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Developmental Biology

La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

doi: 10.3791/55373 Published: May 6, 2017

Summary

La plataforma biowire cardiaca es un método in vitro utilizado para madurar embrionario humano y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (HPSC-CM) combinando el cultivo de células en tres dimensiones con la estimulación eléctrica. Este manuscrito presenta la configuración detallada de la plataforma biowire cardíaco.

Abstract

Los cardiomocitos derivados de células madre pluripotenciales humanas (hPSC-CMs) han sido una fuente prometedora de células y por lo tanto han fomentado la investigación de sus aplicaciones potenciales en la investigación cardíaca, incluyendo el descubrimiento de fármacos, modelación de enfermedades, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Sin embargo, las células producidas por los protocolos existentes muestran un rango de inmadurez en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos nativos. Se han hecho muchos esfuerzos para madurar hPSC-CMs, con sólo maduración moderada alcanzada hasta el momento. Por lo tanto, se ha ideado un sistema de ingeniería, llamado biowire, proporcionando señales tanto físicas como eléctricas para conducir los hPSC-CM a un estado más maduro in vitro . El sistema utiliza una plataforma microfabricada para sembrar hPSC-CMs en gel de colágeno tipo I a lo largo de una sutura moldeada rígida para ensamblar en tejido cardiaco alineado (biowire), que es sometido a estimulación de campo eléctrico con una frecuencia progresivamente creciente. En comparación con los controles no estimulados,estimularon biowired cardiomiocitos exhiben un grado mejorado de maduración estructural y electrofisiológico. Tales cambios son dependientes de la velocidad de estimulación. Este manuscrito describe en detalle el diseño y creación de biowires.

Introduction

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terapia basada en células es una de las estrategias más prometedoras e investigados para lograr la reparación cardíaca / regeneración. Se ha ayudado por la ingeniería de tejidos cardíaco y el co-suministro de biomateriales 1, 2. La mayoría de las fuentes de células disponibles se han estudiado en modelos animales por sus efectos potencialmente beneficiosos sobre dañadas o envejecidas corazones enfermos 3. En particular, se han hecho esfuerzos significativos para utilizar células madre pluripotentes humana (HPSC) derivada de los cardiomiocitos (HPSC-CM), una fuente de células autólogas potencialmente ilimitado para la ingeniería de tejido cardíaco. HPSC-CM puede producirse usando varios protocolos establecidos 4, 5, 6. Sin embargo, las células obtenidas muestran fenotipos fetales similar, con una gama de características inmaduras en comparación con los cardiomiocitos ventriculares adultos 7, 8. Esto puede ser un obstáculo para la aplicación de HPSC-CM como modelos de tejido cardiaco de adultos en la investigación y el descubrimiento de fármacos en el desarrollo de modelos de enfermedades cardiacas adultas 9.

Con el fin de superar esta limitación de inmadurez fenotípica, nuevos enfoques se han investigado activamente para promover la maduración de los cardiomiocitos. Los primeros estudios revelaron propiedades pro-maduración eficaces en cardiomiocitos de rata neonatal a través cíclico mecánico 10 o la estimulación eléctrica 11. Compactación Gel y la estimulación mecánica cíclica también se mostró a mejorar algunos aspectos de la maduración HPSC-CM 12, 13, con la mejora mínima de las propiedades de manipulación electrofisiológicos y de calcio. Por lo tanto, un sistema de plataforma llamada "alambre biológica" (biowire) fue ideado por proporcionar ambas claves estructurales y estimulación del campo eléctricon para mejorar la maduración de HPSC-CM 14. Este sistema utiliza una plataforma microfabricado para crear tejido cardíaco alineados que es susceptible a la estimulación de campo eléctrico. Esto se puede utilizar para mejorar la madurez estructural y electrofisiológica de HPSC-CM. A continuación, describimos los detalles de fabricación de tales biowires.

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Protocol

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1. Diseño principal y Fabricación

NOTA: El uso de litografía blanda para la fabricación del dispositivo. Hacer una de dos capas SU-8 maestro para polidimetilsiloxano de moldeo (PDMS).

  1. Diseñar el dispositivo mediante un diseño y elaboración de software (Figura 1A, izquierda). Dibuje cada capa del maestro por separado. Imprimir el diseño del dispositivo en dos fotomáscaras en 20.000 dpi, correspondiente a las dos capas del maestro 15. Ajuste el modelo dispositivo como transparente y sus alrededores como oscuro; las máscaras servirán como plantilla para transferir ópticamente el patrón dispositivo sobre SU-8 mediante litografía (como se describe por otros 15).
  2. Dispense aproximadamente 4 ml de SU-8 50 sobre el centro de una oblea de silicio de 4 pulgadas. Escudo la SU-8 50 uniformemente sobre la oblea usando un revestidor de giro haciendo girar a 2.000 revoluciones por minuto (RPM) durante 30 s. Hornear la oblea en un 95 ° C placa de cocción durante 10 min. Exponer la oblea a los rayos ultravioleta li (UV)lucha a 200 mJ / cm2.
  3. Verter sobre 4 ml de SU-8 2050 en el centro de la oblea y centrifugado a 2500 rpm durante 30 s. Hornear en el 95 ° C placa de cocción durante 15 min. Enfriar a temperatura ambiente (TA).
  4. Repita el paso 1.3 dos veces más.
  5. Cubrir la oblea recubierta con la fotomáscara transparencia de primera capa. Exponer la oblea a la luz UV a 270 mJ / cm 2 para hacer que la primera capa. Hornear en el 95 ° C placa de cocción durante 15 min.
  6. Hacer la segunda capa de SU-8 2050 repitiendo el paso 1.3 dos veces.
  7. Alinear la máscara de segunda capa a las características de la primera capa utilizando un alineador de máscara. A continuación, se exponen a la luz UV a 240 mJ / cm2. Hornear a 95 ° C durante 15 min.
    NOTA: El tiempo de exposición se determina por la dosis de UV total requerida y la intensidad de salida de luz UV medido en el día antes de su uso.
  8. Desarrollar la oblea sumergiéndolo en acetato de propilenglicol monometil éter (PGMEA) y agitación a 200 rpm durante 30 min en un agitador orbital.
  9. Lugarel maestro en una placa de Petri y cuidadosamente vierte la mezcla (base de agente de reticulación en una proporción de 10: 1 en peso) PDMS en el centro de la oblea. Cubrir todas las características y evitar burbujas de aire.
  10. El calor en un horno a 70 ° C durante 2 h. Utilice una cuchilla afilada para cortar alrededor del borde de la plantilla biowire PDMS (Figura 1A, derecha). Pelar el PDMS del maestro. Recorte el dispositivo con la hoja. Ponga la plantilla biowire PDMS en una bolsa de esterilización y vapor de agua en autoclave a 121 ° C durante 20 min.
  11. En una cabina de bioseguridad (BSC), colocar el PDMS biowire plantilla en una placa de Petri. Use pinzas para sostener y montar una pieza de sutura estéril quirúrgico de seda (6-0) en el centro del canal de los pocillos PDMS por asientos en las ranuras en ambos extremos del canal (Figura 1B-I).

2. Creación de la Cámara de estimulación eléctrica

  1. Hacer un par de piezas de policarbonato rectangulares (longitud x anchura x grosor: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) y utilizarlos como el bastidor de la cámara de estimulación eléctrica (Figura 2).
  2. Perforar dos 3 mm de ancho agujeros 2 cm de distancia a lo largo de la línea central de cada pieza de soporte de policarbonato.
  3. Cortar dos piezas de 1,5 cm varillas larga de carbono. Perforar un agujero de 1 mm de ancho a través de la varilla de carbono de aproximadamente 3 mm del extremo. Pase un alambre de platino a través del agujero de la varilla de carbono y apriete el cable envolviéndolo alrededor de la varilla de carbono. Adjuntar un clip al otro extremo del alambre de platino para la conexión posterior con el estimulador eléctrico.
  4. Introduzca las varillas de carbono en las piezas del marco de policarbonato. Coloque el marco ensamblada con las varillas de carbono en un pocillo de una placa de seis pocillos.
  5. Verter 2 ml de PDMS en el pozo. Sumergir la parte inferior de los marcos de policarbonato en PDMS mientras se mantiene el nivel de la superficie PDMS cerca pero no llegar a la parte inferior de las varillas de carbono. El calor en un horno a 70 ° C durante 2 h.
  6. Tomar la cámara de la estimulación eléctrica de los seisplaca -bien y puso en una bolsa de esterilización para esterilización con vapor a 121 ° C durante 20 min.

3. enzimática La disociación de HPSC-CM

  1. Inducir HPSC de diferenciarse en cardiomiocitos utilizando un protocolo establecido 4.
    NOTA: En pocas palabras, generar cardiomiocitos a través de cuerpo embrioide establecido protocolos (EB) en el tallo pro medio a través de la suplementación secuencial con proteína morfogenética ósea 4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular, y Dickkopf homólogo 1 4. Utilice EBS desde el día 20-34 de diferenciación para hacer biowires.
  2. Recoge los EBs de la placa de bajo adjunto con una punta de pipeta P1,000 y transferir a un tubo cónico. Se precipitan por centrifugación durante 5 min a 125 xg y RT. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con pre-calentado, 37 ° C colagenasa de tipo I que contiene 1% desoxirribonucleasa I (ADNasa I). Incubar a 37 ° C durante 2 hpara la digestión.
  3. Añadir 5 ml de pre-calentado, 37 ° C el medio de lavado y centrifugar durante 5 min a 125 xg y RT. Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 ml de solución de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
  4. Añadir 1 ml de medio de parada que contiene 3% (v / v) DNasa I.
  5. Adjuntar una aguja 20 G (0,9 mm) a una jeringa de 5 ml y pasar la suspensión a través de él EB 3-5 veces.
  6. Añadir 7 ml de medio de lavado y centrifugar a 280 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en un medio (IMDM) de Dulbecco modificado por Iscove y almacenar en hielo. Determinar el número de células con un hemocitómetro. Tomar 0,5 x 10 6 células y sedimento por centrifugación a 280 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
  7. Pre-fresco todos los componentes del gel en hielo antes de mezclarlos en un tubo estéril. Mezclar los siguientes componentes del gel de colágeno (concentración final): 2,1 mg ml / tipo de colágeno de cola de rata I, glucosa 24,9 mM, NaH 23,8 mMCO 3, NaOH mM 14,3, HEPES 10 mM, y 10% de matriz extracelular en medio 1x M199. Añadir el colágeno y matriz extracelular pasado. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
  8. Resuspender 0,5 x 10 6 células con 3,5 l de gel de colágeno y mezclar bien.
  9. Utilice una punta de pipeta P10 añadir 4 l de la suspensión celular en el 0,5 cm de longitud de canal (Figura 1B-II). Ajustar la posición de la sutura con pinzas estériles si es necesario.
  10. Cubrir el fondo de la placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), asegurándose de no tocar el gel. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  11. Sustituir el PBS con 12 ml de medio de cultivo (por ejemplo, tallo pro o medio recomendado por el fabricante de células), lo suficiente para cubrir las células (Figura 1B-III). Cultura en una incubadora a 37 ° C durante 1 semana. Cambiar el medio cada dos días.

4. Estimulación eléctrica para Biowire Cultivo

  1. Enel BSC, añadir 2 ml de PBS a cada pocillo de una placa de seis pocillos que albergará una cámara de estimulador eléctrico. Use pinzas estériles para colocar suavemente el dispositivo de estimulación eléctrica en autoclave en el pozo. Desechar el PBS del pozo.
  2. Cubrir las varillas de carbono con 5 ml de medio de cultivo pre-calentado. Use pinzas estériles para montar los biowires en la cámara de estimulación eléctrica y orientarlos perpendicular a las varillas de carbono (Figura 2).
  3. Coloque la tapa en la parte superior de la placa de seis pocillos, pero dejar suficientes hilos de platino que llegan fuera de la placa para conectar con el estimulador eléctrico. Colocar la placa de seis pocillos en un incubador de cultivo celular a 37 ° C y conectar el alambre de platino al estimulador eléctrico.
  4. Estimular el biowires usando un estimulador eléctrico con la siguiente configuración: pulso repitiendo bifásica, duración del pulso de 1 ms, 3 V / cm, y 1 pulso por segundo (PPS). Elevar el PPS cada 24 h para los siguientes valores: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, y 6. Cambiar el medio cada dos días.
  5. Observe la contractilidad de los cardiomiocitos en respuesta a la estimulación eléctrica bajo un microscopio a un aumento de 10X.
    NOTA: Después de una semana de la estimulación, las biowires llega a la madurez (véase la sección de resultados).

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Representative Results

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El racional para el uso de una sutura en las biowires es servir como una plantilla para la formación de constructos 3D que se alinean en un eje y imitan la forma de fibras cardíacas. Se demuestra que después de siete días de cultivo en el biowire, las células remodelado el gel alrededor de la sutura (Figura 3A). Las células montadas a lo largo del eje de la sutura para formar alineados tejido cardíaco (Figura 3). Después de 7 días de precultivo, las biowires fueron sometidos a 7 días de estimulación del campo eléctrico y propiedades exhibidas más compatibles con la maduración estructural y funcional de los cardiomiocitos.

Human PSC-CMs en biowires mostraron una fuerte expresión de las proteínas contráctiles cardiacas, sarcoméricas α-actinina, y actina (Figura 4A). Hemos observado bandas sarcoméricas del aparato contráctil HPSC-CM y la alineación de las restricciones miofibrilaresa lo largo del eje de la sutura. Esto es cualitativamente similar a la estructura en el corazón adulto (Figura 4A). En segundo lugar, en comparación con los de EBs, estos biowired hESC-CM muestra las tasas de proliferación inferiores (Figura 4B). En tercer lugar, la biowired hESC-CM exhibió mejoró las propiedades de manipulación de calcio (Figura 5) y la maduración de los cardiomiocitos electrofisiología (Figura 6). En cardiomiocitos maduros, el tratamiento con cafeína induce una liberación brusca de Ca2 + desde el retículo sarcoplásmico 8. Tales Ca 2 + transitorios se encontraron en estimulado eléctricamente hESC-CM, pero no en las células de los controles no estimulados (Figura 5A-C). La respuesta a la cafeína en las células estimuladas eléctricamente, en comparación con los controles no estimulados, reveló una amplitud significativamente mayor de la intensidad de una manera dependiente de la frecuencia de estimulación (Figura 5D y E). Mientras tanto, HPSC-CMen biowires mostraron mejorado actual y hacia el interior rectificador de corriente (I K1) densidades hERG, que se mejoró aún más por la estimulación eléctrica (Figura 6A y B). Tales mejoras en la corriente k1 I están de acuerdo con una inducción en potasio dentro rectificación de la expresión del gen del canal de proteínas (KCNJ2) en los biowires (Figura 6C).

Otro parámetro importante con respecto a la maduración es la capacidad de los cardiomiocitos de superar de forma espontánea, también conocida como la automaticidad, que es un signo de inmadurez en trabajar cardiomiocitos (auricular y ventricular) 16. Automaticity fue significativamente mayor en los cardiomiocitos derivados de EB en comparación con biowires control (Figura 6D), lo cual era comparable a la de biowires sometidas al régimen de 6 Hz.

Tomarn juntos, estos resultados indican que la cultura en biowire con la estimulación eléctrica promueve la maduración estructural y electrofisiológica de HPSC-CM 14.

Figura 1
Figura 1: Biowire Cultura plataforma. (A) Representación esquemática (izquierda) y real (derecha) del molde de PDMS biowire. Barra de escala = 2 mm. (B) Para configurar el biowire, una sutura se montó centralmente en el canal (I). Una suspensión hESC-CM en gel de colágeno de tipo I se sembró alrededor de la sutura en el canal (II) y se incubaron en medio (III). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: LaBiowire se cultivó en la Cámara de estimulación eléctrica durante la segunda semana de cultivo. El biowire se colocó perpendicular a los electrodos de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Remodelación de la célula y Gel Contratante alrededor de la sutura después de 7 días de precultivo en Biowire. (A) Imágenes de campo claro de hESC-CM en los días indicados de precultivo en la plantilla biowire. Barra de escala = 200 m. (B) Cuantificación de la compactación en gel en los días indicados de cultivo (media ± SD). (C) con hematoxilina y eosina (H & E) y Masson de tricromo (MT) tinción de secciones biowire (las flechas de doble cabeza representan el eje de sutura). incrustaciones de Bar = 100 m. Esta figura se ha modificado de la referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Fisiología de cultivos de cardiomiocitos en la Plataforma Biowire. (A) Imágenes confocales representativos de no estimulado (control) y biowires estimulados eléctricamente (3 Hz y 6 regímenes Hz) que muestra la alineación de los cardiomiocitos y Z-discos frecuentes (las flechas de doble cabeza representan el eje de sutura). Green, α-actinina; rojo, actina. Barra de escala = 20 m. (B) la proliferación de los cardiomiocitos en los biowires fue menor que en los EBs. La proliferación se evaluó mediante doble tinción para sarcoméricas α-actinina y Ki67 (n = 3-4 por condición, ± promedio; Dakota del Sur). *, **, # y Y representan diferencias estadísticamente significativas en comparación con EBd34 (prueba t de Student). Esta figura se ha modificado de la referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Estimulación eléctrica Mejoras Promoted en Ca 2+ Manejo de Propiedades. (AC) rastros representativos de liberación de Ca2 + en respuesta a la cafeína en las células no estimuladas de control (A) y las células sometidas al régimen de 3-Hz (B) y el régimen de 6 Hz (C). (D) el cambio inducido por cafeína de la intensidad de pico de fluorescencia entre los grupos experimentales (media ± SEM después de la normalización de la fluorescencia pico intensity antes de la administración de cafeína; control versus 3 Hz, P = 1,1 x 10 - 6; control versus 6 Hz, P = 2,1 x 10 - 7; 3 Hz versus 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (control), n = 6 (3 Hz), y n = 9 (6 Hz) (prueba t de Student). (E) de grabación fluorescente Representante de Ca 2 + transitorios antes y después de la administración de cafeína en 5 mM (flecha) en células sometidas al régimen de 6 Hz. Esta figura se ha modificado de la referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Estimulación eléctrica mejora las propiedades electrofisiológicas y automaticidad. Electrophysiologpropiedades iCal en cardiomiocitos individuales aisladas de biowires o cuerpos embrioides (EBS) se registraron con un patch clamp. Cola densidad de corriente (A) hERG. Densidad de corriente (B) I K1 medido a -100 mV. (C) La regulación positiva de potasio rectificador de entrada gen del canal (KCNJ2). (D) de las células que presentan latidos espontáneos (automaticidad) o ningún latido espontáneo (sin automatismo). Los datos de AD representan la media ± SEM Las diferencias entre los grupos experimentales se analizaron mediante la prueba t de Student, prueba de ji cuadrado, y ANOVA (múltiples comparaciones por pares, el método de Holm-Sidak). Esta figura se ha modificado de la referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<td colspan = "5"> evitar cualquier daño a la alambre de platino, cubriendo la tapa suavemente. Use cinta adhesiva para asegurar la tapa correctamente en la placa en caso de que la tapa no se cierra completamente. Al cerrar las puertas de la incubadora, colocar la porción más fina de los cables del estimulador eléctrico en los puntos de cierre de la puerta para asegurar el sellado adecuado de la incubadora.
Protocolo paso # Los pasos críticos
2.4 Colocar las varillas de carbono de 1 - 2 cm de separación o a la distancia más pequeña posible para evitar la estimulación de alta energía y la muerte celular.
2.6 Prueba de las conexiones entre el alambre de platino y el carbono una vez que la cámara de estimulación se realiza por primera vez. Vincular la cámara de estimulación para el estimulador eléctrico y luego establecer un voltaje deseado. Coloque una ventaja de voltios en cada una de las dos varillas de carbono. La tensión de salida de la cámara de estimulación debe ser el mismo voltaje de lectura en el voltímetro. Lecturas incorrectas indican el posible recubrimiento de la alambre de platino con PDMS u otra conexión defectuosa en el sistema.
3.1 Se utilizaron células individuales para sembrar el biowire. Para la disociación, la incubatioN tiempo con colagenasa es crítico y debe estar determinado por la edad de las células y el protocolo de diferenciación (EBs versus monocapas). En este protocolo, se recomienda un tiempo de incubación de 2 h para el día 21 EBs y 30 min para monocapas. Para células de otras edades, el tiempo de digestión de la colagenasa puede necesitar optimización mediante el control de la viabilidad celular y la función contráctil post-digestión.
3.3 La tripsina puede dañar las células; Por lo tanto, limitar la duración de la incubación a no más de 5 min.
3,5 Evite la introducción de contaminantes sujetando sólo el extremo de la jeringa para fijar la jeringa a la punta de la aguja. El número de plumas está determinado por la ausencia de grandes grupos de células. Minimizar la interrupción de la aguja para evitar la muerte celular. Evite la formación de burbujas. En el caso de grupos visibles después de la interrupción de la aguja, prolongar el tiempo de incubación en la colagenasa en aislamientos posteriores en lugar de aumentar latiempo de incubación en tripsina o el número de zambullidas.
3.6 Eliminar el sobrenadante por completo antes de la adición de gel. medio residual puede diluir la proporción de células: gel y afectar a la polimerización de gel.
3.7 Mantener las concentraciones de los componentes de gel de colágeno al escalar hacia arriba o hacia abajo. Tenga en cuenta que las concentraciones de valores pueden variar de acuerdo con el lote o la preparación de los reactivos.
3.11 Para asegurarse de que PDMS micropocillos se quedan en la parte inferior de la placa de Petri, asegúrese de que la placa de Petri está seco y el uso de un par de pinzas estériles para empujar los micropocillos PDMS hacia abajo.
4.2 Asegúrese de que todos biowires están en su lugar. Cubrir los biowires completamente con en la cámara de estimulación eléctrica medio. Organizar todo biowires perpendiculares a las varillas de carbono.
4.3
4.4 Desconectar el estimulador eléctrico para los cambios de medio. Use un P1000 para eliminar sólo la parte superior de la edad media y luego añadir medio fresco. Asegúrese de que los biowires siempre están sumergidas bajo el medio.

Tabla 1: pasos críticos en el Protocolo.

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Discussion

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Este manuscrito describe la configuración e implementación de la plataforma de ingeniería, biowire, para mejorar la maduración de HPSC-CM. El dispositivo se puede realizar en instalaciones de microfabricación estándar, y biowires puede ser producido con técnicas de cultivo celular comunes y un estimulador eléctrico.

Hasta donde sabemos, no existe un método similar al reportado biowires. Esta estrategia revela que la mejora de las propiedades de maduración eran dependientes de la pauta de estimulación eléctrica, como se evidencia por el nivel de maduración mayor obtenida en los biowires sometidos a la mayor tasa de estimulación de aceleración régimen (6 Hz frente a 3 Hz). Los cardiomiocitos en biowires demostraron menos automaticidad y las corrientes de hERG más altas y I K1 en comparación con EBs cultiva durante 20 días (EBd20) o para 40-44 días (EBd44). EBd20 cardiomiocitos representadas las propiedades de células antes de su incorporación en biowires, mientras que los cardiomiocitos EBd44 se cultivaron 10 días longer que el tiempo de cultivo biowire y muestra que incluso con más tiempo en cultivo en formato EB, cardiomiocitos no pudieron llegar a propiedades de maduración equivalentes a los inducidos por la estimulación eléctrica en biowires. Sin embargo, los cardiomiocitos obtenidos a través de biowires todavía no son tan madura como cardiomiocitos adultos.

La estimulación mecánica se ha sugerido para ser eficaz en la inducción de proteínas estructurales de HPSC-CM. Sin embargo, la estimulación mecánica no dio lugar a la maduración electrofisiológico 12. Esto podría sugerir la necesidad de combinar la estimulación eléctrica y el estrés mecánico, secuencial o simultáneamente, para inducir la diferenciación terminal en cardiomiocitos derivados de HPSC. La combinación de estimulación eléctrica con otros métodos, incluyendo la entrega de bioquímica factores de 17 y la alineación celular en 3D tejidos 18, podría ser capaz de lograr una Strate más eficaz pro-maduraciónPara futuros estudios in vivo .

Las dimensiones del dispositivo de biowire utilizado aquí son 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (longitud x anchura x altura), pero es posible modificar el dispositivo para fabricar biowires más largos. Sin embargo, la altura de los biowires está limitada a 0,3 mm (con un radio de ~ 300 μm tras la compactación del gel), dadas las limitaciones en el suministro de oxígeno en tejidos más grandes. Para superar esta limitación de la generación de tejidos más gruesos, un método de perfusión sería necesario [ 19] . Sin embargo, se recomienda mantener la relación de 0,5 x 10 6 células / 0,5 cm de alambre de longitud. Para biowires más largos, la polimerización del gel del colágeno puede tardar más, y los cambios más frecuentes del medio pueden ser necesarios debido al número creciente de células. Por otra parte, la configuración actual de la biowire utilizando sutura de seda no permite la medición de la fuerza de contracción generada por los cardiomiocitos sembrados. Sin embargo, el uso de una sutura biodegradableE este posible en el futuro.

El tipo de célula utilizada para hacer la biowire descrito aquí es hESC-CM utilizando la línea celular Hes2 20. El protocolo también podría usar líneas celulares hiPSC (por ejemplo, CDI-MRB y HR-I-2Cr-2R) 14. La capacidad cardiomiogénico de diferentes líneas de células madre humanas podría ser diferente, y la idoneidad para esta plataforma debe ser determinado experimentalmente y las condiciones optimizadas según sea necesario. Hay varios pasos críticos dentro del protocolo (véase la Tabla 1).

Adicionalmente, los biowires fueron diseñados para caber en una placa de 6 pocillos, y el ejemplo aquí mostraron la fabricación de una biowire. Sin embargo, es posible cultivar y estimular eléctricamente múltiples biowires simultáneamente en un pocillo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas de la Heart and Stroke Foundation de Canadá (G-14-0.006.265), las subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (137352 y 143066), y una beca de la Fundación JP Bickell (1013821 ) al SSN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

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References

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La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica
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Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).More

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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