Summary
Hjärt biowire plattformen är en in vitro-metod som används för att mogna humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hPSC-CM) genom att kombinera tredimensionella cellodlingar med elektrisk stimulering. Detta manuskript presenterar detaljerade installationen av hjärt biowire plattformen.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hPSC-CMS) har varit ett lovande cellkälla och har därmed uppmuntrat undersökning av deras potentiella tillämpningar inom hjärt forskning, inklusive läkemedelsupptäckt, sjukdom modellering, vävnadsteknik, och regenerativ medicin. Emellertid celler som produceras av existerande protokoll visa ett intervall av omognad jämfört med nativa vuxen ventrikulära kardiomyocyter. Många ansträngningar har gjorts för att mogna hPSC-CMS med endast måttlig mognad uppnås hittills. Därför konstruerad systemet, kallat biowire, varit har utarbetat genom att tillhandahålla både fysiska och elektriska signaler till bly hPSC-CM till en mer mogen tillstånd in vitro. Systemet använder en mikrofabricerad plattform till utsäde hPSC-CMs i kollagen typ I gela längs en styv mall sutur för att montera in i linje hjärtvävnaden (biowire), som utsattes för elektriska fältstimulering med en progressivt ökande frekvens. Jämfört med icke stimulerade kontrollerstimulerade biowired kardiomyocyter uppvisar en ökad grad av strukturell och elektrofysiologiska mognad. Sådana förändringar är beroende av stimuleringsfrekvensen. Detta manuskript beskriver i detalj design och skapande av biowires.
Introduction
Cellbaserad terapi är en av de mest lovande och undersökta strategier för att uppnå hjärt reparation / regeneration. Det har med hjälp av hjärtvävnadsteknik och co-leverans av biomaterial 1, 2. De flesta tillgängliga cellkällor har studerats i djurmodeller för deras potentiellt positiva effekter på skadade, sjuka eller äldre hjärtan 3. I synnerhet, har stora ansträngningar gjorts för att använda human pluripotent stamcell (hPSC) -härledda kardiomyocyter (hPSC-CM), en potentiellt obegränsad autolog cellkälla för hjärtvävnadsteknik. hPSC-CMs kan produceras med användning av flera fastställda protokoll 4, 5, 6. Emellertid, de erhållna cellerna uppvisar fetala liknande fenotyper, med en rad av omogna egenskaper jämfört med vuxna ventrikulära kardiomyocyter 7, 8. Detta kan vara ett hinder för tillämpningen av hPSC-CM som modeller för vuxna hjärtvävnad i läkemedelsforskning och utveckling av vuxna förebilder 9 hjärtsjukdom.
För att övervinna denna begränsning av fenotypisk omognad, har nya metoder aktivt undersökts för att främja cardiomyocyte mognad. Tidiga studier avslöjade effektiva pro-mognads egenskaper i neonatala råttkardiomyocyter via cyklisk mekanisk 10 eller elektrisk stimulering 11. Gel kompaktering och cyklisk mekanisk stimulering visade sig också förbättra vissa aspekter av hPSC-CM mognad 12, 13, med minimal ökning av hanterings de elektrofysiologiska och kalcium egenskaper. Därför var en plattform system som kallas "biologisk tråd" (biowire) devised genom att tillhandahålla både strukturella signaler och elektriska fältet stimuleringn för att förbättra mognaden av hPSC-CM 14. Detta system använder en mikro plattform för att skapa linje hjärtvävnad som är mottaglig för elektrisk fältstimulering. Detta kan användas för att förbättra den strukturella och elektrofysiologiska löptid hPSC-cm. Här beskriver vi detaljerna i att göra sådana biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Design och Fabrication
OBS! Använd mjuk litografi för tillverkning av apparater. Gör en tvåskikt SU-8-mast för polydimetylsiloxan (PDMS) gjutning.
- Konstruera enheten med hjälp av en design- och ritningsprogramvara ( Figur 1A , vänster). Rita varje lager av masten separat. Skriv ut designen på två fotomasker vid 20 000 dpi, vilket motsvarar de två skikten i master 15 . Ställ in enhetsmönstret så transparent och omgivningen är så mörk; Maskerna kommer att fungera som mall för att optiskt överföra anordningsmönstret till SU-8 genom litografi (såsom beskrivits av andra 15 ).
- Dispensera ca 4 ml SU-8 50 på mitten av en 4 tums silikonplatta. Belägg SU-8 50 jämnt på skivan med hjälp av en spinnbeläggare genom att snurra vid 2.000 varv per minut (RPM) i 30 s. Baka skivan på en 95 ° C kokplatta i 10 minuter. Utsätt wafen för ultraviolett (UV) light vid 200 mJ / cm 2.
- Pour ca 4 ml av SU-8 2050 på mitten av skivan och snurra vid 2500 rpm under 30 s. Baka på 95 ° C värmeplatta i 15 min. Kyl till rumstemperatur (RT).
- Upprepa steg 1,3 ytterligare två gånger.
- Täcka belagda skivan med det första skikts öppenhet fotomask. Utsätta skivan för att UV-ljus vid 270 mJ / cm 2 för att göra det första skiktet. Baka på 95 ° C värmeplatta i 15 min.
- Göra det andra skiktet av SU-8 2050 genom att upprepa steg 1,3 två gånger.
- Rikta den andra skiktsmask till särdragen på det första skiktet med användning av en mask aligner. Sedan utsättas för UV-ljus vid 240 mJ / cm2. Baka vid 95 ° C under 15 min.
OBS: Exponeringstiden bestäms av den erforderliga totala UV-dosen och den UV-ljusutgångsintensitet mätt på dag före användning. - Utveckla skivan genom att sänka ned det i propylenglykol monometyleteracetat (PGMEA) och skakning vid 200 RPM under 30 min på en orbital skakanordning.
- Platsmaster i en petriskål och häll försiktigt PDMS blandningen (bas till tvärbindningsmedel vid ett förhållande av 10: 1 i vikt) på mitten av skivan. Täck alla funktioner och undvika luftbubblor.
- Värme i en ugn vid 70 ° C under 2 h. Använda ett vasst blad för att skära runt kanten av PDMS biowire mall (Figur 1 A, höger). Skala PDMS från master. Trimma enheten med bladet. Sätta PDMS biowire mall i en steriliseringspåse och ångautoklav vid 121 ° C under 20 min.
- I en biosäkerhet skåp (BSC), placera PDMS biowire mall i en petriskål. Använder pincett för att hålla och montera en bit av steril kirurgisk silkessutur (6-0) i mitten av kanalen av PDMS mikrobrunn genom sittplatser det i spåren vid båda ändarna av kanalen (figur 1B-I).
2. Skapande av den elektriska stimuleringen avdelningen
- Göra ett par rektangulära polykarbonatstycken (längd x bredd x tjocklek: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) och använda dem som ramen av den elektriska stimuleringen kammaren (Figur 2).
- Borra två 3 mm breda hålen 2 cm från varandra längs centrumlinjen för varje polykarbonat ramstycke.
- Skär två stycken av 1,5 cm långa kolstavar. Borra ett 1 mm brett hål genom kolstaven ca 3 mm från änden. Tråd en platinatråd genom kolstaven hålet och dra åt tråden genom att linda den runt kolstaven. Fästa en klämma till den andra änden av platinatråd för senare anslutning till den elektriska stimulatorn.
- Infoga kolstavar in i polykarbonat karmstycken. Placera den monterade ramen med kolstavar i en brunn i en sex-brunnar.
- Häll 2 ml av PDMS i brunnen. Dränka botten av polykarbonatramar i PDMS och samtidigt hålla PDMS ytan nivå nära men inte når botten av de kolstavar. Värme i en ugn vid 70 ° C under 2 h.
- Ta elektrisk stimulering kammare av de sexbrunnars platta och placera den i en steriliseringspåse för ångsterilisering vid 121 ° C under 20 min.
3. Enzymatisk Dissociation av hPSC-CMs
- Inducera hPSC att differentiera till kardiomyocyter som använder ett etablerat protokoll 4.
OBS: I korthet genererar kardiomyocyter via etablerade embryoid kropp (EB) protokoll i stammen pro medium genom den sekventiella tillskott med benmorfogenetiskt protein 4, basisk fibroblasttillväxtfaktor, aktivin A, vaskulär endotel tillväxtfaktor och Dickkopf homolog en 4. Använd EB från dag 20-34 av differentiering för att göra biowires. - Samla EBs från den låga fästplattan med en P1,000 pipettspets och överför till en konisk tub. Pelletera genom centrifugering under 5 min vid 125 xg och RT. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten med förvärmda, 37 ° C kollagenas typ I innehållande 1% deoxiribonukleas I (DNas I). Inkubera vid 37 ° C under 2 hför matsmältningen.
- Lägga 5 ml förvärmda, 37 ° C tvättmedium och centrifugera i 5 minuter vid 125 xg och RT. Kassera supernatanten. Suspendera pelleten med 2 ml trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -lösning och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
- Tillsätt 1 ml av stopp medium innehållande 3% (volym / volym) DNas I.
- Bifoga en 20 G (0,9 mm) nål till en 5 ml spruta och passera EB suspensionen genom det 3-5 gånger.
- Tillsätt 7 ml tvättmedium och centrifugera vid 280 xg under 5 min. Kassera supernatanten. Resuspendera pelleten i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) och förvara på is. Bestäm antalet celler med en hemocytometer. Ta 0,5 x 10 6 celler och pellet genom centrifugering vid 280 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten.
- Pre-kyler alla gel komponenter på is före blandning av dem i ett sterilt rör. Blanda följande kollagengel komponenter (slutlig koncentration): 2,1 mg / ml råttsvanskollagen typ I, 24,9 mM glukos, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES och 10% extracellulär matris i 1x M199-medium. Tillsätt kollagen och extracellulära matrix sist. Blanda genom att pipettera upp och ned.
- Resuspendera 0,5 x 10 6 celler med 3,5 mikroliter av kollagengel och blanda väl.
- Använda en P10 pipettspets för att lägga till 4 mikroliter av cellsuspensionen in i den 0,5 cm lång kanal (Figur 1B-II). Justera placeringen av suturen med sterila pincett om det behövs.
- Täcka botten av petriskålen med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och se till att inte röra gelén. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Ersätta PBS med 12 ml av odlingsmedium (t.ex., stamceller pro eller medium som rekommenderas av cellen tillverkaren), tillräckligt för att täcka cellerna (Figur 1B-III). Odling i en inkubator vid 37 ° C under en vecka. Ändra mediet varannan dag.
4. Elektrisk stimulering för Biowire Odling
- IBSC, tillsätt 2 ml PBS till varje brunn i en sex-brunnar som kommer att inrymma en elektrisk stimulator kammaren. Använd sterila pincett för att försiktigt placera autoklave elektrisk stimulering enhet i brunnen. Kassera PBS från brunnen.
- Täcka kolstavar med 5 ml förvärmt odlingsmedium. Använda sterila pincetter för att montera de biowires i den elektriska stimuleringen kammaren och orientera dem vinkelrätt mot kolstavar (Figur 2).
- Placera locket på toppen av sex-brunnars platta, men lämna tillräckliga platinatrådar som når utanför plattan för att ansluta med den elektriska stimulatorn. Placera sex brunnar i en cellkultur inkubator vid 37 ° C och anslut platinatråd till den elektriska stimulatorn.
- Stimulera biowires användning av en elektrisk stimulator med följande inställning: bifasisk upprepande puls, 1-ms puls varaktighet, 3 V / cm, och en puls per sekund (PPS). Höj PPS var 24 h till följande värden: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 och 6. Ändra mediet varannan dag.
- Observera cardiomyocyte kontraktilitet som svar på elektrisk stimulering under ett mikroskop vid 10X förstoring.
OBS: Efter en veckas stimulering, de biowires blir mogna (se avsnittet resultat).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det rationella för användningen av en sutur i biowires är att fungera som ett templat för bildande av 3D-konstruktioner som är inriktade i en axel och efterliknar formen av hjärtfibrer. Vi visar att efter sju dagars odling i biowire, celler ombyggda gelén runt suturen (Figur 3A). Cellerna monterade längs axeln av suturen för att bilda linje hjärtvävnad (Figur 3). Efter 7 dagar av förodling ades biowires kastades 7 dagar av elektrisk fältstimulering och vidare uppvisade egenskaper kompatibla med strukturell och funktionell mognad av kardiomyocyter.
Human PSC-CMs i biowires uppvisade starkt uttryck av hjärt kontraktila proteiner, sarkomeriskt α-actinin, och aktin (Figur 4A). Vi observerade sarkomeriskt banding av hPSC-CM kontraktila anordning och inriktning av myofibrilar strikturerlängs axeln av suturen. Detta är kvalitativt liknande strukturen i den vuxna hjärtat (Figur 4A). Sekund, jämfört med de av EBs, dessa biowired hESC-CMs visas lägre förökningshastigheter (Figur 4B). Tredje, uppvisade den biowired hESC-CMs förbättrade kalciumhanteringsegenskaper (fig 5) och cardiomyocyte elektrofysiologi mognad (Figur 6). I mogna kardiomyocyter, behandling med koffein inducerar en abrupt frigöring av Ca2 + från sarkoplasmatiska retiklet 8. Sådana Ca 2 + transienter hittades i elektriskt stimulerad hESC-CMs, men inte i celler från icke-stimulerade kontroller (Figur 5A-C). Svaret på koffein i de elektriskt stimulerade celler, jämfört med icke-stimulerade kontroller, visade en signifikant högre amplitud av intensitet i en stimuleringsfrekvensberoende sätt (Figur 5D och E). Samtidigt hPSC-CMi biowires visade förbättrad hERG ström och inåt likriktarströmmen (I k1) densiteter, som ytterligare förbättras genom elektrisk stimulering (figur 6A och B). Sådana förbättringar i I k1 ström är förenliga med en induktion i kalium inåt likriktande kanal genen (KCNJ2) proteinexpression i de biowires (figur 6C).
En annan viktig parameter när det gäller mognad är förmågan hos de kardiomyocyter för att slå spontant, även känd som automatik, vilket är ett tecken på omognad i arbets cardiomyocytes (förmaks- och ventrikulära) 16. Automatik var signifikant högre i EB-härledda kardiomyocyter jämfört med kontroll biowires (figur 6D), som var jämförbar med den i biowires utsatts för 6-Hz regim.
Tan tillsammans, indikerar dessa resultat att kultur i biowire med elektrisk stimulering främjas den strukturella och elektrofysiologiska mognad av hPSC-CM 14.
Figur 1: Biowire Culture Platform. (A) Schematisk (vänster) och faktiska (höger) PDMS mögel av biowire. Scale bar = 2 mm. (B) För att ställa in biowire ades en sutur monterad centralt i kanalen (I). En hESC-CM suspension i kollagen typ I-gel ympades runt suturen i kanalen (II) och inkuberades i medium (III). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DenBiowire odlades i elektrisk stimulering kammaren under den andra veckan i odling. Den biowire placerades vinkelrätt mot kolelektroder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell ombyggnad och Gel Contracting runt suturen efter 7 dag Förodling i Biowire. (A) bright bilder av hESC-CMS på indikerade dagar av förodling i biowire mallen. Scale bar = 200 | im. (B) Kvantifiering av gel kompakte på de angivna dygns odling (medelvärde ± sd). (C) Hematoxylin och eosin (H & E) och Masson trikrom (MT) färgning av biowire sektionerna (de dubbelriktade pilarna representerar suturen axeln). skala bar = 100 um. Denna figur har modifierats 14 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fysiologi Cardiomyocytes Cultured i Biowire Platform. (A) Representativa konfokala bilder av icke-stimulerade (kontroll) och elektriskt stimulerade biowires (3 Hz och 6 Hz regimen) som visar cardiomyocyte inriktning och frekventa Z-skivor (dubbelhövdade pilarna representerar suturen axeln). Grön, α-actinin; röd, aktin. Scale bar = 20 | im. (B) cardiomyocyte proliferation i de biowires var lägre än i EBS. Proliferation fastställdes genom dubbel färgning för sarkomeriskt α-actinin och Ki67 (n = 3-4 per tillstånd, genomsnittliga ±; sd). *, **, # och & representerar statistiskt signifikanta skillnader jämfört med EBd34 (Students t-test). Denna figur har modifierats 14 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Elektrisk stimulering sponsrade Förbättringar i Ca2 + hanteringsegenskaper. (AC) Representativa spår av Ca2 + frisättning som svar på koffein i icke stimulerade kontrollceller (A) och celler utsatta för den 3-Hz regim (B) och den 6 Hz regim (C). (D) Koffein-inducerad förändring av topp fluorescensintensitet bland experimentella grupper (medel ± sem efter normalisering topp fluorescens intensity innan administreringen av koffein; kontroll mot 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; kontroll kontra 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz kontra 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (kontroll), n = 6 (3 Hz), och n = 9 (6 Hz) (Students t-test). (E) Representativa fluorescerande inspelning av Ca 2 + transienter före och efter administrering av koffein vid 5 mM (pil) i celler som utsattes för 6 Hz regim. Denna figur har modifierats 14 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Elektrisk Pacing Förbättrar Elektrofysiologiska egenskaper och automatik. Electrophysiological egenskaper i enkel kardiomyocyter isolerade från biowires eller embryoidkroppar (EBS) registrerades med en patch-clamp. (A) hERG svans strömtäthet. (B) I K1 strömtäthet uppmätt vid -100 mV. (C) Uppreglering av kalium inåt likriktande kanal genen (KCNJ2). (D) Förhållande av celler som uppvisar spontana slag (automatik) eller ingen spontana slag (ingen automatik). Data i AD representerar medelvärdet ± SEM Skillnaderna mellan experimentgrupperna analyserades med Students t-test, chi-kvadrattestet, och ANOVA (parvisa multipla jämförelser, Holm-Sidak metod). Denna figur har modifierats 14 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protokoll steg # | kritiska steg | ||||
| 2,4 | Placera kolstavar 1 - 2 cm från varandra eller på minsta möjliga avstånd för att undvika hög energi stimulering och celldöd. | ||||
| 2,6 | Testa anslutningarna mellan platinatråd och kolet när stimuleringskammaren är gjord för första gången. Länka stimuleringskammaren till den elektriska stimulatorn och sedan ställa in en önskad spänning. Placera en volts bly på vardera av de två kolstavar. Utspänningen från stimuleringskammaren bör vara samma spänning läses på voltmetern. Felaktiga avläsningar indikerar den möjliga beläggningen av platinatråden med PDMS eller annan defekt anslutning i systemet. | ||||
| 3,1 | Enstaka celler användes för att ympa biowire. För dissociation, den incubation tid med kollagenas är kritisk och bör bestämmas av en ålder av cellerna och differentieringsprotokollet (EBs kontra monoskikt). I detta protokoll är en inkubationstid på 2 timmar rekommenderas för dag 21 EB och 30 min för monoskikt. För celler i andra åldrar, kanske kollagenas koktiden behöver optimering genom att övervaka cellviabiliteten och sammandragningsfunktion efter matsmältningen. | ||||
| 3,3 | Trypsin kan skada cellerna; sålunda begränsa inkubationen varaktighet till inte längre än 5 minuter. | ||||
| 3,5 | Undvik att införa föroreningar genom att hålla endast i slutet av sprutan för att fästa sprutan nålspetsen. Antalet störtar bestämmes genom frånvaron av stora klumpar av celler. Minimera störningar nål för att undvika celldöd. Undvika bubbelbildning. I händelse av synliga klumpar efter avbrott nål, förlänga inkubationstiden i kollagenas i efterföljande isoleringar istället för att öka deninkubationstid i trypsin eller antalet störtar. | ||||
| 3,6 | Avlägsna supernatanten fullständigt före tillsatsen av gel. Restmediet kan späda förhållandet av cellen: gel och påverka gelpolymerisationen. | ||||
| 3,7 | Upprätthålla koncentrationerna av kollagengelen komponenterna vid skalning upp eller ner. Ha i åtanke att förrådskoncentrationer kan variera beroende på satsen eller beredning av reagensen. | ||||
| 3,11 | För att säkerställa att PDMS mikro bo på botten av petriskålen, se till att petriskålen är torr och använda ett par av sterila pincett för att trycka PDMS mikro ner. | ||||
| 4,2 | Se till att alla biowires är på plats. Täck biowires fullständigt med mediet i den elektriska stimuleringen kammaren. Ordna alla biowires vinkelrätt mot kolstavar. | ||||
| 4,3 | <td colspan = "5"> Undvik eventuell skada på platinatråden genom att täcka locket försiktigt. Använd tejp för att fästa locket ordentligt på plattan vid locket inte stängs helt. Vid stängning inkubator dörrar, placera tunnare delen av trådarna från den elektriska stimulatorn vid dörrstängningspunkter för att säkerställa korrekt tätning av inkubatorn.|||||
| 4,4 | Koppla den elektriska stimulatorn för medel ändras. Använd en P1000 för att ta bort endast den övre delen av det gamla mediet och sedan lägga färskt medium. Se till att biowires alltid nedsänkt under medium. | ||||
Tabell 1: Kritiska steg i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver installationen och genomförandet av den modifierade plattformen biowire att förbättra mognaden av hPSC-cm. Anordningen kan tillverkas i standardmikrotillverkningsmöjligheter och biowires kan produceras med vanliga cellodlingstekniker och en elektrisk stimulator.
Så vitt vi vet finns det ingen rapporterad metod som liknar biowires. Denna strategi visar att förbättrade mognads egenskaper var beroende av den elektriska stimuleringen regim, vilket framgår av den större mognadsnivån som erhölls i de biowires utsatts för den högre stimuleringsfrekvensen upprampning regim (6 Hz vs. 3 Hz). Kardiomyocyter i biowires demonstrerade mindre automatik och högre hERG strömmar och jag K1 jämfört med EBs odlas under 20 dagar (EBd20), eller för 40-44 dagar (EBd44). EBd20 kardiomyocyter representerade cell egenskaper innan deras införande i biowires, medan EBd44 kardiomyocyter odlades 10 dagar longer än biowire odlingstiden och visar att även med längre tid i odling i EB-format, kunde kardiomyocyter inte nå ekvivalenta mognads egenskaper som de inducerade genom elektrisk stimulering i biowires. Men kardiomyocyter som erhållits via biowires är fortfarande inte lika mogen som vuxna cardiomyocytes.
Mekanisk stimulering har föreslagits vara effektiv vid induktion av strukturella proteiner av hPSC-CMs. Men mekanisk stimulering inte leda till elektro mognad 12. Detta kan antyda behovet av att kombinera elektrisk stimulering och mekaniker stress, sekventiellt eller samtidigt, för att inducera terminal differentiering i hPSC-härledda kardiomyocyter. Kombinationen av elektrisk stimulering med andra metoder, innefattande leverans av biokemisk faktorer 17 och celljustering i 3D vävnader 18, skulle kunna uppnå en mer effektiv pro-mognad strategy för framtida in vivo-studier.
Dimensionerna hos biowire anordningen som används här är 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (längd x bredd x höjd), men det är möjligt att modifiera anordningen för att göra längre biowires. Emellertid är höjden på biowires begränsade till 0,3 mm (med en radie av ~ 300 | im vid gel kompaktering), med tanke på de begränsningar i syretillförsel i större vävnader. För att övervinna denna begränsning att generera tjockare vävnader skulle en perfusion metod krävas 19. Icke desto mindre, är det rekommenderat att bibehålla förhållandet av 0,5 x 10 6 celler / 0,5 cm av tråd i längd. För längre biowires kan kollagengel polymerisation ta längre tid, och mer frekventa förändringar medel kan behövas på grund av det ökade antalet celler. Dessutom behöver den aktuella installationen av biowire användning silkesutur inte tillåta för mätning av kraften hos sammandragningen som alstras av de sådda kardiomyocyter. Emellertid kan användningen av en biologiskt nedbrytbar sutur makDet är möjligt i framtiden.
Den celltyp som används för att göra biovärdet beskrivet här är hESC-CM med användning av Hes2 cellinjen 20 . Protokollet kan också använda hiPSC-cellinjer ( t.ex. CDI-MRB och HR-I-2Cr-2R) 14 . Den kardiomyogena förmågan hos olika humana stamceller kan vara annorlunda, och lämpligheten för denna plattform bör bestämmas experimentellt och villkoren optimeras efter behov. Det finns flera kritiska steg inom protokollet (se tabell 1 ).
Dessutom utformades biovärdena för att passa in i en 6-brunnsplatta, och exemplet här visade tillverkningen av ett biovåg. Det är emellertid möjligt att kultivera och elektriskt stimulera flera biovågor samtidigt i en brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag-i-stöd från hjärta- och slaggrunden of Canada (G-14 till 0.006.265), driftsbidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (137.352 och 143.066), och en JP Bickell Foundation (1.013.821 ) till SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
