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Developmental Biology

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

doi: 10.3791/55373 Published: May 6, 2017

Summary

심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

Abstract

인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.

Introduction

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세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 - 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 모델로 hPSC-의 CM 응용 프로그램에 장애물이 될 수 있습니다.

표현형 미숙의 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 적극적으로 심근의 성숙을 촉진하기 위해 조사되었다. 초기 연구는 순환 기계 (10) 또는 전기 자극 (11)을 통해 신생아 래트 심근 세포의 효과적인 친 성숙 특성을 밝혀. 젤 압축 및 고리 기계적 자극은 또한 전기 생리 칼슘 취급 특성의 향상과 최소 hPSC-CM 성숙 (12, 13)의 일부 측면을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서, "생물학적 와이어"(biowire)라는 플랫폼 시스템은 큐 구조와 전계 stimulatio 모두를 제공하여 고안된N은 hPSC의 CM-14의 성숙을 증진한다. 이 시스템은 전기장 자극 의무가 정렬 된 심장 조직을 만들기 위해 미세 플랫폼을 사용한다. 이것은 hPSC-CM이의 구조 및 전기 생리학적인 성숙을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 biowires을의 세부 사항을 설명합니다.

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Protocol

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1. 마스터 디자인 및 제작

참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터.

  1. 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 인쇄. 투명 같은 디바이스 패턴과 같은 어두운 주변 영역을 설정; 마스크는 (다른 사람 (15)에 의해 기술 된 바와 같이) 광 리소그래피에 의해 SU-8에 디바이스 패턴을 전사하는 템플릿으로서 역할을한다.
  2. 4 인치 실리콘 웨이퍼의 중심에 SU-8 (50)의 약 4 mL로 분배. 코트 SU-8 (50) 30 초 동안 균등 분 (RPM) 2,000 rpm의 속도로 회전하는 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼상의. 10 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. 자외선 (UV)에 리튬 웨이퍼 폭로200에서 엠제이 GHT / cm 2.
  3. 30 초 동안 2,500 RPM으로 상기 웨이퍼 및 회전 중심 상에 SU-8 2050 약 4 mL를 부어. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. 실온 (RT) 쿨.
  4. 단계를 반복 1.3 두 번 더.
  5. 제 1 층의 투명 마스크로 코팅 된 웨이퍼를 커버. 제 층을 만들기 위해 270 mJ의 / cm 2의 UV 광에 웨이퍼를 노출. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워.
  6. 두 번 단계 1.3를 반복하여 SU-8 2050의 두 번째 레이어를 확인합니다.
  7. 노광 마스크를 이용하여 제 층에있는 기능을 2 층째 마스크 정렬. 그 후, 240 mJ의 / cm2로 UV 광에 노출. 15 분 동안 95 ℃에서 구워.
    주 : 노광 시간이 필요한 총 UV 조사량 사용하기 전에 날에 측정 된 UV 광 출력 세기에 의해 결정된다.
  8. 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 침수 및 오비탈 진탕 기에서 30 분 동안 200 RPM으로 진탕하여 웨이퍼를 개발한다.
  9. 장소웨이퍼의 중심 :주의 배양 접시에 마스터는 (1 내지 10 중량의 비율 가교제 염기)를 PDMS 액을 붓는다. 모든 기능을 커버 및 공기 방울을 피하십시오.
  10. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. PDMS의의 biowire 템플릿의 가장자리 (오른쪽 그림 1A) 주위를 잘라 날카로운 칼날을 사용합니다. 마스터에서 PDMS를 껍질입니다. 블레이드와 트리밍 장치. 20 분 동안 121 ℃에서 멸균 봉지 증기 오토 클레이브에서의 PDMS biowire 템플릿을 넣어.
  11. 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에서, 페트리 접시에 템플릿 biowire PDMS의 배치합니다. 채 채널 (그림 1B-I)의 양쪽에있는 홈에 착석하여 PDMS의 마이크로 웰의 채널의 중앙에 무균 수술 실크 봉합사 (6-0)의 조각을 탑재 핀셋을 사용합니다.

전기 자극 상공 회의소 2. 창조

  1. 2cm의 X : 폴리 직사각형 조각 (세로 × 가로 × 두께 쌍을0.85 cm X 0.35 cm)와 전기 자극 챔버의 구조로 사용 (도 2).
  2. 각각의 폴리 카보네이트 구조 부재의 중심선을 따라 2cm 떨어진 두 3mm 와이드 구멍을 뚫는다.
  3. 1.5 cm 길이 탄소봉 두 조각을 잘라. 끝에서 약 3mm 탄소봉으로 1mm의 폭 구멍을 뚫는다. 카본로드 관통 구멍 백금선 스레드 및 탄소 막대 주위를 감싸는 와이어를 조인다. 전기 자극기와 나중에 연결하기위한 백금 와이어의 타단에 클립을 첨부.
  4. 폴리 카보네이트 프레임 부분에 카본 봉을 삽입한다. 여섯 웰 플레이트의 웰에 탄소봉으로 조립 된 프레임을 놓는다.
  5. 웰에 PDMS 2 용액을 붓는다. 가까운 PDMS 표면 레벨을 유지하지만, 탄소봉의 저부에 도달하지 동안 PDMS에 폴리 카보네이트 프레임의 바닥을 담근다. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다.
  6. 여섯에서 전기 자극 챔버를 타고웰로 20 분 동안 121 ℃에서 증기 멸균 멸균 봉지에 넣고.

hPSC-의 CM 3. 효소 해리

  1. 확립 된 프로토콜을 사용하여 4 심근 세포로 분화를 유도하는 hPSC.
    주 : 간단히 확립 배아 체를 통해 심근 세포를 생성 (EB) 프로토콜 뼈 형태 형성 단백질 (4), 염기성 섬유 아세포 성장 인자, 액 티빈 A, 혈관 내피 성장 인자 및 Dickkopf 상동 1~4와 순차 보급 통해 줄기 프로 매체이다. biowires를 만들기 위해 차별화의 하루 20-34에서 사채를 사용합니다.
  2. P1,000 피펫 팁과 저 부착 판의 EB를 모아서 원추형 튜브에 옮긴다. 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛. 하여 펠렛을 상층 액을 제거하고 재현 탁 미리 가온 (37) I 1 %의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제를 함유하는 콜라게나 ° C 타입 I (DNase를 I). 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션소화.
  3. 예열, 37 ° C 5 mL를 넣고 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하고 배지를 세척한다. 상층 액을 버린다. 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2 mL를 펠렛을 재현 탁하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  4. 3 %를 함유 정지 배지 1 mL를 넣고 (V / V)의 DNase의 I.
  5. 3-5 회 5 ml 주사기에 20 G (0.9 mm) 바늘을 부착하고이를 통해 EB 현탁액을 통과한다.
  6. 5 분 동안 280 XG에서 세탁 매체 원심 7 mL를 넣고. 상층 액을 버린다. Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)에서 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 저장합니다. 혈구와 휴대폰 번호를 확인합니다. 5 분 동안 280 XG에서 원심 분리하여 0.5 × 106 세포 펠렛을보십시오. 상층 액을 제거합니다.
  7. 멸균 튜브를 혼합하기 전에 얼음에 사전 멋진 모든 젤 구성 요소. 다음 콜라겐 겔 성분 (최종 농도)을 믹스 : 2.1 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 타입 I, 24.9 mM의 글루코오스 23.8 mM의 NaH를CO 3 14.3 mM의 NaOH를 10 mM의 HEPES 및 1X M199 배지에서 10 % 세포 외 기질. 콜라겐과 마지막 세포 외 기질을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다.
  8. 콜라겐 겔 3.5 μL와 0.5 × 106 세포를 재현 탁하고 잘 혼합한다.
  9. 0.5 cm 길이의 채널 (도 1B-II)로 세포 현탁액 4 μL를 추가하는 P10 피펫 팁을 사용한다. 멸균 된 핀셋 필요하다면 봉합사의 위치를 ​​조정한다.
  10. 확인 젤을 건드리지 않도록주의하면서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시의 바닥을 커버. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  11. 세포 (그림 1B-III)를 커버하기에 충분한 배지 12 mL를 (예를 들어, 프로 또는 중간 셀 제조업체에서 권장하는 줄기)와 PBS를 교체합니다. 일주 37 ° C에서 인큐베이터에서 문화. 매일 매체를 변경합니다.

Biowire 재배 4. 전기 자극

  1. 에서BSC는, 전기 자극기 챔버를 수용하는 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 2 mL를 넣고. 부드럽게 잘으로 멸균 전기 자극 장치를 배치 멸균 핀셋을 사용합니다. 우물에서 PBS를 폐기하십시오.
  2. 예열 배지 5 ㎖과 탄소봉 커버. 전기 자극 챔버 내의 biowires 마운트 무균 핀셋을 사용하여 상기 탄소봉 (도 2)에 수직 한 방향들을.
  3. 6 웰 플레이트의 상부에 뚜껑을 배치하지만, 전기 자극기와 연결 플레이트 외부 도달 충분한 백금 와이어를 떠난다. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 배치하고, 전기 자극에 백금 와이어를 연결한다.
  4. 이상성 반복 펄스, 1-MS 펄스 듀레이션, 3 V / cm, 초당 1 펄스 (PPS) 전기 다음 설정으로 자극기를 사용 biowires을 자극한다. 다음 값으로 PPS를 24 시간마다 상향 : 1.83, 2.66, 3.49, 40.82, 5.15 및 6 변경 매체 매일.
  5. 10 배 배율에서 현미경으로 전기 자극에 대한 응답으로 심근 수축력을 준수하십시오.
    참고 : 자극 일주일의 biowires이 성숙하게되면 (결과 섹션 참조).

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Representative Results

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biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자극 일 심근의 구조적 및 기능적 성숙 호환 상기 전시 특성을 실시 하였다.

biowires에서 PSC-CM이 인간 심장 수축성 단백질의 강한 발현 sarcomeric α-티닌 및 액틴 (도 4a)을 나타내었다. 우리는 myofibrilar 협착 hPSC-CM 수축성 장치 및 배향 sarcomeric 밴딩 관찰봉합사의 축을 따라. 이것은 성인 심장 (그림 4A)의 구조를 질적으로 유사하다. 둘째는 EBS에 비해, 이들 biowired hESC의-CMS는 낮은 증식 속도 (도 4b)를 표시. 셋째, biowired hESC의-CMS는 칼슘 등록 처리 (도 5) 및 심근 전기 생리학 성숙 (도 6)을 향상 나타냈다. 성숙한 심근 세포에서 카페인 치료는 근질 세망 (8)에서 칼슘의 갑작스러운 방출을 유도한다. 이러한 칼슘 과도 전기적 자극의 hESC-CMS의 발견 아니라 비 자극 제어 (도 5A-C)에서 세포 하였다. 비 자극 대조군에 비해 전기적으로 자극 된 세포에서의 카페인에 대한 응답은, 자극 주파수 별 방식 (도 5D와 E)의 강도가 상당히 높은 진폭을 밝혔다. 한편, 여기서 CMS hPSCbiowires 더욱 전기 자극 (도 6AB)에 의해 강화되었다 HERG 전류 정류 전류 내측 (I의 K1) 밀도를 개선 하였다. I K1의 전류의 이러한 개선은 biowires (도 6C)의 내향 정류 칼륨 채널 유전자 (KCNJ2) 단백질 발현 유도에 따른다.

성숙에 관한 또 다른 중요한 매개 변수는 심근 (심방과 심실) 16 일에 미성숙의 표시이다 자발적으로 이길 수있는 심근의 기능도 자동 성으로 알려져있다. 자동 성이 6 Hz의 처방을 실시 biowires에 필적 하였다 제어 biowires (도 6D)에 비해 EB 유래 심근 세포에서 유의하게 높았다.

갖다N 함께, 이들 결과는 전기 자극과 biowire에서 배양 hPSC의 CM-14의 구조 및 전기 생리 학적 성숙을 촉진 것을 나타낸다.

그림 1
그림 1 : Biowire 문화 플랫폼. (A) 도식 (왼쪽)과 실제 biowire (오른쪽) PDMS 몰드. 스케일 바 = 2 mm이다. biowire를 설정하기 위해 (B)는, 봉합은 채널 (I)의 중앙에 장착 하였다. 콜라겐 타입 I 겔에서의 hESC-CM 현탁액 채널 (II)의 주위에 봉합 시드 매체 (III)에서 배양 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :Biowire는 재배의 두 번째 주 동안 전기 자극 상공 회의소에서 배양 하였다. biowire은 탄소 전극에 수직으로 배치 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 셀 리모델링 및 젤 Biowire에서 예비 배양 7 일 이후에 봉합 주위에 계약. (A)에 biowire 템플릿 배양액의 표시 일에서의 CM-hESC의 브라이트 이미지. 스케일 바 = ~ 200㎛. 배양 표시된 날 겔 다짐의 (B) 정량 (평균 ± SD). biowire 섹션 (C) Hematoxylin & Eosin 염색 및 메이슨 트리 크롬의 (MT) 염색 (양두 화살표 봉합사 축을 나타낸다). 스케일 바R = 100 μm의. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : Biowire 플랫폼에서 심근 세포 배양의 생리학. (A) 비 - 자극 (대조군)의 대표적인 공 초점 이미지 및 심근 정렬 빈번한 Z-디스크를 나타내는 전기적 자극 biowires (3 Hz에서 6 Hz의 섭생) (양두 화살표 봉합사 축을 나타낸다). 녹색, α-티닌; 빨강, 액틴. 스케일 바는 20 μm의 =. biowires의 (B) 심근 증식은 EBS의보다 낮았다. 증식 sarcomeric α-티닌 및 Ki67 (N = 3-4 당 조건, 평균 ± 이중 염색에 의해 평가 하였다; SD). *, **, #, 그리고 &는 EBd34 (학생의 t의 -test)에 비해 유의 한 차이가 통계적으로 나타냅니다. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 칼슘의 전기 자극 승진 개선이 속성을 처리. (AC) 3 Hz의 처방 (B) 및 6 Hz의 처방 (C) 실시 nonstimulated 대조군 세포 (A) 및 셀 카페인에 응답 칼슘 방출의 대표적인 추적. (D) 실험군 간의 최대 형광 강도의 카페인 - 유도 변경 (피크 형광 제가 정규화 후의 평균 ± SEM카페인을 투여하기 전에 ntensity; 3 ㎐, P = 1.1 × 10 대 제어 - 6; 6 ㎐, P = 2.1 × 10 대 제어 - 7; 6 대 3 Hz에서 ㎐, P = 0.003; N = 10 (대조군), N = 6 (3 Hz에서), 및 N = 9 (6 Hz로) (학생의 t -test). (E) 2+ 과도 전 및 6 Hz의 처방을 실시 5mm의 세포 (화살표)에 카페인 투여 후 칼슘의 대표적인 형광 기록. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 전기 페이싱은 전기 생리 속성 및 자동 성을 향상시킵니다. Electrophysiologbiowires 또는 배아 체 (교환 사채)에서 고립 된 단일 심근에서 iCal의 속성은 패치 클램프로 기록되었다. (A) 꼬리 HERG 전류 밀도. -100 mV의 측정 (B) I K1 전류 밀도. (C) 상향 조절 칼륨의 내측 (KCNJ2)을 채널 유전자 정류. (D) 자율 박동 (자동 성)이나 자율 박동 아니오 (NO 자동 성)를 표시 셀의 비율. AD의 데이터는 실험 집단 간의 차이는 학생의 t의 -test, 카이 제곱 테스트 및 ANOVA (페어 다중 비교, 홀름 - Sidak 방법)에 의해 분석 된 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<TD의 열 결합은 = "5"> 부드럽게 뚜껑을 덮음으로써, 백금 와이어에 손상을 피한다. 뚜껑이 완전히 닫히지 않습니다 경우에 접시에 제대로 뚜껑을 확보하기 위해 테이프를 사용합니다. 인큐베이터의 도어를 닫을 때 인큐베이터의 적당한 밀봉을 보장하기 위해 도어 폐쇄 지점에서 전기 자극 중 와이어의 박 육부를 배치했다.
프로토콜 단계 # 중요한 단계
2.4 2cm 간격 또는 가능한 최소 거리 고 에너지 자극하고 세포 사멸을 피할 수 - 1 탄소봉을 놓는다.
2.6 백금 와이어 및 자극 챔버 처음 이루어지면 탄소 사이의 연결을 테스트한다. 전기 자극기로 자극 챔버를 연결하고, 원하는 전압을 설정한다. 두 탄소봉 각각에 볼트 리드를 놓는다. 자극 챔버로부터의 출력 전압은 전압계를 읽고 동일한 전압이어야한다. 잘못된 판독 PDMS와 백금 와이어의 가능한 코팅 또는 시스템의 다른 접속 불량을 나타냅니다.
3.1 단일 세포는 biowire 종자 사용되었다. 해리를 들어, incubatioN 콜라게나 시간은 중요하며, 세포의 연령 및 분화 프로토콜 (단층 대 사채)에 의해 결정되어야한다. 이 프로토콜에서, 2 시간의 배양 시간은 21 일 사채 및 단층을 30 분을 권장한다. 다른 연령대의 세포를 들어, 콜라겐 분해 시간은 세포 생존과 수축 기능 후 소화를 모니터링하여 최적화를해야 할 수도 있습니다.
3.3 트립신은 세포를 손상시킬 수 있습니다; 따라서, 5 분 이상 더 이상에 배양 기간을 제한합니다.
3.5 바늘 끝에 주사기를 연결하는 주사기의 끝을 잡고 오염 물질을 도입하지 마십시오. 급락의 수는 셀의 큰 덩어리의 유무에 의해 결정된다. 세포 사멸을 방지하기 위해 바늘 중단을 최소화합니다. 거품 형성을 피할 것. 니들 파쇄 표시 덩어리의 경우에는, 증가하는 대신에 절연 부 후속 콜라겐의 배양 시간을 연장트립신 또는 급락의 수가 배양 시간.
3.6 겔의 첨가 전에 완전히 상청액을 제거한다. 잔류하는 배지는 세포의 비율로 희석 수 겔 겔 중합에 영향을 미친다.
3.7 최대의 크기를 조절하거나 아래로 때 콜라겐 젤 성분의 농도를 유지한다. 재고 농도는 시약의 배치 또는 준비에 따라 달라질 수 있음을 유의하십시오.
3.11 즉 마이크로 웰은 배양 접시의 바닥에 남아 PDMS 보장하기 위해 페트리 접시가 건조되었는지 확인하고, PDMS의 마이크로 웰을 밀어 멸균 포셉 한 쌍을 사용합니다.
4.2 모든 biowires이 제자리에 있는지 확인합니다. 완전히 전기 자극 챔버 매체와 biowires 커버. 탄소 막대에 수직 모든 biowires를 정렬합니다.
4.3
4.4 매체의 변화에 ​​대한 전기 자극을 분리. 기존 매체의 상단 부분을 제거하고 신선한 매체를 추가 할 P1000을 사용합니다. biowires 항상 매체에서 침수되어 있는지 확인합니다.

표 1 : 프로토콜의 중요한 단계.

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Discussion

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이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다.

우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3Hz)을받은 바이 와이어에서 얻어진 성숙도가 높다는 것을 입증하는 것과 같이 전기 자극 요법에 의존한다는 것을 보여준다. biowires의 심근 세포는 20 일 (EBd20) 또는 40-44 일 (EBd44) 동안 재배 EBs에 비해 적은 자동 성과 높은 hERG 전류와 I K1 을 보여 주었다. EBd20 심근 세포는 biowires에 통합되기 전에 세포의 성질을 나타내는 반면, EBd44 심근 세포는 10 일 동안 배양되었다.onger에도 EB 형식 배양 시간 이상, 심근은 biowires에 전기 자극에 의해 유도되는 것과 동등한 특성 성숙에 도달 할 수 biowire 배양 시간보다 방송. 그러나 biowires를 통해 얻은 심근는 여전히 성인 심근만큼 성숙하지 않습니다.

기계적 자극 hPSC 여기서 CMS의 구조 단백질의 유도에 효과적인 것으로 제시되었다. 그러나 기계적인 자극은 전기 생리 성숙 (12)에 연결되지 않았다. 이것은 hPSC 심근 유래의 말단 분화를 유도하기 위하여, 순차적으로 또는 동시에, 전기 자극 및 기계공 응력을 결합 할 필요성을 제안 할 수있다. 생화학의 제공을 포함하는 다른 방법으로 전기 자극의 조합은 17 계수와 3 차원 셀 정렬은 더욱 효과적인 친 성숙 STRATE을 달성 할 수있을 것, 어떤 조직이 18생체 내 연구의 미래에 대한 GY.

여기서 사용 biowire 장치의 크기 5 mm이다 X X 0.3 mm (길이 x 폭 x 높이) 1mm하지만 이상 biowires 있도록 장치를 변경하는 것이 가능하다. 그러나 biowires의 높이 (겔 압축시 ~ 300 ㎛의 반경)는 0.3 mm로 제한 큰 조직에서 산소 공급의 제한이 주어진다. 두꺼운 조직의 생성이 제한을 극복하기 위해 관류 방법 19 필요할 것이다. 그럼에도 불구하고, 0.5 × 106 세포 / 와이어 길이 0.5 cm의 비율을 유지하는 것이 권장된다. 이상 biowires 들어 콜라겐 겔 중합이 오래 걸릴 수 있으며, 더 빈번한 매체 변화로 인해 세포의 증가 된 수에 필요할 수있다. 또한, 실크 봉합사를 사용하여 biowire의 현재 설정은 시드 심근 세포에 의해 생성 수축의 힘의 측정을 허용하지 않습니다. 그러나, 생분해 성 봉합사의 사용은 막 '수앞으로이 수를 전자.

여기에 설명 된 biowire을 위해 사용되는 세포 유형은 Hes2 세포주를 사용하여 20-hESC의 CM이다. 이 프로토콜은 또한 hiPSC 세포주 (예를 들면, CDI-MRB와 HR-I-2CR-2R) (14)를 사용할 수 있습니다. 다른 인간 줄기 세포의 cardiomyogenic 능력은 다를 수 있습니다,이 플랫폼에 대한 적합성을 실험적으로 결정되어야하며, 필요에 따라 조건을 최적화. (표 1 참조) 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.

또한, biowires는 6 웰 플레이트에 맞도록 설계되었고, 예는 여기에서 biowire의 결정을 보여 주었다. 그러나, 배양하는 것이 가능하고 또한 전기적으로 동시에 여러 biowires을 자극한다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

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References

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전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙
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Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).More

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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