לכל היטב צלחת לא חסיד, נ-תחתונה, 96-היטב.
הערה: ודא התאים מופצים באופן שווה susפנסיה ידי ניעור הצינור בכל פעם לפני להוציא 100 חלקים μL. חשוב שכל היטב צריך להכיל מספר תאים שווה ערך על מנת לקבל neurospheres הומוגנית בגודל ובצורה (עגול, משטחים מוגדרים). - בעדינות לסובב את הצלחת עם התאים ב 500 טמפרטורת XG ואת מקום 3 דקות לדגור 37 ° C ו 5% CO 2.
- שינוי המדיום יומי על ידי הסרת 50 μL והוסיף 50 μL של B הבינוני הטרי לתוך זה גם עבור 5 ימים הקרובים.
- האדם תרבות iPSCs בתנאים מזין ללא במדיום על צלחת מצופה Engelbreth-הולם-נחילמטריקס (EHS).
2. והטבעה Neurospheres במטריקס EHS (4 ימים)
- הכן בינוני neurosphere ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C בינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 ללא (w / o) ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו (MEM), 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ ל אינסולין, ו 0.05 מ"מ β-mercaptoethanol.
- אסוף את השנינות neurospheresחה 200 micropipette μL באמצעות קצה ~ 2 מ"מ לחתוך בעבר עם מספריים סטרילי.
- מניחים את neurospheres כ 5 מ"מ אחד מהשני על הסרט פרפין (3 x 3 ס"מ 2) בצלחת 100 מ"מ ריק ולהסיר בזהירות כמה שיותר המדיום הנותרים ככל האפשר.
- להוסיף טיפה (7 μL) של מטריקס EHS על כל neurosphere יחיד.
- דגירת מטריקס EHS יורד עם neurospheres עבור 15 דקות באינקובטור.
- שטפו את neurospheres בקפידה מתוך הסרט פרפין ידי שטיפה אותם עם המדיום neurosphere. כדי לשטוף, להשתמש micropipette 1 מ"ל ו צלחת פטרי חדש 100 מ"מ המכיל 10 מ"ל של מדיום neurosphere.
- דגירה neurospheres עבור 4 הימים הבאים ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום neurosphere טריים ביום 2.
הערה: ודא כי המדפים בחממה הם שטוחים כך neurospheres מטריקס-מוטבע EHS לא יהיה גוש יחד בצד אחד של הצלחת.
3. Organoids ב השעיה רוטריתרבות (14 ימים)
- כן בינוני מוח organoid ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C הבינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 w / o ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ MEM, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ אינסולין L, 0.5 מיקרומטר dorsomorphin, 5 מיקרומטר SB431542, ו 0.05 β-mercaptoethanol מ"מ.
- מוסיפים 100 מ"ל של המוח organoid בינוני בקבוק אחד טווה באמצעות זרועות הצד שלה ולמקם אותם באינקובטור במשך מחמם מראש עבור דקות 20 לפחות.
- הגדרת תוכנית ערבוב ב 25 סל"ד, בהתאם להוראות היצרן.
הערה: לפני העברת neurospheres EHS-מוטבע מטריצה לתוך צלוחיות טווה, לוודא כי הם כל מופרדים. אם שניים או יותר מחוברים באמצעות מטריצת EHS, להפריד אותם על ידי חיתוך המטריצה חיבור עם אזמל. - להעביר בזהירות את neurospheres EHS-מוטבע מטריצה לתוך צלוחיות טווה המכיל 100 מ"ל של מדיום organoid לנוing פיפטה סרולוגיות 2 מ"ל. השתמש בנשק הצד של הבקבוק הטווה להעביר את neurospheres לתוך הבקבוק.
- מניח את הצלוחיות טווים על פלטפורמת בחישה מגנטית באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2; זהו יום 0 של תרבות organoid.
- שינוי המדיום פעם בשבוע (או בתדירות גבוהה יותר כאשר יש שינוי צבע) על ידי הסרת המחצית הבינונית ומוסיף אותה הכמות של מדיום חדש.
הערה: כאשר לוקחים את צלוחיות טווה מתוך האינקובטור, להמתין 3-5 דקות כדי לתת organoids לשקוע לתחתית של הבקבוק. הסר את המדיום ידי הצבת קצה פיפטה זכוכית (מחוברת משאבה) על פני השטח של הנוזל; לשאוב את המדיום בזהירות באמצעות פתיחת צד אחד / זרוע של הבקבוק. מניפולציות אלה חייבים להיעשות מתחת למכסת המנוע למינרית.
ניתוח 4. של המוח Organoids
- קיבוע של organoids
- אסוף את organoids ביום 14 של Wi תרבות הבקבוק טווהth micropipette מ"ל קיצוץ 1 (חתך ~ 5 מ"מ). שים את כל אותם בצלחת 60 מ"מ ו לשטוף אותם פעם אחת עם 5 מ"ל של DMEM / F12 חם עבור 3 דקות.
- הכן צינור 1.5 מ"ל עם 500 μL של paraformaldehyde 4% חם (PFA).
זהירות: ילבש עור ומשקפי מגן ולעבוד מתחת למכסת מנוע בטיחות בעת הטיפול מקבע PFA. - מניחים כל organoid בנפרד בכל צינור ולתקן אותם למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. אין לתקן את organoids יותר מ 60 דקות. כדי להזיז את organoids, להשתמש בלולאת חיסון או כל לתכנן אחרים כי הוא נוח.
- הסר את PFA לשטוף את organoids קבוע פעמיים עבור 10 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS.
- אחסן את organoids ב 1 מ"ל של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים, עד לשימוש נוסף.
- המטעת organoids עבור Cryosectioning
- הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של סוכרוז 30% בפתרון מים מזוקקים לכל צינור כדי ליבש את organoids לפני cryofreezing אותם; לאחר הוספת sucrose פתרון, organoids יש צף על פני השטח. אחסן את organoids לילה פתרון סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס; על ידי למחרת organoids צריך שקע לתחתית של התחתית.
הערה: ניתן לאחסן Organoids עד 3-5 ימים בבית 4 ° C בתמיסה סוכרוז, במידת הצורך. - ממלאי תבנית ויניל דגימה עם 400 μL של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) ולהשתמש לולאת חיסון למקם organoid במרכז התבנית. סמן שפת התבנית עם שם המדגם.
- להקפיא את התבנית organoid המכילים בבית -80 ° C עד Cryosectioning.
- cryoslides זכוכית מעיל עם 0.1% פתרון פולי- L- ליזין (PLL) ב PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולתת את השקופיות להתייבש במשך 3 h. אחסן את השקופיות ב 4 ° C ו לחמם אותם לחדר ממוזג לפני השימוש.
הערה: PLL ציפוי הוא צעד חשוב, כפי שהוא ימנע את פרוסות organoid מן צפתי משם. אוספים ושומרים פתרון PLL ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3חודשים. לפני שימוש חוזר, לסנן אותו עם מזרק 0.22 מיקרומטר ולתת לו חם לטמפרטורת החדר. - סעיף cryofrozen organoids לתוך 20-50 פרוסות מיקרומטר בעובי על זכוכית מצופה PLL cryoslides 22. תנו שקופיות עם חלקים להתייבש במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר. אחסן את הסעיפים ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.
- הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של סוכרוז 30% בפתרון מים מזוקקים לכל צינור כדי ליבש את organoids לפני cryofreezing אותם; לאחר הוספת sucrose פתרון, organoids יש צף על פני השטח. אחסן את organoids לילה פתרון סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס; על ידי למחרת organoids צריך שקע לתחתית של התחתית.
5. Immunofluorescent מכתים סעיפים Organoid
הערה: האפיון הכללי של organoids, צביעה עם nestin, סמן ובתאים עצבי, ו Tuj1, סמן הפאן עצבי, מומלץ. כדוגמאות נוספות, מכתים immunofluorescent עם phospho-vimentin (p-Vim), אשר תוויות בתאי גליה רדיאלי המיטוטי הפסגה, ואת Arl13b, עבור cilium, מתוארים. כדי לבדוק אפופטוזיס, להשתמש במסוף deoxynucleotidyl transferase (TDT) dUTP ניק-End תיוג (TUNEL) assay. מניחים את השקופיות קופסת פלסטיק במהלך incubations כדי להגן עליהם מפני אבק, אור,וייבוש.
- להפשיר את השקופיות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את השקופיות פעמיים עם 200 μL של גליצין PBS (0.225 גרם של גליצין ב PBS) עבור 3 דקות כדי להרוות את autofluorescence המושרה PFA.
- Permeabilize הסעיפים עם 200 μL של 0.5% טריטון X100 / 0.1 Tween% בתמיסה PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף אותם פעמיים עם 200 μL של פתרון PBS-גליצין עבור 3 דקות.
- דגירה אותם עם 200 μL של ג'לטין דגים 0.5% / 0.1% טריטון X100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C לחסום מחייב אנטיגן ספציפי.
הערה: אם assay TUNEL נדרש, לבצע את assay לפי הפרוטוקול של היצרן. התחל עם assay TUNEL לפני ביצוע immunostaining, כיוון שהוא עלול להפריע נוגדנים משני להרוות fluorophores כאשר נעשה שימוש לאחר מכן. - לדלל את הנוגדנים בחסימת פתרון בריכוזים הבאים: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; ונוגדנים משניים, 1: 1000.
- דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הראשון (למשל, nestin) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C..
- לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
- לדלל את נוגדן 1 משני הראשון (אנטי העכבר 488): 1000 בחסימת פתרון דגירה השקופית 200 μL במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר. מעכשיו, תמיד להגן על שקופיות אור.
- לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
- דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הבא (למשל, Tuj1) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
- הוספת 200 μL של נוגדנים משני הבא (נגד ארנב 647) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 x 3 דקות. עם 200 μL של פתרון לחסימה.
- הוספת 200 μL של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בכל קונצרט כלשהו 30 ננומטרentration ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר מכתים גרעיני.
- לשטוף דק 2 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
- לשטוף דק 1 x 1 עם 200 μL של מים מזוקקים ולתת החלקים להתייבש במשך 10-20 דקות, עד שאין טיפת מים ברורה גלויה יותר.
- הר קטעים עם הטבעה בינוני. לאחסן אותם מפני אור ב 4 ° C עד מספר שבועות.
- המשך עם ניתוח מיקרוסקופי לתמונה סקירה של אזור organoid, חדרית, צלחת קליפת המוח הפרימיטיבי, ותחומי עניין אחרים.
- שימוש במיקרוסקופ confocal עם שמן 63X מסננים אובייקטיביים פלורסנט, נבחר על פי הנוגדנים משני הניאון מתויג צבע השמש 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדור של organoids המוח דורש לפחות שלושה שבועות של culturing רציפה (איור 1A). כדי להשיג תוצאות לשחזור, אנו ממליצים כי החוקר מתעד כל צעד, חשוב, ימנע שינויים כלשהם לגבי רכיבים בינוניים, בנקודות זמן, וטיפול תא. הנה, אנחנו נותנים תמצית כיצד להעריך אם אבני דרך קריטיות מתקבלות על מנת לקבל organoids באיכות מספקת בסוף הניסוי. היווצרות neurospheres בתוך צלחת 96-היטב צריכה להיות בבירור מיום 4. Neurospheres יכול להיות מוכר מוגדרים היטב בתחומים בתחתית כל טוב (האיור 1B, צעד 1).
ביום 5, neurospheres צריך להיות ~ 500 מיקרומטר בקוטר מפגינים משטח חלק, עם שפה בהירה סביב מרכז כהה. ייתכן ואפשר יהיה כבר להתבונן stru הוארך שושנה דמוית עצבי ctures בתוך החישוק בהיר זו (איור 1C, להתחיל של צעד 2). אם neurospheres להתפרק או להיראות יותר כמו אגרגטים התא, בידול אסור המשיך הלאה. לבסוף, organoids צריך להגדיל ולהציג גודל דומה במהלך תהליך הבידול צלוחיות טווה (1D איור, צעד 3). עיין בטבלת פתרון הבעיות (לוח 1) לקבלת מידע נוסף.
איכות organoids יום-14 צריכה להיות מאומתת על ידי מיקרוסקופ אור. VZs מורכבים שכבות עבות של NPCs חיובית-nestin / תאי גליה רדיאלי עם צורה גרעינית מְשׂוֹכָה בצד הפסגה. מצד השני, הצליח קליפת המוח הפרימיטיבי יכיל נוירונים Tuj1 חיובי בשפע בצד הבסיסי, מובחנים במרחב מצד הפסגה (האיור 1E). חשוב לציין, הנוירונים Tuj1 חיובי אין לראות בצד הפסגה של VZ.
הדק-page = "1"> כדי לנתח את מטוס חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגה (ARGS), אנחנו ממליצים להשתמש vimentin phospho (p-Vim) מכתים Arl13b. Arl13b תוויות הריסים העיקריים של ARGS הכמוס רירי לומן של VZ. לפיכך, באזור הריסים Arl13b החיובי משמש מדריך התמצאות לאתר ולנתח את מטוס חלוקת p-Vim חיובי ARGS ב anaphase. בדרך כלל, VZ של organoid מלא 14 ימים בת מציג מספר משמעותי של ARGS, אשר מטוסי חטיבה הם אופקי אורינטציה. מטוס חלוקה אופקי אורינטציה הוא חיוני להרחבה הסימטרית מוקדם של ARGS (איור 1F ו- G) 23,24. כאשר התרחבות ARG מספיק הוא הגיע, נוירוגנסיס מתחיל, התאים המתחלקים לשנות את הנטייה שלהם כלפי לומן, ומטוס חטיבת מתגים מ אופקי (סימטרי) אנכיים (אסימטרי) 4, 12, 24.
איור 1: הדור של Organoids המוח מתאי שב"ס האדם. (א) Workflow של פרוטוקול הבידול. שלב 1: התחל של בידול. בשלב זה, ההיווצרות של neurospheres מן iPSCs אדם צלחת 96-היטב מתרחשת. משך הזמן הוא 5 ימים. שלב 2: המטעת neurospheres בטיפות מטריקס EHS. תרבות השעיה נייחת של neurospheres-מוטבע מטריצת EHS יש משך זמן של 4 ימים. שלב 3: Organoids צלוחיות טווה. העברת neurospheres-מוטבע מטריצת EHS כדי Spinner צלוחיות מתרחשת. משך הזמן הוא 14 יום. (ב) neurosphere בתוך צלחת רבה היטב. תמונה מייצגת של neurosphere ביום 4 ב צלחת 96-היטב במהלך שלב 1 מוצג. התחום צריך להיות לעין בתחתית הבאר, עם משטח חלק, עגול (arro אדוםw). (ג) מורפולוגיה של neurospheres לפני EHS הטבעת מטריקס. Neurospheres שנאסף ביום 5 של שלב 1 צריך להיות אחיד בגודל ולהציג משטח חלק עם שפה בהירה (סוגר חץ). (ד) Organoids צלוחיות טווה. כד טווה עם organoids המוח במהלך שלב 3 (חצים אדומים) מוצג כאן. (E) הדמיה Immunofluorescent של organoids cryosectioned הצגת VZ טיפוסי הצלחת קליפת המוח הפרימיטיבי. הלוח השמאלי מציג את מכתים הגרעין של תאים על VZ. VZ משתרע מצד הפסגה (L לומן) לצד הבסיס (קו צהוב). שים לב תאים בתוך גרעיני מְשׂוֹכָה דמוי תצוגת VZ, מה שמראים כי הם תאי גליה רדיאלי. הפאנל הימני מראה את מכתים immunofluorescent של NPCs nestin חיובי (ירוק) בתוך VZ ונוירונים Tuj1 חיובי (מגנטה) ב הצלחת קליפת המוח הפרימיטיבי. בר סולם = 50 מיקרומטר. (F) הדמיה Immunofluorescent של organoids cryosectioned. שתי דוגמאותשל VZs מוכתם p-Vim ו Arl13b (I ו- III). האזורים המסומנים על ידי ריבועים לבנים מוגדלים בפינה הימנית עבור כל שיבוץ תמונה (ii ו- IV). מטוס חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגת anaphase (ARGS). חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגה בצד הפסגה של VZ היא p-Vim חיובי (מגנט). דוגמאות ARGS חלוקה סימטרית מוצגות (ריבועים לבנים ריבועים). מטוס החלוקה ניתן כקו לבן. מטוס חלוקת תא anaphase הוא אופקי לקו משטח לומן (קו מקווקו צהוב) והוא מסומן על ידי מכתים Arl13b (ירוק). בר סולם = 50 מיקרומטר. (G) סכמטי זה מספק הכיוון האנכי או האופקי של ARGS יחסית anaphase לומן. התאים המתחלקים של organoids המלא ביום 14 בעיקר מכוון אופקי (0-30 מעלות) ביחס לפני שטח לומן של VZ. צד הפסגה של לומן הוא בשורה של הריסים העיקריים של ARGS, אשר ציינו את שטח לומן של VZ (הקו ירוק). לעומת זאת, mosT של תאי גליה רדיאלי של organoids ממיקרוצפלוס- להציג בכיוון אנכי (60-90 מעלות) מטוס חלוק. הקו הלבן מציג את הציר של המטוס החלוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| בְּעָיָה: | סיבות אפשריות: | הצעות: |
| שלב 1.1.1.2 | יעילות ירודה של תכנות מחדש | בדוק hiPSCs עבור סמני pluripotency: אם האיכות נמוכה, ידני לאסוף מושבות מובחנות עבור כמה קטעים להעשיר מושבות פלוריפוטנטיים |
| iPSCs האדם להבדיל לפני תחילת בידול | ||
| מתח בשל passaging או passagi מוקדםng כמו תאים בודדים | האם לא מעבר לפני 80% confluency מושגת. מעבר כמו אגרגטים, לא תאים בודדים | |
| זיהום עם mycoplasma | מבחן עבור זיהום mycoplasma | |
| שלב 2 | איכות ירודה של hiPSCs | שיפור איכות של hiPSCs (ראה לעיל) |
| Neurospheres אינו יוצר בכלל או להתפרק בכל יום 5 לאחר תחילת הבידול | המספר הראשון של תאים לכל גם הוא נמוך מדי או גבוה מדי | לחשב במדויק את מספר התאים ולהפיץ אותם באופן שווה בכל טוב |
| מדיום hiPSC שמש במקום מדיום בידול עצבי | השתמש בינוני בידול עצבי | |
| צעד צנטריפוגה היה קשה מדי או קל | ספין הצלחת 96-היטב 500 XG במשך 3 דקות ולבדוק אם תאים שנצברו מרכזיים בביתבתחתית כל טוב | |
| אין Y-27,632 לתחילת בידול | השתמשו Y-27,632 כדי לשפר את הישרדות התא | |
| תאים מחוברים וגדלו בתחתית הצלחת | ודא כי צלחת V-bottom 96-היטב שאינו חסיד משמשת. | |
| שלב 2 | אין שינוי מדיום יומי | שנה וחצי כמות יומית בינוני |
| Neurospheres אינו עשוי מקשה אחת בגודל | החל מספר התאים בכל טוב היה לא שווה | מערבבים את הצינור עם ההשעיה תא בודד בכל פעם לפני להוציא 100 ההשעיה תא μL |
| שינוי בינוני לא נעשה עבור כל טוב יומי | ודא שכל היטב מקבל שינוי המדיום יומי | |
| שלב 2 | hiPSC לא היה מנותק into תאים בודדים לפני תחילת הבידול | בדוק תחת מיקרוסקופ אם hiPSC הם ניתקים תאים בודדים לאחר טיפול Accutase. אם יש עדיין אגרגטים, תאים פיפטה 10 פעמים למעלה ולמטה עם 100 micropipette μL ולבדוק שוב או לחזור Accutase טיפול |
| Neurospheres שאינו מציג שפה בהירה או משטח עגול; הם יוצרים ציסטות גדולות על פני השטח | החל מספר התאים בכל טוב היה גבוה מדי | לחשב במדויק את מספר התאים ולהפיץ אותם באופן שווה בכל טוב |
| שינוי בינוני לא נעשה יומי עבור כל טוב | שנה וחצי יומי בינוני | |
| שלב 2.7 | איכות ירודה של hiPSCs | שיפור איכות של hiPSCs (ראה לעיל) |
| neurospheres EHS מוטבע מטריצה מקל גוש ביחד | לא מספיק בינוני (נפח) | לספקמינימום של המדיום 10 מ"ל ב petridish 100 מ"מ |
| המדף של חממה אפילו לא | מניחים צלחת על משטח ישר | |
| לאחר הצבת לתוך אינקובטור, להזיז את המנה כך neurospheres מופץ באופן שווה |
טבלה 1: שולחן פתרון בעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH היא הפרעה נוירו-התפתחותיות מורכבות אנושית שלא ניתן לסכם במודלים של בעלי חיים in vivo או תרבית תאים אנושיים פשוטים גישות במבחנה. הביטוי הקליני של MCPH מתחיל להופיע במהלך הטרימסטר הראשון, כאשר בתחילת נוירוגנסיס מתחיל. לפיכך, organoids מוח 3D מייצג מערכת ניסיונית אמינה מודל פיתוח MCPH. בנוסף, organoids המוח האנושי 3D הוא גישה אידיאלית מאז i) הם מאפשרים ההתאמה של ספקטרום של דגימות חולות עם רקע גנטי שונה, ii) הם מציגים רקמות מאורגנות המכילות סוגי תאים עצביים שונים, וכן, חשוב, iii) בידול שונה שלבי התפתחות המוח בגישה במבחנה זו מקושרים עמיתיהם in vivo שלהם 25, 26, 27. לדוגמא, השושנה העצבית הוא מבנה שווה עצבי הפיתוחצינור.
לנקסטר ואח. בשימוש מספר כפול של iPSCs החולה לעומת שליטה iPSCs כדי להצליח ביצירת organoids החולה. ראוי לציין, עם הפרוטוקול המתואר כאן, על ידי שינוי השיטות הקיימות, נוכל ליצור מלא organoids מוח ממיקרוצפלוס- החל מאותו המספרים הסלולריים 4. זה היה אפשרי בשל תנאי התרבות המוגדרים של iPSCs ובשל בידול מכוון יותר. בפרוטוקול זה, דור organoid השתפר ידי החלפת צעד היווצרות EB בצע פקודות באמצעות ייזום בידול עצבי ישירות iPSCs. שנית, בשלב 3, dorsomorphin ו SB431542 נוספו לתוך המדיום התרבות במקום החומצה הרטינואית לבד. חומצה רטינואית היא isomerized בקלות כאשר מוחלים על תרבית תאים בינוני 28. לכן, הפעילות הביולוגית שלה היא פחות מוגדרת מזו של תרכובות יציבות יותר כגון dorsomorphin. מעכב Dorsomorphinמסלול איתות BMP4, ו SB431542 הוא מעכב של מסלול Activin / איתות קטרי (TGF-β1 ALK מעכב). שילוב של שניהם התרכובות מוביל העיכוב של BMP ואת Activin / מסלול איתות קטרים, גורם בידול עצבי, ומקטין את הבידול לתוך שושלות אחרות שורות תאים שונות עובריים אנושי או תאי שב"ס אדם עם יעילות דומה 29. יציבות מתחמת ותגובת תא אוניברסלית תרכובת הן נקודות חשובות לקביעת פרוטוקול שניתן להחיל שורות תאי חולים שונות למדל מחלה במבחנה. לפיכך, תוצאות בידול חזקות ויעילות מוח הומוגנית organoid תרבויות, בסופו של דבר, ב נתונים לשחזור יותר.
עם שינויים אלה, שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם מזעריים להתחלת הבידול בשלב 1. בשלב זה, חשוב לנתק את iPSCs בעדינות לתוך השעית תא בודדnd להפיץ אותם במדויק ובאופן שווה היטב בכל צלחת 96-היטב. Rho-מזוהה מעכב חלבון קינאז (Y-27,632) יש להוסיף B בינוני במהלך 24 h הראשון, כפי שהוא תומך הישרדות של iPSCs על ניתוק שלהם תאים בודדים. חשוב להביא תאים במגע קרוב עם השני על ידי ספינינג אותם לתחתית של בארות. לאחר neurospheres נוצרות בסוף השלב 1, ההשלמה המוצלחת של פרוצדורות נוספות ניתן לצפות. במקרה neurospheres לא יוצר את מגוונת" של iPSCs האדם, אי-ההתמדה של התאים בצלחת 96-היטב, ואת התנאים צנטריפוגה חייבת להיבדק. ההליך כולו ביום 0 של צעד 1 צריך לקחת יותר 1 h בשל הרגישות של iPSCs האנושי. שינויים בינוניים במהלך הימים הבאים חייבים להיעשות בזהירות, הימנעות כוחות מוחלטים, כדי לא להרוס קשרי תא נוצרו טרי בין התאים.
ראוי לציין כי centrosomיש מוטציות אל התפשטות תאים פגומים והדינמיקה מחזור התא משתנה. לפיכך, דוגמנות MCPH דורשת פרוטוקול חזק שיכול לעמוד פונקציות הסלולר נפגעות. לפיכך, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לדור של organoids הומוגנית של איכות גבוהה ומשמש ככלי ייחודי ללמוד הומאוסטזיס תא גזע בבית VZ. בניגוד פרוטוקולים אחרים, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של organoids מן iPSCs המלא החולה, החל מספרים סלולריים שווים. עבור מחקרים המבוססים על בידול במבחנה, תנאי תרבות זהים עבור iPSCs השונה הם דרישה בסיסית לזהות שינויים הקשורים למחלות ולהימנע חפצי תרבות-תנאים. מלבד דוגמנות ממיקרוצפלוס- ממוצא גנטי, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם ממיקרוצפלוס- ממוצא לא-גנטי, לרבות זיהומים ויראליים נוירוטרופית, כימיקלים, או קרינה. 30 בנוסף, כלי ביולוגיה מולקולריים מודרניים, כגון קריספר / Cas9 הגנום עריכהing טכנולוגיות, ניתן ליישם organoids 3D לנתח היבטים ספציפיים של הפרדיגמה התפתחות המוח האנושי במבחנה 31, 32, 33.
מצד השני, הדור של organoids המוח עד כה עדיין לא עבר את השליש השני הראשון ותחילת התפתחות אנושית 34. מצוין מגבלה זו ולאפשר לדור של organoids המוח הבוגר במבחנה היה לפתוח אפיקים חדשים למדל הפרעות ניווניות המתבטאים בשלבים מאוחרים יותר, כגון פרקינסון או אלצהיימר. ביישומים עתידיים, פרוטוקולי הכוונת בידול לאזורים ספציפיים יותר, כמו המוח הקדמי או המוח התיכון, עשוי להיות עניין ללמוד הפרעות נוירולוגיות מורכבות כמו אוטיזם וסכיזופרניה 35, 36, 37, 38.
חשוב לציין, היבטים מסוימים צריכים להילקח בחשבון כאשר הסקת מסקנות ממחקרים organoid. המגבלה הראשונה היא כי אין כלי דם ברורים organoids. לפיכך, תחלופת גזים ואספקה מזינה במבחנה רק בקירוב תנאי vivo ב. שנית, מאז organoids המוח אינם מחוברים למערכות איבר מורכבות, מודל organoid חסר החיסונית שלמה, מטבוליות, ואת מערכת ההורמונלית. אף על פי כן, בהעדר ההיבטים הללו לפעמים מספק יתרון. לדוגמה, organoids המתואר כאן יכול להחליף immunosuppressed במודלים vivo כאשר פונה ההשפעה של המערכת החיסונית בפתוגנזה של הפרעות במוח.
עם שימוש צלוחיות טווות, מספר רב של organoids יכול להיות שנוצר עבור ניסויים ביוכימיים, לניתוח רצפי transcriptome שלם, והקרנות תרופת תפוקה גבוהה. יחדיו, על ידי uלשיר פרוטוקול נוכחי, אפשר ליצור organoids מוח מתאי iPSCs אדם, אז מה שיכול להיות מנוצלים במגוון רחב של יישומים, מדוגמנות מחלה לפלטפורמות בדיקות סמים, על מנת להחליף ניסויים בבעלי חיים בצורה מהימנה בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פריץ תיסן קרן (Az.10.14.2.152). אנו מודים למתקן הטבעת רקמות ואת מתקן גרעין מיקרוסקופ של CMMC. אנו מודים על הדיונים ותמיכה טכנית מסופק על ידי חברי המעבדה לביולוגיה centrosome ו נוגדנים. אנו מודים לי מינג Gooi להגהה את כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
