Summary
Hjerte biowire plattformen er en in vitro metode som brukes til å modne humane embryonale og induserte pluripotent stamcelle-avledet kardiomyocytter (hPSC-CM) ved å kombinere tredimensjonale celledyrking med elektrisk stimulering. Dette manuskriptet presenterer detaljert oppsett av hjerte biowire plattformen.
Abstract
Humane pluripotente stamceller celleavledede kardiomyocytter (hPSC-CMS) har vært en lovende celle kilde, og har således oppmuntret til undersøkelse av deres potensielle anvendelser i hjerteundersøkelser, inkludert medisiner, sykdom modellering, regenerering av vev, og regenerativ medisin. Imidlertid celler som produseres av eksisterende protokoller viser et utvalg av umodenhet sammenlignet med native voksen ventrikulære kardiomyocytter. Mange forsøk har vært gjort for å modne hPSC-CMS, med bare moderat modning oppnådd så langt. Derfor, en konstruert system, kalt biowire, har blitt utviklet ved å gi både fysiske og elektriske signaler for å lede hPSC-CMs til en mer moden tilstand in vitro. Systemet benytter en mikrofabrikert plattform for å pode hPSC-CMs i kollagen type I gelere sammen en stiv mal sutur for å montere inn på linje hjertevev (biowire), som utsettes for elektrisk feltstimulering med en progressivt økende frekvens. Sammenlignet med stimulerte kontroller,stimulert biowired kardiomyocytter oppviser en forbedret grad av strukturell og elektrofysiologisk modning. Slike forandringer er avhengig av stimulering hastighet. Dette manuskriptet beskriver i detalj design og etablering av biowires.
Introduction
Cellbasert terapi er en av de mest lovende og undersøkte strategier for å oppnå hjertereparasjon / regenerering. Det har blitt hjulpet av hjertevevsteknikk og samlevering av biomaterialer 1 , 2 . De fleste tilgjengelige cellekilder har blitt studert i dyremodeller for deres potensielt gunstige effekter på skadede, syke eller eldre hjerter 3 . Spesielt er det gjort betydelige anstrengelser for å bruke hPSC-avledede kardiomyocytter (hPSC-CM), en potensielt ubegrenset autolog cellekilde for hjertevevsteknikk. HPSC-CM kan produseres ved hjelp av flere etablerte protokoller 4 , 5 , 6 . Imidlertid viser de oppnådde cellene føtalignende fenotyper, med et område av umodne egenskaper sammenlignet med voksne ventrikulære kardiomyocytter 7 , 8. Dette kan være et hinder for anvendelsen av hPSC-CMS som modeller for voksne hjertevevet i legemiddelforskning forskning og i utviklingen av voksne hjertesykdomsmodeller 9.
For å overvinne denne begrensningen av fenotypiske umodenhet, har nye tilnærminger vært aktivt undersøkt for å fremme cardiomyocyte modning. Tidlige studier viste effektive pro-modnings egenskaper i neonatalt rotte-kardiomyocytter via cyklisk mekanisk 10 eller elektrisk stimulering 11. Gel komprimering og cyklisk mekanisk stimulering, ble også vist seg å forbedre noen aspekter av hPSC-CM modning 12, 13, med minimal forbedring av de elektrofysiologiske og kalsiumhåndteringsegenskaper. Derfor, et plattformsystem som kalles "biologisk wire" (biowire) ble utviklet ved å tilveiebringe både strukturell signaler og elektrisk felt stimulation for å øke modningen av hPSC-CMs 14. Dette systemet bruker et mikrofabrikert plattform for å skape innrettet hjertevevet som er mottakelig for elektrisk feltstimulering. Dette kan brukes til å forbedre den strukturelle og elektrofysiologisk modenhet av hPSC-CMs. Her beskriver vi detaljene gjøre slike biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Design og Fabrication
MERK: Bruk myk litografi for enhetens fabrikasjon. Lag en tolags SU-8 master for polydimetylsiloksan (PDMS) støping.
- Design enheten ved hjelp av en design og utkast programvare ( Figur 1A , venstre). Tegn hvert lag av masteren separat. Skriv ut enhetens design på to fotomasker ved 20.000 dpi, tilsvarende de to lagene i master 15 . Sett enhetsmønsteret så gjennomsiktig og omgivelsene er like mørke; Maskerne vil fungere som mal for å optisk overføre anordningsmønsteret til SU-8 ved litografi (som beskrevet av andre 15 ).
- Dispense om 4 ml SU-8 50 på midten av en 4 tommers silisiumskive. Coat SU-8 50 jevnt på waferen ved hjelp av en spincoater ved å spinne på 2000 omdreininger per minutt (RPM) i 30 s. Bake waferen på en 95 ° C kokeplate i 10 minutter. Utsett waferen til ultrafiolett (UV) liGHT ved 200 mJ / cm2.
- Hell ca 4 ml av SU-8 2050 på midten av skiven og sentrifugering ved 2500 RPM i 30 sekunder. Bake på 95 ° C varmeplate i 15 minutter. Avkjøl til romtemperatur (RT).
- Gjenta trinn 1,3 to ganger.
- Dekk belagt skive med det første lags transparent fotomaske. Utsette skiven for UV-lys ved 270 mJ / cm 2 for å gjøre det første laget. Bake på 95 ° C varmeplate i 15 minutter.
- Gjør det andre lag av SU-8 2050 ved å gjenta trinn 1.3 to ganger.
- Juster det andre lags maske til funksjonene på det første lag ved bruk av en maske aligner. Deretter utsettes for UV-lys på 240 mJ / cm2. Bake ved 95 ° C i 15 min.
MERK: eksponeringstiden er bestemt av den nødvendige totale UV-dose og UV-lys utgangsintensiteten målt på dagen før bruk. - Utvikle wafer ved å nedsenke det i propylenglykol-monometyleteracetat (PGMEA) og risting ved 200 rpm i 30 minutter på en orbital-rystemaskin.
- Plassmaster i en petriskål og forsiktig helle den PDMS blanding (base til tverrbindingsmidlet på et forhold på 10: 1 i vekt) på midten av skiven. Dekk alle funksjonene og unngå luftbobler.
- Varme i en ovn ved 70 ° C i 2 timer. Bruke en skarp kniv for å skjære rundt kanten av PDMS biowire malen (figur 1A, til høyre). Skrell PDMS fra master. Trimme enheten med bladet. Sett PDMS biowire malen i en steriliseringspose og dampautoklav ved 121 ° C i 20 min.
- I en biosikkerhet kabinett (BSC), plassere PDMS biowire mal i en petriskål. Bruk pinsett for å holde og montere et stykke av steril kirurgisk silkesutur (6-0) i midten av kanalen av PDMS mikro ved sitte det i sporene på begge sider av kanalen (figur 1B-I).
2. Etableringen av elektrisk stimulering kammer
- Danne et par av rektangulære stykker polykarbonat (lengde x bredde x Tykkelse: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) og bruke dem som rammen av den elektriske stimulering kammeret (figur 2).
- Boring av to 3 mm brede hull 2 cm fra hverandre langs senterlinjen til hver polykarbonat rammestykket.
- Skjær to stykker på 1,5 cm lange karbonstaver. Bor et 1 mm bred hull gjennom karbon stang omtrent 3 mm fra enden. Træ en platinatråd gjennom karbon stang hullet og stramme vaie ved å vikle den rundt karbontråden. Feste en klemme til den andre enden av platinatråd for senere forbindelse med den elektrisk stimulator.
- Sett karbonstengene inn i polykarbonat karmstykker. Plasser den sammenstilte ramme med karbonstaver ned i en brønn av en seks-brønns plate.
- Hell 2 ml av PDMS inn i brønnen. Senke bunnen av polykarbonat rammer i PDMS samtidig som PDMS overflatenivået i nærheten av den som ikke når bunnen av karbonstaver. Varme i en ovn ved 70 ° C i 2 timer.
- Ta den elektriske stimulering kammeret ut av seks-godt platen og sette det i en steriliseringspose for dampsterilisering ved 121 ° C i 20 min.
3. Enzymatisk Dissosiasjon av hPSC-CMS
- Fremkall hPSC til å differensiere til kardiomyocytter ved anvendelse av en etablert protokoll 4.
NB: I korthet generere kardiomyocytter via etablert embryoid legeme (EB) protokoller i stammen pro medium gjennom sekvensiell tilskudd av benmorfogenetisk 4, basisk fibroblast vekstfaktor, aktivin A, vaskulær endotelial vekstfaktor, og Dickkopf homolog 1 4. Bruk EBS fra dag 20-34 av differensiering for å gjøre biowires. - Samle EBS fra lavtrykk festeplaten med en P1,000 pipettespiss og overføre til et konisk rør. Pellet ved sentrifugering i 5 min ved 125 x g og RT. Kast supernatanten og resuspender pelleten med forvarmet, 37 ° C kollagenase type I inneholdende 1% deoksyribonuklease I (DNAse I). Inkuber ved 37 ° C i 2 timerfor fordøyelsen.
- Tilsett 5 ml av forvarmet, 37 ° C vask medium og sentrifuger i 5 minutter ved 125 x g og RT. Kast supernatanten. Resuspender pellet med 2 ml trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløsning og inkubere ved 37 ° C i 5 min.
- Tilsett 1 ml stopp medium inneholdende 3% (v / v) DNase I.
- Fest en 20 G (0,9 mm) nål til en 5 ml sprøyte og passere EB suspensjonen gjennom den 3-5 ganger.
- Legg 7 ml vaskemedium og sentrifuger ved 280 xg i 5 minutter. Kast supernatanten. Resuspender pellet i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) og lagres på is. Bestem celle nummer med en hemocytometer. Ta 0,5 x 10 6 celler og pellet ved sentrifugering ved 280 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten.
- Pre-kule alle gelbestanddelene på is før blanding av dem i et sterilt rør. Bland de følgende kollagengel komponenter (sluttkonsentrasjon): 2,1 mg / ml rottehale kollagen type I, 24,9 mM glukose, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH og 10 mM HEPES, og 10% ekstracellulær matriks i 1x M199 medium. Legg kollagen og ekstracellulære matrise sist. Bland ved å pipettere opp og ned.
- Suspender 0,5 x 10 6 celler med 3,5 mL av kollagengel og bland godt.
- Bruk en P10 pipettespiss å tilsette 4 ul av cellesuspensjonen til 0,5 cm lange kanal (figur 1B-II). Justere plasseringen av suturen med sterile pinsetter om nødvendig.
- Dekke bunnen av Petri-skålen med steril fosfatbufret saltløsning (PBS), å sørge for ikke å berøre gelen. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
- Erstatte PBS med 12 ml kulturmedium (for eksempel stamme pro eller medium anbefalt av produsenten cellen), nok til å dekke de celler (figur 1 B-III). Kultur i en inkubator ved 37 ° C i 1 uke. Endre medium annenhver dag.
4. elektrisk stimulering for Biowire Dyrking
- IBSC, tilsett 2 ml PBS til hver brønn av en seks-brønns plate som skal huse en elektrisk stimulator kammer. Bruk sterile pinsetter for å plassere forsiktig det autoklaverte elektrisk stimulering innretning inn i brønnen. Kast PBS fra brønnen.
- Dekk karbonstaver med 5 ml forvarmet kulturmedium. Bruk sterile pinsetter for å montere biowires i den elektriske stimulering kammeret og orientere dem vinkelrett på karbonstaver (figur 2).
- Plassere lokket på toppen av den seks-brønns plate, men lar tilstrekkelige platinatråder som når utenfor platen for å få kontakt med den elektrisk stimulator. Plasser en seks-brønners plate i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og koble platinatråd til den elektrisk stimulator.
- Stimulere biowires ved hjelp av en elektrisk stimulator med følgende innstilling: bifasisk repeterende puls, 1-ms pulsvarighet på 3 V / cm, og en puls per sekund (PPS). Hev PPS hver 24. time til følgende verdier: 1,83, 2,66, 3,49, 4.82, 5,15 og 6. Bytt mediet annenhver dag.
- Følg kardiomyocytkontraktiliteten som svar på elektrisk stimulering under et mikroskop ved 10X forstørrelse.
MERK: Etter en uke med stimulering blir biorene modne (se resultatavsnittet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den rasjonelle for bruk av en sutur i biowires er å tjene som et templat for dannelsen av 3D-konstrukter som tilpasses i en akse og som etterligner formen av hjerte fibre. Vi viser at etter syv dagers dyrking i biowire, celler ombygd gelen rundt suturen (figur 3A). Cellene montert langs aksen av suturen for å danne innrettet kardialt vev (figur 3). Etter 7 dager forkultur ble biowires kastet 7 dager etter elektrisk feltstimulering og videre oppviste egenskaper som er kompatible med strukturell og funksjonell modning av kardiomyocytter.
Humant PSC-CMs i biowires oppviste sterk ekspresjon av hjerte kontraktile proteiner, sarcomeric α-aktinin, og aktin (figur 4A). Vi har observert sarcomeric banding av den hPSC-CM kontraktile apparat og innretting av myofibrilar strikturerlangs aksen av suturen. Dette er kvalitativt lik strukturen i voksent hjerte (figur 4A). Sekund, sammenlignet med de av EBS, disse biowired hESC-CMs vises lavere priser proliferasjon (figur 4B). For det tredje, biowired hESC-CMs vist forbedret kalsiumhåndteringsegenskaper (figur 5) og cardiomyocyte elektro modning (figur 6). I de modne cardiomyocytes, behandling med koffein induserer en brå frigjøring av Ca2 + fra det sarkoplasmatiske retikulum 8. Slike Ca2 + transienter ble funnet i elektrisk stimulert hESC-CMs, men ikke i celler fra ikke-stimulerte kontroller (Figur 5A-C). Responsen til koffein i de elektrisk stimulerte celler, sammenlignet med ikke-stimulerte kontroller, viste en vesentlig høyere amplitude av intensitet i et stimulering frekvensavhengig måte (figur 5D og E). Samtidig hPSC-CMSi biowires viste bedre hERG strøm og innover likeretter strømmen (I K1) tetthet, noe som ble ytterligere forsterket ved elektrisk stimulering (figur 6A og B). Slike forbedringer i I k1 strøm er i samsvar med en induksjon på kalium innover he-kanal-gen (KCNJ2) proteinekspresjon i de biowires (figur 6C).
En annen viktig parameter med hensyn modning er evnen til kardiomyocytter slå spontant, også kjent som automatikk, som er et tegn på umodenhet i arbeids kardiomyocytter (atrial og ventrikulær) 16. Graden av automatikk var signifikant høyere i EB-avledede kardiomyocytter sammenlignet med kontroll biowires (figur 6D), som var sammenlignbar med den for biowires utsatt for den 6-Hz diett.
TaN sammen viser disse resultatene at kultur i biowire med elektrisk stimulering fremmet den strukturelle og elektrofysiologiske modning av hPSC-CMs 14 .
Figur 1: Biowire Culture Platform. ( A ) Skjematisk (venstre) og faktisk (høyre) PDMS-mold av biowire. Skalbjelke = 2 mm. ( B ) For å sette opp biowire, ble en sutur montert sentralt i kanalen (I). En hESC-CM-suspensjon i kollagen type I-gel ble sådd rundt suturen i kanalen (II) og inkubert i medium (III). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: DenBiowire ble dyrket i elektrisk stimulering Chamber under den andre uken av dyrking. Den biowire ble plassert vinkelrett i forhold til de karbonelektroder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Celleremodeling og Gel konvensjon rundt suturen etter 7 dagers av Forkultur i Biowire. (A) Lysfelt bilder av hESC-CMs på angitte dager forkultur i den biowire malen. Skala bar = 200 um. (B) Kvantifisering av gel sammenpressing på de angitte dagene av kultur (gjennomsnitt ± SD). (C) hematoxylin og eosin (H & E) og Massons Trichrome (MT) farging av biowire seksjoner (dobbeltpilene representerer sutur-aksen). Scale BAR = 100 μm. Denne figuren er endret fra referanse 14 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fysiologi av kardiomyocytter dyrket i Biowire-plattformen. ( A ) Representative konfokale bilder av ikke-stimulerte (kontroll) og elektrisk stimulerte biowires (3 Hz og 6 Hz regimer) som viser kardiomyocyt-justering og hyppige Z-disker (de dobbelthøyde pilene representerer suturaksen). Grønn, a-aktinin; Rød, actin. Skalbjelke = 20 μm. ( B ) Kardiomyocytproliferasjon i biowires var lavere enn i EBs. Spredning ble vurdert ved dobbeltfarging for sarkomert a-actinin og Ki67 ( n = 3-4 per tilstand, gjennomsnittlig ±; sd). *, **, # og og representerer statistisk signifikante forskjeller i forhold til EBd34 (Student t-test). Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: elektrisk stimulering sponsede Forbedringer i Ca 2+ håndteringsegenskaper. (AC) Representative spor av Ca2 + frigivelse i respons til koffein i ikke-stimulerte kontrollceller (A) og celler som underkastes 3-Hz regimet (B) og 6 Hz regime (C). (D) Koffein-indusert endring av topp fluorescensintensitet hos eksperimentelle grupper (gjennomsnitt ± sem etter normalisering av fluoresenstopp jegntensity før administrasjon av koffein; kontroll versus 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; kontroll versus 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz versus 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (kontroll), n = 6 (3 Hz), og n = 9 (6 Hz) (Students t-test). (E) Representative fluorescerende opptak av Ca 2 + transienter før og etter administrering av koffein på 5 mM (pil) i celler utsatt for den 6 Hz diett. Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Elektrisk pacing Forbedrer elektrofysiologiske egenskaper og automatikk. Electrophysiological egenskaper i enkelt kardiomyocytter isolert fra biowires eller embryoidlegemer (EBS) ble registrert med en patch clamp. (A) hERG-hale strømtetthet. (B) I K1 strømtetthet målt ved -100 mV. (C) Oppregulering av kalium innad likeretting kanal gen (KCNJ2). (D) -forhold på celler som oppviser spontan pisking (automatikk) eller ingen spontan pisking (ingen automatikk). Dataene i AD representerer gjennomsnittet ± SEM Forskjellen mellom de eksperimentelle grupper ble analysert ved Students t-test, chi-kvadrattest, og ANOVA (pairwise multiple sammenligninger, Holm-Sidak metode). Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protokoll steg # | kritiske Steps | ||||
| 2.4 | Plasser karbonstaver 1 - 2 cm fra hverandre, eller i minst mulig avstand for å unngå høy-energi stimulering og celledød. | ||||
| 2.6 | Test forbindelsene mellom platinatråd og karbon når stimuleringen kammer er laget for første gang. Knytte stimulering kammeret til elektrisk stimulator og deretter sette en ønsket spenning. Plasser en volts bly på hver av de to karbonstaver. Utgangsspenningen fra den stimulering kammeret bør være den samme spenning avleses på voltmeteret. Feilmålinger indikerer mulig belegg av platinatråd med PDMS eller en annen defekt forbindelse i systemet. | ||||
| 3.1 | Enkeltceller ble brukt til frø på biowire. For dissosiasjon, det inkubering, blen gang med kollagenase er kritisk og bør bestemmes ved en alder av cellene og differensieringen protokollen (EBS versus monolag). Ved denne protokollen blir en inkubasjonstid på 2 timer anbefales for dag 21 EBS og 30 min for monolag. For celler i andre aldersgrupper, kan collagenase fordøyelsen tid trenger optimalisering ved å overvåke celle levedyktighet og kontraktile funksjon etter fordøyelsen. | ||||
| 3.3 | Trypsin kan skade cellene; således begrense inkubering varighet til ikke mer enn 5 min. | ||||
| 3,5 | Unngå at det innføres forurensninger ved å bare holde enden av sprøyten for å feste sprøyten til nålespissen. Antallet stuper bestemmes ved fravær av store klumper av celler. Minimer nål avbrudd for å unngå celledød. Unngå bobledannelse. Ved synlige klumper etter nål avbrudd, forlenge inkubasjonstiden i kollagenase i etterfølgende isoleringer stedet for å økeinkubasjonstid i trypsin eller antall stuper. | ||||
| 3.6 | Fjern supernatanten fullstendig før tilsetningen av gelen. Gjenværende medium kan fortynne forholdet mellom celle: gel og påvirke gel-polymerisasjon. | ||||
| 3.7 | Opprettholde konsentrasjonene av de kollagen gelbestanddelene ved skalering opp eller ned. Husk at konstrasjoner kan variere i henhold til satsen eller fremstillingen av reagensene. | ||||
| 3,11 | For å sikre at PDMS mikro bo på bunnen av petriskål, sørg for at petriskål er tørr og bruke et par steril tang å presse PDMS mikro ned. | ||||
| 4.2 | Sørg for at alle biowires er på plass. Dekk biowires helt med medium i den elektriske stimulering kammeret. Arrangere alle biowires vinkelrett på karbonstaver. | ||||
| 4.3 | <td colspan = "5"> unngå skade på platinatråden ved å dekke lokket forsiktig. Bruk tape til å feste lokket ordentlig på tallerkenen i tilfelle lokket ikke lukkes helt. Ved lukking inkubator dører, plasserer den tynnere del av ledningene fra den elektrisk stimulator på døren Lukkepunktene for å sikre riktig tetting av inkubatoren.|||||
| 4.4 | Frakoble den elektriske stimulator for mediumskift. Bruk en P1000 for å fjerne bare den øverste delen av det gamle mediet og deretter legge friskt medium. Pass på at biowires alltid senkes under middels. | ||||
Tabell 1: Kritiske trinn i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver oppsett og gjennomføring av konstruert plattform, biowire, for å forbedre modning av hPSC-CMS. Anordningen kan fremstilles i standard microfabrication anlegg, og biowires kan fremstilles med vanlige celledyrkningsteknikker og en elektrisk stimulator.
Så vidt vi vet, er det ingen rapporterte metode lik biowires. Denne strategien viser at forbedrede modnings egenskaper var avhengig av den elektriske stimulering regime, som vist ved den større modningsnivå man vil ha i biowires utsatt for den høyere hastighet stimulering ramp-up diett (6 Hz versus 3 Hz). Kardiomyocytter i biowires viste mindre automatikk og høyere hERG-strøm, og jeg k1 forhold til EBS dyrket i 20 dager (EBd20) eller for 40-44 dager (EBd44). EBd20 kardiomyocytter representert celleegenskapene, før deres inkorporering i biowires, mens EBd44 kardiomyocytter ble dyrket 10 dager longer enn den biowire dyrkningstiden og viser at selv med lengre tid i kultur i EB-format, kan kardiomyocytter ikke nå tilsvar kjønnsmodning egenskaper som de som fremkalles ved elektrisk stimulering i biowires. Men cardiomyocytes innhentet via biowires er fortsatt ikke så moden som voksen cardiomyocytes.
Mekanisk stimulering har vært foreslått å være effektiv ved indusering av strukturelle proteiner av hPSC-CMs. Men gjorde mekanisk stimulering ikke føre til elektro modning 12. Dette kan indikere behovet for å kombinere elektrisk stimulering og mekanisk stress, sekvensielt eller samtidig, for å indusere terminal differensiering i hPSC-avledede kardiomyocytter. Kombinasjonen av elektrisk stimulering med andre metoder, herunder levering av biokjemiske faktorer 17 og celle innretting i 3D vevene 18, kan være i stand til å oppnå en mer effektiv pro-modning streregy for fremtiden in vivo studier.
Dimensjonene på biowire anordningen som brukes her er 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (lengde x bredde x høyde), men det er mulig å modifisere anordningen for å lage lengre biowires. Imidlertid er høyden på biowires begrenset til 0,3 mm (med en radius på ~ 300 nm på gel komprimering), gitt begrensningene i oksygentilførsel i større vev. For å overvinne denne begrensning ved å generere tykkere vev, ville en perfusjon fremgangsmåte kreves 19. Likevel anbefales det å opprettholde forholdet mellom 0,5 x 10 6 celler / 0,5 cm av en tråd i lengde. For lengre biowires, kan kollagengel polymerisering ta lengre tid, og hyppigere mediumskift kan være nødvendig på grunn av økt antall celler. Dessuten gjør den nåværende oppsettet av biowire ved hjelp av silkesutur ikke tillater måling av kontraksjonskraft som genereres av de podede kardiomyocytter. Imidlertid kan bruken av et bionedbrytbart sutur make dette mulig i fremtiden.
Den celletype som brukes til å lage den biowire som er beskrevet her er hESC-CM ved bruk av Hes2 cellelinje 20. Protokollen kan også bruke hiPSC cellelinjer (f.eks CDI-MRB og HR-I-2CR-2R) 14. Den cardiomyogenic Evnen til forskjellige humane stamcellelinjer kan være annerledes, og egnethet for denne plattformen må bestemmes eksperimentelt, og forholdene optimalisert etter behov. Det er flere viktige trinnene i protokollen (se tabell 1).
Dessuten ble biowires utformet for å passe inn i en 6-brønners plate, og den her viste eksempel ved fremstilling av en biowire. Det er imidlertid mulig å kultur og elektrisk stimulere multiple biowires samtidig i en brønn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend-i-aid fra hjertet og Stroke Foundation of Canada (G-14-0006265), driftstilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (137352 og 143066) og JP Bickell fundament stipend (1013821 ) til SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
