Introduction
Человеческие развитие нервной системы расстройство, такие как микроцефалия, может быть плохо изучено только на животных моделей из-за того, что мозг человека имеет расширенную корковую поверхность, уникальную особенность, отличающуюся от животных, кроме человека.
Этот аспект делает развитие мозга человеческим сложный процесс , который не может быть достаточно изучен в 2D, в пробирке системы культивирования клеток. Новые методы 3D культур позволяют генерировать подобные ткани органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Дифференцировки в пробирке плюрипотентных стволовых клеток в 3D культуры подвески допускает образование различных типов клеток в области своевременного и конкретным образом, что приводит к организованной, стратифицированной ткани 1, 2, 3. Благодаря лаборатории, пионеры технологии 3D культур и демистифицировали сложность формирования органов, начиная от стволовых клеток,мы разработали надежный метод генерации органоиды мозга разграничить ранние события развития человеческого мозга и смоделировать микроцефалия в пробирке 1, 2, 3. Следует отметить , что мы адаптировали оригинальный метод , разработанный Lancaster и др. генерировать церебральных органоиды 1. Этот метод был модифицирован в соответствии с нашими экспериментальными требованиями.
Целью исследования с Габриэль и соавт. был проанализировать клеточные и молекулярные механизмы нейронального поддержания стволовых клеток в процессе развития мозга. Для того чтобы сделать это, механистическое исследование проводили с помощью анализа нейронных клеток - предшественников (НПС) в 3D органоидов головного мозга , полученных от пациента 4 микроцефалии. Этот пациент нес мутацию в ППДЕ, законсервированный центросомном белок , необходимый для центросом биогенеза 5. Широко принято гипо-тезис , что микроцефалия является результатом истощения пула NPC, и это может быть обусловлено либо к гибели клеток или к преждевременной дифференцировке 1, 6, 7, 8, 9.
Путем анализа желудочковых зон (VZS) микроцефалия органоидов мозга, было показано , что значительное число НПСА подвергается асимметричному делению клеток, в отличии от органоидов мозга , полученных от здорового донора 4. Обширные микроскопические и биохимические анализы микроцефальных органоидов мозга выявили неожиданную роль для ППДА в своевременной ресничек разборке 4. В частности, мутировали CPAP связано с запаздывающим реснички разборки и отсроченной клеточного цикла повторного входа, что приводит к преждевременному дифференциации РНУ 4. Эти результаты указывают на роль ресничек в микроцефалии и йEIR участие в процессе нейрогенеза и размера мозга управления 10.
Первая часть этого протокола является описанием способа трехступенчатого для создания однородных органоидов мозга. Как упоминалось ранее, оригинальный протокол Lancaster был адаптирован и изменен в соответствии с нашей цели 1. Во-первых, человеческие иПСК культивируют в определенном без фидерного слоя условие на матрице Engelbreth-Холм-рой (ГЭП). Этот шаг позволяет избежать вариаций фидерных-зависимых культур плюрипотентных стволовых клеток. В этом протоколе, индукция дифференцировки нервной с образованием нейронной эпителии начинается непосредственно из ИПСКА. Путем пропуска шага эмбриоидного тела (EB) образования, нейронная дифференциация протекает в более контролируемый и направленный образе. Этот подход ограничивает спонтанное и неориентированное образование других слоев зародышевых клеток, такие как мезодермы и энтодерма. Применяя этот протокол, нейросферы содержащие нейронные розетки могут быть собраны на 5-й день для EHS матрицы вложение и стационарные суспензионной культуры. Органоид среда, используемая для третьего этапа нашего протокола дополняется dorsomorphin и SB431542. Dorsomorphin является ингибитором малых молекул костного морфогенетического белка (BMP), и SB431542 ингибирует / активин / узловой сигнальный путь TGF-beta. Сочетание этих факторов может способствовать нейронной дифференциации более эффективны , чем в одиночку 11, 12, 13, 14 ретиноевой кислоте.
В целом, эти модификации позволяют воспроизводимое поколение органоидов мозга, с минимальными различиями между органоидами. Важно отметить, что этот метод был применен для генерации энергично микроцефальных органоидов мозга от ИПСКА пациентов, которые несут мутации в генах, которые влияют на центросомы и динамику клеточного цикла.
Вторая часть этого протокола дает указание по подготовке брAin органоиды для анализа и интерпретации клеточных дефектов в микроцефалии. Это включает в себя фиксацию, cryosectioning, иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальной микроскопический анализ. Этот протокол обеспечит читатель с подробным описанием ожидаемых результатов и руководством для интерпретации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация мозга органоиды (23 дней)
- Инициирование нейроэктодермы (5 дней)
Примечание: Следующие пункты должны быть рассмотрены до начала дифференцировки. Метод перепрограммирования (lentiviral-, Сендайте-проявления вирусного, episomal- или микроРНК основы и т.д.) для получения человеческого ИПСКА в идеале должен быть одинаковым для все пациента и контролировать Ipsc линию. Различные наборы перепрограммирования и инструкция , основанная на опубликованных протоколах доступны 15, 16, 17, 18. Качество человеческих линий IPSC является ключом к реализации оптимальной дифференциации. Монитор колонии и морфологии клеток с помощью микроскопа и проверки плюрипотентности путем тестирования экспрессии маркеров, таких как Oct3 / 4, Nanog, или TRA-1-60.- Культура человека иПСК под фидерных свободных условиях в среде А на блюдо, покрытой Engelbreth-Holm-Swarm(ГЭП) матрица.
Примечание: Grow человека ИПСК фидерных бесплатно и без сыворотки, чтобы поддерживать определенное состояние культуры и, чтобы избежать дополнительной стадии для удаления мышей эмбриональных клеток (фидеров) MEFs перед началом дифференцировки. Оптимальное количество прохода для человека, чтобы начать ИПСК диапазонов дифференциации от прохода 15 при перепрограммировании, чтобы канал 70 в общей сложности. Когда пассирования, отделить hiPSC колонии клеток, как агрегат, используя соответствующее решение открепления клеток с малой механической нагрузкой и серологические пипетки 2-мл перевести агрегаты на новое блюдо. Избегайте диссоциации на отдельные клетки, так как это может индуцировать дифференцировку и апоптоз в большинстве линий IPSC. Было сообщено , что в долгосрочной перспективе, одноклеточный пересев может увеличить геномные изменения в человеческом ИПСКЕ 19, 20. Избегайте отрыв процедуры клеток, которые требуют стадий центрифугирования для удаления раствора для отсоединения, так как это уменьшает общую жизнеспособность ИПСКА. Контрольная работавсе культуры для микробных загрязнений, в частности, микоплазм, на регулярной основе, так как это может изменить качество ИПСКА и их дифференцировка потенциал.- Пальто 60 мм культуры ткани блюдо с матрицей EHS в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Оттепель аликвоту 1 × 10 6 человека ИПСКА. Семя ИПСКА в 60-мм блюда культуры ткани с покрытием в виде матрицы , содержащего EHS и 5 мл среды А (см Материалов таблицы). Изменение среды ежедневно и прохождения через 5 до 7 дней, когда клетки достигают ~ 80% сплошности.
Примечание: Прохождение талой ИПСК на 80% конфлюэнтности с использованием стандартных методов, таких как фермент , свободной от отряда колонии 21, по крайней мере , один раз перед началом дифференцировки. Короче говоря, удалить носитель Ipsc, промыть клетки один раз с подогретой 37 ° C Дульбекка модифицированной среды Иглы: питательная смесь F12 (DMEM / F12), и инкубировать ИПСК следующих изготовителяинструкции с использованием реагента А (смотри таблицу материалов). Не превышать рекомендуемое время инкубации, чтобы избежать диссоциации на отдельные клетки. Человеческие иПСК должны быть отделены и плавающие в виде агрегатов, а не в виде отдельных клеток. Затем они могут быть переданы к новому EHS матричных покрытым блюдам; например, Ipsc агрегаты из одного 60-мм блюда может быть распределены до 4 новых 60-мм чашек. - Проверка на микоплазму с комплектом обнаружения микоплазм в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте только микоплазмы свободного ИПСК, так как микоплазма может изменить способность дифференцировки ИПСКА.
- Диссоциируют ИПСК (80% сливающийся) и подготовить одну клеточную суспензию с использованием реагента В.
- Промывают ИПСК один раз подогретого (37 ° С) DMEM / F12.
- Добавить подогретого реагента B (например, 1 мл в 60 мм чашку) и инкубировать ИПСК в течение 5 мин при 37 ° С и 5% CO 2.
- Флик 20 раз с пальцем на стороне и нижнемблюдо, чтобы отделить ИПСК. Проверьте отряд клеток под микроскопом.
- Пипетировать клеточную суспензию вверх и вниз в блюде 5 раз с помощью микропипетки 1-мл.
- Добавьте 3 мл среды А для разбавления 1 мл реагента В и собирают суспензию клеток в центрифужной пробирке 15 мл.
- Осторожно спин вниз ИПСК (500 XG) в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды В и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра.
Примечание: Имейте в виду, используя только средний B для взмучивания. Избегайте использования среды А, так как она содержит слишком высокую концентрацию bFGF, который может ингибировать дифференцировку.
- Развести клеточной суспензии до 4,5 × 10 5 клеток на мл в среде B , дополненной 10 мкМ Rho-ассоциированный ингибитор протеинкиназы (Y-27632).
- Добавьте 100 мкл на лунку в не-присоединенными, V-нижней, 96-луночный планшет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что клетки равномерно распределены в СУСпенсионного встряхиванием трубку каждый раз, прежде чем принимать 100 мкл порции. Важно, что каждая скважина должна содержать эквивалентное количество клеток, чтобы получить нейросферы однородные по размеру и форме (круглые, определенные поверхности). - Аккуратно спин вниз пластины с клетками при 500 Xg и комнатной температуры в течение 3 мин и инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2.
- Изменение среды ежедневно путем удаления 50 мкл и добавлением 50 мкл свежей среды В в каждую лунку в течение следующих 5 дней.
- Культура человека иПСК под фидерных свободных условиях в среде А на блюдо, покрытой Engelbreth-Holm-Swarm(ГЭП) матрица.
2. Встраивание Нейросферы в ГЭП матрице (4 дня)
- Подготовка нейросфера среды путем смешивания следующей: 1 смеси DMEM / F12 и среды С (об / об), 1:: 1 200 (об / об) дополнения 1, 1: 100 (объем / объем) дополнения 2 без (ж / о) Витамин а, 1: 100 L-глутамина, 0,05 мМ заменимых аминокислот (MEM), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1,6 г / л инсулина, и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола.
- Сбор Нейросферы остроумиега 200 мкл с помощью микропипетки мм наконечник ~ 2 предварительно разрезанную стерильными ножницами.
- Поместите нейросферы приблизительно 5 мм друг от друга на парафиновой пленке (3 х 3 см 2) в пустой 100 мм чашке и тщательно удалить как можно больше оставшуюся среду , насколько это возможно.
- Добавить каплю (7 мкл) матрицы EHS на каждом отдельном нейросфера.
- Выдержите матрицу EHS падает с нейросферами в течение 15 мин в термостате.
- Вымойте нейросферы тщательно от парафиновой пленки путем промывки их нейросфера среды. Для промывки используйте 1 мл микропипетки и новый 100 мм чашку Петри, содержащую 10 мл среды нейросфера.
- Инкубация нейросферы в течение следующих 4 дней и добавьте 2 мл свежей среды нейросферы на 2-е дня.
Примечание: Убедитесь, что полки в инкубаторе являются плоскими, так что EHS матрицы встраиваемых нейросферы не слипаются на одной стороне тарелки.
3. органоидов в Ротари ПодвескаКультура (14 дней)
- Подготовка мозг Органоида среды путем смешивания следующая: 1 смеси DMEM / F12 и среду С (об / об), 1:: 1 200 (об / об) дополнениях 1, 1: 100 (объем / объем) добавка 2 Вт / о Витамин а, 1: 100 L-глутамина, 0,05 мМ МЕМ, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1,6 г / л инсулина, 0,5 мкМ dorsomorphin, 5 мкМ SB431542 и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола.
- Добавляют 100 мл мозга Органоид среды к каждой вращающейся колбе через ее боковые руки и поместить их в инкубатор для предварительного нагрева, по меньшей мере, 20 мин.
- Установите программу для перемешивания при 25 оборотах в минуту, в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Перед переносом EHS матрицы встраиваемых нейросфер в вращающиеся колбы, убедитесь, что все они разделены. Если два или более соединены через матрицу EHS, разделите их разрезанием соединяющей матрицы с помощью скальпеля. - Аккуратно перенести EHS матрицы с внедренными нейросферами в центрифужные колбы, содержащих 100 мл среды Органоида насING серологической пипетки 2 мл. Используйте боковые кронштейны вращающейся колбы для передачи нейросферы в колбу.
- Поместите вращающиеся колбы на магнитной перемешивающей платформы в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2; это день 0 из органоидных культур.
- Изменение среды один раз в неделю (или чаще, когда происходит изменение цвета), удаляя половину среды и добавляя такое же количество свежей среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении Вертушки колб из инкубатора, подождать 3-5 минут, чтобы позволить органоидам опуститься на дно колбы. Удалить среду, помещая наконечник стеклянной пипетки (соединенный с насосом) на поверхности жидкости; аспирата среду тщательно через одну боковое отверстие / руку колбы. Эти манипуляции должны проводиться под ламинарным укрытием.
4. Анализ мозга органоидами
- Фиксация органоидов
- Сбор органоиды на 14-й день культивирования Wi вращающаяся колбаго разреза в 1 мл микропипетки (вырезать ~ 5 мм). Поместите все из них в 60 мм чашку и промыть их один раз с 5 мл теплой DMEM / F12 в течение 3 мин.
- Подготовьте 1,5 мл пробирку с 500 мкл теплой 4% параформальдегида (PFA).
Внимание: Носить кожу и средства защиты глаз и работать под колпаком безопасности при обращении с PFA фиксатором. - Поместите каждый Органоид отдельно в каждой пробирке и зафиксировать их в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Не закрепляйте органоиды дольше, чем 60 мин. Чтобы переместить органоиды, использовать петлю посевной или любое другое Завещание, которое удобно.
- Удалите PFA и мыть фиксированные органоиды два раза в течение 10 мин каждый с 1 мл PBS.
- Хранить не органоиды в 1 мл PBS при 4 ° С в течение до 7 дней, до дальнейшего использования.
- Встраивание органоидов для cryosectioning
- Удалить PBS и добавляют 1 мл 30% сахарозы в дистиллированной воде раствора на пробирку, чтобы обезвоживают перед органоидами cryofreezing их; после добавления sucroРешение себе, что органоиды должны быть плавающими на поверхности. Хранить органоиды в течение ночи в растворе сахарозы при 4 ° С; на следующий день, то органоиды должен запали в нижней части трубы.
Примечание: органоиды можно хранить до 3-5 дней при температуре 4 ° С в растворе сахарозы, если это необходимо. - Заполните винилового образец формы с 400 мкл Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения и использовать петлю инокуляции, чтобы поместить Органоид в центре пресс-формы. Этикетка край пресс-формы с именем образца.
- Зафиксировать на Органоид содержащих формы при температуре -80 ° C до cryosectioning.
- Coat стекло cryoslides с 0,1% лизина поли-L-раствора (ФАПЧ) в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, и пусть слайды высохнуть в течение 3 ч. Храните слайды при температуре 4 ° С и нагреть их до комнатной умеренного перед использованием.
Примечание: ФАПЧ-покрытие является важным шагом, поскольку это позволит предотвратить Органоид ломтиков от плавающих прочь. Собирать и хранить раствор ФАПЧ при температуре 4 ° С в течение до 3месяцы. Перед повторным использованием, фильтровать ее с шприц 0,22 мкм, и пусть он нагреться до комнатной температуры. - Раздел cryofrozen органоиды в 20-50 мкм толщиной срезов на стекле ФАПЧ с покрытием cryoslides 22. Пусть слайды с секциями сохнуть в течение 1 ч при комнатной температуре. Хранить секции при температуре -80 ° С до дальнейшей обработки.
- Удалить PBS и добавляют 1 мл 30% сахарозы в дистиллированной воде раствора на пробирку, чтобы обезвоживают перед органоидами cryofreezing их; после добавления sucroРешение себе, что органоиды должны быть плавающими на поверхности. Хранить органоиды в течение ночи в растворе сахарозы при 4 ° С; на следующий день, то органоиды должен запали в нижней части трубы.
5. Иммунофлуоресцентного Окрашивание Органоид секций
Примечание: Для общей характеристики органелл, окрашивание нестин, нервной прародительницы маркера и TUJ1, пан-нейронный маркер, рекомендуется. В качестве дополнительных примеров, иммунофлуоресцентного окрашивания с фосфо-Виментин (п-VIM), который маркирует митотические апикальные радиальные глиальные клетки, и Arl13b, для реснички, описаны. Для проверки апоптоза, используйте анализ терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы (TdT) дУТФ Nick-End Этикетировочного (TUNEL). Поместите слайды в пластиковой коробке во время инкубационных, чтобы защитить их от пыли, свет,и высыхания.
- Оттепель слайдов в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайдов дважды 200 мкл PBS-глицина (0,225 г глицина в PBS) в течение 3 мин, чтобы погасить ПФА-индуцированной флуоресценции.
- Проницаемыми секции с 200 мкл 0,5% Тритона Х100 / 0,1% твина в растворе PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть их в два раза с помощью 200 мкл PBS-глицина раствор в течение 3 мин.
- Инкубируйте их с 200 мкл 0,5% рыбьего желатина / 0,1% Triton X100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С, чтобы блокировать неспецифическое связывание антигена.
Примечание: Если требуется анализ TUNEL, выполнение анализа в соответствии с протоколом производителя. Начнет с анализом TUNEL перед выполнением иммунного окрашивания, как это могло бы мешать вторичные антитела и гасят флуорофоры при использовании впоследствии. - Развести антитела в блокирующем растворе при следующих концентрациях: нестин, 1: 200; п-Вим, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 1:20; и вторичные антитела, 1: 1000.
- Инкубируют 200 мкл первого первичного антитела (например, нестин) в течение 1-2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
- Развести первый (анти-мышь 488) вторичное антитело 1: 1000 в блокирующем растворе и инкубировать слайд в 200 мкл в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Отныне, всегда защищать слайды от света.
- Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
- Инкубируют 200 мкл следующего первичного антитела (например, TUJ1) в течение 1-2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
- Добавьте 200 мкл следующего вторичного антитела (анти-кроличьего 647) в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
- Промыть 3 х 3 мин. с 200 мкл блокирующего раствора.
- Добавляют 200 мкл 4' , 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) при 30 нМ концentration в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре в течение ядерного окрашивания.
- Промыть 2 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
- Промыть 1 х 1 мин с помощью 200 мкл дистиллированной воды и пусть секции сохнуть в течение 10-20 мин, пока не очевидно, капли воды не видно больше.
- Установить участки с вложением среды. Храните их в защищенном от света при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
- Далее с микроскопическим анализом изображения на общий обзор Органоид, желудочковой зоны, примитивного кортикальной пластинки, и в других областях, представляющих интерес.
- С помощью конфокальной микроскопии с 63X нефти объективных и флуоресцентных фильтров, выбранных в соответствии с флуоресцентным красителем-меченый вторичных антител , используемых 1, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколение органоидов мозга требует , по крайней мере , три недели непрерывного культивирования (рис 1А). Для достижения воспроизводимых результатов, мы рекомендуем, чтобы исследователь документы каждый шаг и, что немаловажно, позволяют избежать каких-либо изменений в отношении компонентов среды, моментов времени, и обработки клеток. Здесь мы приводим сводку о том, как оценить, если критические этапы будут достигнуты, чтобы получить органоиды достаточного качества в конце эксперимента. Образование нейросферах в 96-луночный планшет должен быть четко виден со дня 4. Нейросферы могут быть признаны четко определенных сфер на нижней части каждой скважины (фиг.1В, этап 1).
На 5-й день, нейросферы должно быть ~ 500 мкм в диаметре и имеют гладкую поверхность, с ярким ободом окружающим темным центром. Может быть, можно уже наблюдать нейронную розетку типа расширенного STRUв пределах этого ать задание буквально яркого обода (рис 1C, начало стадии 2). Если нейросферы разваливаться или появляются больше как клеточные агрегаты, дифференциация не должна быть продолжена дальше. И, наконец, следует увеличить органоиды и имеют аналогичный размер в процессе дифференциации в вращающихся колбах (рис 1D, шаг 3). См таблица поиска неисправностей (таблица 1) для получения дополнительной информации.
Качество дня 14 органоидов должно быть проверено с помощью световой микроскопии. VZS состоит из толстых слоев нестинов-позитивных NPC / радиальных глиальных клеток с палисадной формой ядра на апикальной стороне. С другой стороны, примитивная кортикальная пластинка будет содержать обильные TUJ1-позитивные нейроны на базальной стороне, пространственно отличномом от апикальной стороны (рис 1E). Важно отметить, что TUJ1-позитивные нейроны не должны рассматриваться на апикальной стороне VZ.
(рис 1F и G) 23,24. Когда достаточное расширение Arg достигается, начинается нейрогенез, делящиеся клетки меняют свою ориентацию в направлении просвета, а плоскость деления переключается с горизонтальной (симметричной) к вертикальной (асимметричные) 4, 12, 24.
Рисунок 1: Генерация мозга органоидов из человеческих плюрипотентных клеток. (А) Рабочий процесс протокола дифференцировки. Шаг 1: Начало дифференциации. Во время этой фазы, формирование нейросфер из человеческого ИПСКА в 96-луночный планшете происходит. Продолжительность составляет 5 дней. Шаг 2: Встраивание нейросферы в капельках матричных ГЭП. Стационарная суспензионная культура EHS матричных встраиваемые нейросфер имеет продолжительность времени 4-х дней. Шаг 3: органоиды в вращающихся колбах. Передача EHS матричных встраиваемые нейросфер для вращающихся колб происходит. Продолжительность составляет 14 дней. (Б) нейросфера в мульти-луночного планшета. Представитель образ нейросфера на 4-й день в 96-луночный планшет в течение стадии 1 показан. Сфера должна быть четко видна на дне колодца, с гладкой, круглой поверхностью (красным Arroж). (С) Морфология нейросферах до EHS матрицы вложение. Нейросферы, собранные на 5-е дня стадии 1 должны быть однородными по размеру и отображать гладкую поверхность с ярким ободом (кронштейн и стрелка). (D) , в органоидах вращающихся колб. Вращающийс сосуд с органоидами мозга во время стадии 3 (красные стрелки) показан здесь. (Е) Иммунофлуоресцентная визуализация cryosectioned органоидов , отображающих типичный VZ и примитивная кортикальная пластину. Левая панель показывает ядерное окрашивание клеток на VZ. ВЗ простирается от апикальной стороны (просвет л) к базальной стороне (желтая линия). Следует отметить, что клетки в пределах дисплея ВЗ PALISADE-подобных ядер, предполагая, что они представляют собой радиальные глиальные клетки. Правая панель показывает иммунофлуоресцентное окрашивание нестин-позитивный НПС (зеленый цвет) в пределах ВЗА и TUJ1-позитивных нейронов (Magenta) в примитивной кортикальной пластинке. Шкала бар = 50 мкм. (F) , Иммунофлуоресцентная визуализация cryosectioned органоидов. Два примераиз VZS, окрашенных с п-Vim и Arl13b (I и III). Области, отмеченные белыми квадраты увеличиваются справа для каждой вставки изображений (II и IV). Деление плоскости анафазных апикальная радиальных глиальных клеток (арг). Разделив апикальные радиальные глиальные клетки на апикальной стороне VZ является п-Вьет-положительный (пурпурный). Примеры симметрично делящихся арги показаны (белые квадраты и вставка). Плоскость деление дается в виде белой линии. Деление плоскости на анафазе ячейки горизонтально по отношению к поверхности светового потока линии (желтая пунктирная линия) и отмечен Arl13b окрашивания (зеленый). Шкала бар = 50 мкм. (G) Эта схема обеспечивает вертикальную или горизонтальную ориентацию арг в анафазе относительно просвета. Разделительные клетки управления органоидами на 14-й день, в основном ориентированы горизонтально (0-30 °) по отношению к поверхности просвета ВЗ. Апикальная сторона просвета выстлана первичная ресничек арг, которые определяют просвет поверхность VZ (зеленая линия). В противоположность этому, мост радиальных глиальных клеток микроцефалии органоидов отображение вертикально ориентированный (60-90 °) плоскость деления. Белая линия показывает ось плоскости деления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Проблема: | Возможные причины: | Предложения: |
| Шаг 1.1.1.2 | Низкая эффективность перепрограммирования | Проверьте hiPSCs для маркеров плюрипотентности: если качество низкое, вручную выбрать недифференцированные колонии для нескольких пассажей, чтобы обогатить плюрипотентную колонию |
| Человеческий иПСК дифференцироваться перед началом дифференцировки | ||
| Стресс из-за ранний пересев или passagiнг в виде отдельных клеток | Не проход, прежде чем 80% сплошности достигается. Пассаж в виде агрегатов, а не отдельные клетки | |
| Заражение микоплазмами | Испытание на загрязнение микоплазмы | |
| Шаг 2 | Плохое качество hiPSCs | Улучшение качества hiPSCs (смотри выше) |
| Нейросферы не образуют вообще или развалиться на 5-й день после начала дифференциации | Начиная число клеток на лунку слишком низкое или слишком высокое | Точно подсчитать количество клеток и распределить их поровну в каждой лунке |
| hiPSC среду использовали вместо нейронной дифференциации среды | Использование нейронной дифференциации среды | |
| Центрифугирование шаг был слишком жестким или мягким | Спин 96-луночный планшет 500 мкг в течение 3 мин и проверить, если клетка накапливается в центре надно каждой лунки | |
| Нет Y-27632 при начале дифференцировки | Используйте Y-27632 для повышения выживаемости клеток | |
| Клетки прикреплены и росли в нижней части пластины | Убедитесь, что используется не прилегающая 96-луночный v-нижней пластина. | |
| Шаг 2 | Нет среднего ежедневной смены | Изменение половины количества среды ежедневно |
| Нейросферы не однородны по размеру | Начиная число клеток на лунку не была равной | Смешайте трубку с одной клеточной суспензии каждый раз, прежде чем принимать по 100 мкл клеточной суспензии |
| Среднее изменение не было сделано для каждой скважины ежедневно | Убедитесь, что каждый хорошо уживается среднее изменение ежедневно | |
| Шаг 2 | hiPSC не диссоциируют IntO отдельные клетки перед началом дифференцировки | Проверьте под микроскопом, если hiPSC диссоциируют на отдельные клетки после обработки Accutase. Если есть еще агрегаты, пипетка ячейки 10 раз вверх и вниз с 100 мкла микропипеткой и проверить еще раз или повторить Accutase лечения |
| Нейросферы не отображают яркий обод или круглую поверхность; они образуют большие кисты на поверхности | Начиная число клеток на лунку была слишком высока | Точно подсчитать количество клеток и распределить их поровну в каждой лунке |
| Средние изменения не было сделано ежедневно на каждую лунку | Изменение половину среды ежедневно | |
| Шаг 2,7 | Плохое качество hiPSCs | Улучшение качества hiPSCs (смотри выше) |
| EHS матрицы встроенной нейросферы палку и слипаются | Не хватает среднего (по объему) | Обеспечитьминимум 10 мл среды в 100 мм чашке Петри |
| Шельф инкубатора даже не | Поместите блюдо на ровную поверхность | |
| После размещения в инкубаторе, перемещайте антенну так, что нейросферы распределены равномерно |
Таблица 1: Поиск и устранение неисправностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCPH является сложным человеком психомоторного расстройства , которое не может быть обобщенно на животных моделей в естественных условиях или в простой культуре клеток человека подходов в пробирке. Клиническое проявление MCPH начинает появляться в течение первого триместра беременности, когда начинается рано нейрогенез. Таким образом, 3D органоиды мозга представляют собой надежную экспериментальную систему для моделирования развития MCPH. Кроме того, 3D органоиды человеческого мозга являются идеальным подходом, поскольку я) они позволяют для адаптации спектра образцов пациентов с различным генетическим фоном, б) они показывают организованную ткань, содержащую различные нейронные типы клеток, и, что немаловажно, III) различная дифференцировка этапы развития нервной системы в этом подходе в пробирке связаны с их аналогами в естественных условиях 25, 26, 27. Например, нейронная розетка является эквивалентной структурой, развивающейся нервнойтруба.
Ланкастер и др. используется в два раза больше ИПСКА пациентов по сравнению с контрольным ИПСКОМ, чтобы преуспеть в создании органоидов пациента. Следует отметить, что с протоколом , описанным здесь, путем изменения существующих методов, мы могли бы произвести контроль и микроцефалии органоиды мозга , начиная с тех же числа клеток 4. Это стало возможным за счет определенных условий культивирования ИПСК и за счет более направленной дифференцировки. В этом протоколе, Органоид поколение было улучшено путем замены обычно выполняются EB этапа формирования пути инициирования нейронной дифференцировки непосредственно из ИПСКА. Во-вторых, на шаге 3, dorsomorphin и SB431542 были дополнены в культуральной среде, а не только ретиноевой кислоты. Ретиноевой кислоты легко изомеризуется при применении к клеточной культуральной среды 28. Таким образом, его биологическая активность меньше, чем Defined более устойчивых соединений, таких как dorsomorphin. Dorsomorphin угнетаетВМР4 сигнальный путь, и SB431542 является ингибитором активин / узловой сигнального пути (TGF-β1 ALK ингибитор). Сочетание обоего соединений приводит к ингибированию BMP и активин / узловому сигнального пути, индуцирует дифференцировку нейронной, и уменьшает дифференцировку в другие линии в различных клеточных линиях человека ES или плюрипотентные клетки человека с одинаковой эффективностью 29. Соединение стабильности и универсальный клеточный ответ на соединение , является важными для создания протокола , который может быть применен к различным клеточным линиям пациента к модели заболевания в пробирке. Таким образом, надежные и эффективные результаты дифференциации в гомогенном мозге Органоид культур и, в конечном счете, в более воспроизводимых данных.
С учетом этих изменениями, критические шаги в протоколе сведены к минимуму к инициации дифференцировки на стадии 1. На этом этапе, важно, чтобы мягко диссоциирует ИПСК в одноклеточный суспензииго, чтобы распределить их точно и равномерно в каждую лунку 96-луночного планшета. Ро-ассоциированный ингибитор протеинкиназы (Y-27632), должен быть добавлен к среде В течение первых 24 ч, поскольку он поддерживает выживание ИПСКА при их диссоциации на отдельные клетки. Важно, чтобы привести клетки в тесном контакте друг с другом, вращая их вниз на дно лунок. После того, как нейросферы образуются в конце стадии 1, успешное завершение дальнейших экспериментальных процедур можно ожидать. В случае нейросферы не образуют, плюрипотентность человеческих ИПСК, не-прилипание клеток в 96-луночного планшета, а также условия центрифугирования должны быть проверены. нет Вся процедура в день 0 шага 1 должен занимать не более 1 часа из-за чувствительности человеческого ИПСК. Средние изменения в течение следующих дней должны быть сделаны аккуратно, избегая отвесные силы, чтобы не разрушить только что сформированные контакты клеток между клетками.
Следует отметить, что centrosomаль-мутанты имеют дефектную клеточную пролиферацию и измененную динамику клеточного цикла. Таким образом, моделирование MCPH требует мощного протокола, который может выдержать скомпрометированные клеточные функции. Следовательно, текущий протокол позволяет для генерации однородных органоидов высокого качества и служит в качестве уникального инструмента для изучения клеточного гомеостаза штока на VZ. В отличие от других протоколов, этот протокол обеспечивает генерацию органоидами от контрольных и пациента ИПСК, начиная с равными количествами клеток. Для исследований , основанных на дифференциации в пробирке, идентичные условия культивирования для различного ИПСКА являются основным требованием для выявления заболеваний , связанные с изменений и избежать культур условия артефактов. Кроме моделирования микроцефалии генетического происхождения, этот протокол также может быть применен к микроцефалии не-генетического происхождения, в том числе от нейротрофических вирусных инфекций, химических веществ или радиации. 30 Кроме того, современные молекулярные инструменты биологии, такие как CRISPR / cas9 генома редактироватьING технологии, может быть применено к 3D органоидам рассекать конкретные аспекты человеческой парадигмы развития мозга , в пробирке 31, 32, 33.
С другой стороны, поколение органоидов мозга на сегодняшний день до сих пор не вышло за пределами первого и начала второго триместра человеческого развития 34. Превосходя это ограничение и позволяет поколение зрелых органоидов мозга в пробирке откроет новые возможности для моделирования нейродегенеративных расстройств , которые проявляются на более поздних стадиях, таких как болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Для будущих приложений, протоколы направление дифференцировки к более конкретным регионам, как и передний мозг мозг, может представлять интерес для изучения сложных неврологических расстройств , таких как аутизм и шизофрения 35, 36, 37, 38.
Важно отметить, что некоторые аспекты должны быть приняты во внимание при составлении выводов из органоидных исследований. Первое ограничение заключается в том, что нет никакой очевидной васкуляризации в органоидах. Таким образом, газообмен и питательные вещества в пробирке лишь приблизительно в естественных условиях. Во-вторых, так как органоиды мозга не связаны со сложными системами органов, то Органоид модель не полный иммунитет, метаболические и гормональные системы. Тем не менее, отсутствие этих аспектов иногда дает преимущество. Например, органоиды , описанные здесь , могут заменить подавленные в естественных условиях модели при рассмотрении воздействия иммунной системы в патогенезе заболеваний мозга.
С использованием вращающихся колб, большое количество органоидов может быть сгенерировано для биохимических экспериментов, всего анализа транскрипта секвенирования, а также с высокими пропускными способностью скринингов лекарственных средств. Взятые вместе, на ипеть этот текущий протокол, один может генерировать мозг органоиды из клеток человека ИПСКА, которые затем могут быть использованы в широком диапазоне применений, от моделирования болезней для тестирования наркотиков платформ, для того, чтобы надежно заменить испытания на животное в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фриц Тиссен фондом (Az.10.14.2.152). Мы благодарны ткани вложения объекта и основной микроскоп объект в CMMC. Мы благодарны за обсуждения и технической поддержки, предоставляемой членами Лаборатории Центросома и цитоскелета биологии. Мы благодарим Ли Мин Gooi за вычитку рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
