Summary
単一のセル対人間 TCR アルファとベータ鎖シーケンスで現在のプロトコル結合合理化レトロウイルスベクターの in vitroとin vivoの TCR 式と互換性の世代です。
Abstract
1 つの T 細胞からペアの T 細胞受容体 (TCR) アルファとベータ鎖の配列のためのいくつかの方法が開発されているが、どれもはこれまで TCR ヘテロの下流に資する生体内機能解析をされています。人間の TCR アルファとベータ鎖の可変領域を全体にまたがる PCR の製品の結果を持つ多重ネストの 2 段階 PCR に基づく改良されたプロトコルを開発しました。ユニークな制限のサイトを識別し、PCR のプライマーに組み込む、によって行った PCR の製品テンプレート レトロウイルスベクターに直接補助的クローニングと互換性があります。結果としてレトロ ウイルス構築キメラ人間/TCR を持つマウス マウス細胞やマウスモデルの生体内での機能はマウスの細胞内ドメインをエンコードします。全体的に、ここで説明されているプロトコルは生体外でそして生体内の TCR 式のレトロウイルスベクター容易に適応できるの合理化された世代対単一細胞 TCR アルファとベータ チェーン識別を組み合わせたものです。ビデオとそれに伴う材料は、重要なステップは続くと潜在的な落とし穴を回避できるように、単一セル PCR の非常に詳細な説明を与えるに設計されています。また、発現ベクターを生成に必要なクローン作成の手順の詳細な説明を提供します。一度マスター、TCR 式に並べ替え 1 つのセルから全体の手順は 2 週間の短期間で実行でした。
Introduction
T 細胞受容体 (TCR) は、開発、定常状態/恒常性やその周囲1,2,3の抗原的な刺激の中に T 細胞の運命の決定を決定します。深い技術の最近の展開は、抗原特異的 T 細胞応答内以前過小評価 TCR の多様性を発見しました。TCR の多様性では、機能的な T 細胞の反応の可能性を示唆しています。実験的システムと生体内でのモデル選択の後続機能解析のために利用に対応する TCR 機能アッセイと TCR シーケンス レパートリー解析を統合するためにシーケンスのアプローチを設計する必要があります。Tcr。人間の TCR シーケンスの分離のための効率的な方法を開発し、HLA ヒト化マウス4TCR 式と互換性のあるキメラマウス人間 TCR テンプレートのベクターへのクローニングはサブを合理化します。ヘテロ二量体型 Tcr の対応するアルファとベータ鎖の分離には、単一のセルから両方の鎖の PCR 増幅が必要です。とはいえ、いくつかの単一セル TCR のクローニング プロトコルが開発され利用どれもこれまでのところされている高スループット合理化された直接クローニングによる未知の Vα/Vβ Tcr の retroviral ベクトル再式の生体内での必要に簡単に互換性のあります。 4,5,6,7。以前の研究は、シーケンスを外挿法で推定したり、全体 TCR シーケンス4,5,6を増幅するための十分な TCR の限られた部分を選択的に増幅する 2 つの主要なアプローチを活用して,7します。 最初のアプローチを介して TCR 系列の下流の機能解析が必要です高価なインシリコアセンブリおよびde novoの建設、TCR。2 番目のアプローチでは、TCR の完全な配列を提供しています、人間の一定の領域はマウス モデルでクローンの Tcr の体内式と互換性ありません。我々 のアプローチは生体内機能解析 Tcr のマウスのモデルに対応する設計します。我々 は、効率的で合理化された単一電池直接補助的クローニング PCR のフラグメントのテンプレートの発現ベクターには、PCR のプロトコルを開発しました。
我々 のアプローチは、2 つの手順で実行される高感度多重入れ子に PCR 反応を利用しています。最初の多重反応 40 プライマーすべての V β 鎖の特定のプールと 44 プライマー シーケンス (表 1) の事前知識がなくて TCR アルファまたは TCR β を増幅するための V α 鎖すべての特定のプールをステップします。前方のプライマーが 5' の PCR の製品に組み込まれているアダプターのシーケンスです。逆のプライマーは、TCR の一定した領域に基づいています。もとは、ユニークな制限のサイト人間変数またはジャンクション TCR 地域から欠席し、新しく再設計された TCRα と TCRβ のプライマー (図 1) にこれらを組み込みます。2 番目の入れ子になった反応アダプター シーケンスの特定のプライマーおよび一定した領域内で入れ子になった逆プライマーを使用して高められた特定性 (表 1、図 1) と TCR チェーンをさらに増幅します。単一細胞の分離後、2 つの PCR のラウンド (Vα と Vβ の両方のプライマーのプールと 2 番目アダプター プライマーの最初の反応) 直接補助的クローン作成できるテンプレート retroviral ベクトルに PCR の製品の結果します。1 つのオープンリーディング フレーム (ORF)、'自己切断' 蛋白質シーケンスによって接続されているマウスの一定領域と組み合わせて人間の可変領域で、TCR の最終的な構成要素をエンコード P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A シーケンスは、複数のシステムで使用されている、Tcr8,9,10,11の表現のために具体的には広範囲にテストされています。とはいえ、P2A シーケンスの残物のほとんどに接続されている後の翻訳ベータ鎖信号シーケンスが追加プロリン、この変更適用範囲が広いリンカーによって接続されているアルファ鎖の C 末端に TCR 機能に有害な影響がないです。マウスの一定の領域が下流のシグナル伝達コンポーネント潜在的な変更された相互作用を避けるために人間ではなく構成要素で使用が場合再マウスの細胞で発現します。単一 ORF は、アルファおよびベータ鎖9,11の化学量論的個別式になります。現在のプロトコルは試薬および広く利用可能、アプローチに基づいており、合理的で効率的な方法で実行するように設計。このプロトコルは同定と人間 Tcr の特定の機能評価に広く適用することができますが、特に自己免疫性糖尿病に関与する自己反応性 T 細胞の Tcr を試金するこのテクニックを使いました、見込んでください。自己免疫性エピトープ、がん抗原や病原体とワクチンへの応答。
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Protocol
1 です興味の T 細胞の人口を識別します。
。注: その増殖抗原的な刺激への応答に基づいて抗原 (のような Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル、CFSE) 細胞分裂染料との組み合わせで特定の増殖は、T 細胞を分離する使用ことができます。PBMCs から始まって、7 日間 の in vitro 拡張は抗原特定 CFSE 低人口 12 を特定するのに足りるはず
。- ミックス PBMCs MHC 一致フィーダー細胞と 5 μ M CFSE 細胞分裂色素でラベル 1:1 。
- プレート 2 2.5 x 10 の 5 細胞/ウェルの 96 ウェル丸底で文化 200 μ L 10 %fcs 完全な RPMI メディアでプレートします
。 注: 完全な RPMI 含まれている l-グルタミン 2 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム, 100 μ M MEM 必須でないアミノ酸, 5 mM HEPES、5.5 × 10 − 5 2-メルカプトエタノールの単位、100 U mL − 1 ペニシリンと 100 μ g mL − 1 ストレプトマイシン 。
- 25 μ M のペプチド抗原を持つ細胞を刺激します 。
- 文化の 4 日目、慎重に取り外して交換するメディアを 100 μ l 添加します
。 注: 抗原特異的 T 細胞の同定のための最適なアプローチは、ペプチド HLA テトラマー 13 の使用です。HLA 制限と同様に、抗原特異性の同時評価四量体の染色が可能です 。
2。単一のセルの並べ替えを設定します
。 増幅されたテンプレートの無料フードまたは指定された領域内のすべてのプロシージャの- を実行。分注、汚染を避けるために試薬きれいにすべての作業面、10% 装備ブリーチ PCR セットアップする前に、可能であれば。フィルターのヒント、DNAse、RNAse フリー試薬およびすべての PCR および手順をクローニング ベクトルにプラスチックを使用します。キーの試薬は テーブルの材料 で見つけることができます
。 注: マルチプレックス PCR の反作用は非常に敏感な低レベル汚染の増幅産物の結果することができます 。
- 生成 RT 反応 x 10 を組み合わせることにより逆のトランスクリプションのマスター ミックス バッファー、25 X DNTPs、9 U RT 酵素、0.01 %0.7 U RNAse 阻害剤, トリトン X と 383 各 RT TCR プライマーが (表 1 に示す) 滅菌ピペット貯水池での nM。各 96 ウェル プレートのピペッティング時に液体の損失を補うために 10 追加反応 (全 106) 十分なマスター ミックスを作る。反力成分とよく当たり、表 2 を参照してください 。 マルチ チャンネル ピペットとウェルあたり逆のトランスクリプションのマスター ミックスの 6 μ L 分注による並べ替えセルの
- 準備 96 ウェル PCR コレクション プレート。氷や冷たいブロック プレートを維持します 。
- 細胞の表面のマーカー (CD4 および CD3、または CD8 CD3 細胞分裂染料または四量体染色との組み合わせで 2 μ g/mL にそれぞれなど) に対する抗体を持つセルのラベルします 。 まあ、ネガティブ コントロールとして 12 の行をスキップあたりのセル数
- 1 つで並べ替え T 細胞
。 注: 並べ替えの効率はセルと cDNA 反応する前に低温でプレートを維持するだけでプレート ホルダー内の正確なコレクション プレートの配置によって異なります。氷の上すべての回でコレクション プレートを保持する必要があります、冷却プレート内固定と並べ替え中を除くすべて選別機が温度調節プレート ホルダー装備します。ただし、1 つの使用は強くお勧めします。プレートは低温に維持されていない場合 RNA の劣化のための増加する可能性がある並べ替えは一般的にプレートごと約 10-15 分を取る、ので 。
- 肯定的な制御として (100 細胞) の大きい数を手動で追加ピペットと井戸の 1 つにこの段階で。また、以前分離したプールされた細胞からの RNA 肯定的な制御としてで使える 10 ウェルあたり ng
。 注: ピペットの精度で浄化されたコントロール RNA と気に他の井戸と偽陽性の結果の交差汚染を避けるためにします 。
- シールの粘着フィルム、プレート、4時 5 分 1000 x g でスピンダウン ° C
- は 10 分、45 分の 37 ° C の 25 ° C でプレートの孵化によってすぐに RNA を cDNA に書き写すと 85 ° C で 10 分間
メモ: 効率的な PCR の反作用のために、最初の PCR の反作用が同じ日に実行されることをお勧めします。転写板または、最大 2 ヶ月間-80 ° C に保つことができる 。
3。多重ネスト pcr
注: 汚染を避けるために、きれいな無料のテンプレート領域のすべてのマスター ミックスを準備します
。- 西川各可変領域に関する入門 DNAse、RNAse フリー H 2 o ・ 100 μ M次に、各 V α プライマー プールを生成する 44 のプライマーの 20 μ L を組み合わせます。V β を生成するには、プライマー プールは各 40 V β プライマー プラス DNAse、RNAse フリー H 2 o. プライマー シーケンスは、表 1 に示す 80 μ L の 20 μ L を組み合わせます。プール、ミックスで各プライマー濃度は 2.3 μ M.
- 100 μ M の原液に一定地域のプライマーを再構成、RNAse フリー H 2 o. Dilute 10 μ M 作業ソリューションおよび使用するための因数に一定した領域プライマー 。
- は、TCR アルファと TCR β の増幅を 2 つの別個のマスター ミックスを準備します。5 X を組み合わせることによりマスター ミックスを生成バッファー、80 μ M 3% DMSO dNTPs 2 μ M プライマー プール (46 の最終濃度各プライマーの nM)、200 nM TCR 定数領域逆プライマー、1 U DNA ポリメラーゼ、DNAse、RNAse フリー H 2 O (表 2 <強い/>)。各 96 ウェル プレートにピペッティング時に液体の損失を補うために 10 追加反応 (全 106) 十分なマスターのミックスを作成します
。 注: 計算は 25 μ L/ウェル、22.5 μ L マスター PCR ミックスは 2.5 μ L cDNA テンプレート組み合わせてどこの最終的な PCR のボリュームに基づきます 。
- は、氷やコールド ブロックの cDNA とプレートをしてください。新しい 96 ウェル PCR プレートに TCR β 反応の 22.5 μ L をピペットにマルチ チャンネルを使用します。PCR プレートに cDNA の 2.5 μ L を転送するマルチ チャンネルを使用します 。
- TCR α cDNA の残りの部分を含むプレートに直接反応の 22.5 μ L をピペットにマルチ チャンネルを使用します 。
- 4時 5 分 1000 x g でダウン接着剤、優しく、渦、スピンでプレートをシール ° C
- 次のサイクルでマルチプレックス PCR の反作用を実行: 95 ° C で 5 分間続けて 20 の 34 サイクル 95 ° c、30 秒 54 ° c、s 72 ° C で 1 分続いて 72 で 7 分 ° C 25 の最終巻でネストされた PCR の反作用を運ぶ
- μ L、テンプレートとしてマルチプレックス pcr の 2.5 μ L を使用します。
- DNAse、RNAse フリー H 2 o.、10 μ M のための因数在庫で 100 μ M の内部、アダプターのプライマーを再構成します 。
- は、TCR アルファと TCR β ampl の 2 つの別個のマスター ミックスを準備します。ご確認下さい。ミックス 5 X のバッファー、25 X DNTP、3% DMSO 200 nM 前方アダプタープライマー 200 nM 逆ネストされたプライマー、1 U DNA ポリメラーゼと DNA ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ フリー H 2 O 22.5 μ L (表 2) の最終巻の。各 96 ウェル プレートにピペッティング時に液体の損失を補うために 10 追加反応 (全 106) 十分なマスターのミックスを作成します
。 注: 2 番目の PCR 反応使用中、5 X PCR バッファー agarose のゲルの読み込みを容易にするために含んでいるローディング色素 。
- 22.5 μ L/ウェルで TCR アルファと TCR β の反応に 2 つ新しい 96 ウェル PCR プレート用マスター ミックス使用、マルチ チャンネル ピペットします 。
- は、2.5 μ L/ウェルでマルチプレックス PCR 反応テンプレートを追加します
。 注: 残りの最初の PCR 反応する必要がありますに密封され、それが必要な場合、追加のテンプレートのソースとして機能する-20 ° C で保存 (4.3 注の手順 を参照してください). - 4 で 1000 × g で 5 分ダウン板、優しく、渦とスピンをシール ° C
- 次のサイクルでネストされた PCR の反作用を実行: 95 ° C で 5 分間続けて 20 の 34 サイクル 95 ° c、30 秒 56 ° c、s 72 ° C で 1 分続いて 72 で 7 分 ° C
- 1% アガロースゲルのうち最終反応の実行 5 μ L のゲル (正と負のコントロール井戸を含む) 含まれる臭化エチジウム
。 注: 予想されるバンド約 500 bp のサイズで実行してください。例反応を 図 2 に示します 。
- 96-well PCR 精製キットを使用して 2 番目の反応 (20 μ L) の残りの部分を浄化、70 ° C H 2 O 好評につき、15 μ L の溶出、サンガーを実行シーケンス。(表 1) を配列するため、適切な TCR アルファまたは TCR β アダプター前方のプライマーを使用します
。 注: シーケンスは、オンライン利用可能な免疫遺伝学ソフトウェアで解析することができます 。
4。アルファとベータの PCR チェーンを補助的クローニングします
。注: 制限のサイトを組み込む最初の反応で利用される前方のプライマーと 2 番目の PCR の反作用で逆のプライマーのプールを使用します。したがって、得られたアルファとベータ鎖 PCR の製品は順次サブ テンプレート レトロ ウイルスのベクトル ( 図 1) に複製する準備ができている
。 ベータ版から- ダイジェスト精製 PCR 製品 BstbI、MfeI (表 3) との反応を入れ子にします
。 注: は 5 μ g 挿入を超えないようにしてください。 。
- 並行して、BstbI と MfeI (表 3) テンプレート ベクトルを消化します。Tcr テンプレート ベクトルの 1-2 μ g を使用します。Agarose のゲルの消化のベクトルを実行しより大きいバンド (~ 7500 bp) を分離します。ゲル DNA 精製キットとベクトルを浄化します
。 注: 制限の酵素のダイジェストの中にテンプレートのマウス TCR β 変数領域が取り外され、人物の TCR β 変数領域を追加するためです 。
- PCR 精製キットを使用して消化の PCR の製品の浄化します
。 注: 確認、キットに含まれる列の DNA の浄化能力必要な場合は、複数の列を使用します。最小精製挿入成功の ligation の反作用に必要な量は 50 10 ng/μ L の最小濃度で ng。精製の挿入量が成功の結紮の不足している場合 2 番目の PCR 反応を繰り返すことができます 。
- 自己結紮、75 で 10 分間の熱不活化を防ぐために 37 ° C で扱う 1 h 10 U CIP 酵素とテンプレート ベクトル ° C. 浄化 DNA を PCR 精製キット (表 3).
- Ligate TCR β を挿入し、室温で 30 分間挿入の 6 モル過剰で 20 μ L の容量で DNA リガーゼを使ってベクトルします
。 注: 合計、ligation の反作用含める必要があります約 150 ng の dna (表 3). - 変換については、80 μ L (材料表) の化学的に有能な エシェリヒア属大腸菌 DH5α セルの ligation の反作用の 8 μ L を混合し、氷上で 30 分 45 s. 追加 500 μ L の 42 ° C で熱ショック間加温スーパーカタボライト抑制 (まで) 媒体と 37 で 1.5 h に振ると最適なスープ ° C 寒天培地ホストゲノム スープ (LB) を含む、アンピシリン細菌培養の
- プレートを 250 μ L。プレート一晩 (~ 16 h) をインキュベート 37 ° C
- 次の日は、細菌のコロニーをピックアップし、一晩アンピシリンを含む 3 mL の LB 培地でそれらを育ちます。DNA プラスミド精製キットを使用してプラスミッド DNA を隔離します 。
- は BstbI と MfeI の制限の酵素と小規模テスト ダイジェストでベータ鎖の挿入を確認します。12 μ L 全反応ボリュームで 200-500 μ g のプラスミド DNA、各酵素の 0.25 μ L、10 X 酵素バッファー (表 3) を組み合わせてください。挿入のバンドのサイズを確認するエチジウム ブロマイドを含む 1% アガロースゲルの反応をアウト実行 (~ 500 bp).
- 挿入の存在を確認し、シーケンス IRES 逆プライマー (表 1) を使用してベクターの TCR β セクション 。
- アルファの可変領域を挿入するため同様のプロセスを実行次 TCR β 挿入のシーケンス確認。アルファの入れ子になった反応と SnaBI と SacII のベクターを含む新しく生成された TCR β 挿入から精製 PCR 産物をダイジェストします
。 注: 制限の酵素のダイジェスト中テンプレート マウス TCR α 変数領域が取り外され、人間の TCR α 可変領域の付加のため 。
- Ligate アルファは室温で 30 分間挿入の 6 モル過剰で 20 μ L の容量で DNA リガーゼを使って対応するベータ版可変領域 TCR ベクトルに挿入します
。 注: 合計、ligation の反作用含める必要があります約 150 ng の dna (表 3). - 変換については、80 μ L (材料表) の化学的に有能な エシェリヒア属大腸菌 DH5α セルの ligation の反作用の 8 μ L を混合し、氷上で 30 分 45 s. 追加 500 μ L までの 42 ° C で熱ショック間加温媒体と 37 で 1.5 h に振る ° C 寒天培地ホストゲノム スープ (LB) を含む、アンピシリン細菌培養の
- プレートを 250 μ L。プレート一晩 (~ 16 h) をインキュベート 37 ° C
- 次の日は、細菌のコロニーをピックアップし、一晩アンピシリンを含む 3 mL の LB 培地でそれらを育ちます。DNA プラスミド精製キットを使用してプラスミッド DNA を隔離します 。
- は、SnaBI と SacII の制限の酵素と小規模テスト ダイジェストでアルファ鎖の挿入を確認します。12 μ L 全反応ボリュームで 200-500 μ g のプラスミド DNA、各酵素の 0.25 μ L、10 x 酵素バッファー (表 3) を組み合わせてください。挿入のバンドのサイズを確認するエチジウム ブロマイドを含む 1% アガロースゲルの反応をアウト実行 (~ 500 bp).
- 挿入の存在を確認し、シーケンス MSCV2 フォワード プライマー (表 1) を使用してベクターの TCR α セクション 。
- アルファ鎖シーケンスを検証すると、TCR β リバース、IRES 逆プライマー (表 1) とシーケンスによって完全な TCR の挿入を確認します 。
5。TCR の細胞表面発現と特異性を確認します
。注: HEK293T 細胞は TCR チェーン巴里の成功のテストに使用表面 ng とセル式 ( 図 3 a) 8。ペプチド-MHC テトラマー染色も、transfected HEK293T 細胞抗原特異性ポスト TCR 遺伝子分離 ( 図 3 b) の保持をテストするために実行できます
。- 1 mL 完全な DMEM メディア含む 5 %fcs は、ウェルあたり 1 x 10 の 5 セルで 12 も組織培養プレートと 37 で一晩文化 HEK293T 細胞をプレート
- ° c. プレート各新しい TCR の別の井戸を指定する十分な細胞を、コントロール テンプレート TCR ベクトル、CD3 ベクトルのみ、制御も TCR ベクトルのみ、と非 transfected。
注: 完全にマウス テンプレート TCR のトランスフェクション ベクトル (関連 pMIA) の組み合わせで mCD3εγδζ pMIG ベクトル、関連 pMIA ベクトルだけと mCD3εγδζ pMIG ベクトルだけでは、正と負のコントロールとして使用されます
。 注: 完全な DMEM 2 mM 100 μ M 1 mM ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンを含む非本質的なアミノ酸、5 mM HEPES バッファー、2-メルカプトエタノール、100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン 10 -5 単位 x 5.5 。
- 次の日 transfect 1 μ g キメラ h/関連-pMIA ベクトル、1 μ g マウス CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) ベクトル、製造元の指示に従ってリポソーム ベースのトランスフェクション試薬とセル 。
- 各 TCR 6 μ L のトランスフェクション試薬を 100 μ L の室温、無血清 DMEM に追加。簡単に渦で 15 分間室温でインキュベートして
- で別 1.5 mL チューブと組み合わせて TCR pMIA ベクトルの 1 μ g 1 μ g マウス CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) ベクトル、または 1 μ g 各ベクトル コントロールの個別の 。
- 凝縮、DNA ベクターを含むチューブにトランスフェクション試薬/DMEM ソリューションを追加します。15 分、室温でインキュベート
- 凝縮、HEK293T 細胞にトランスフェクション試薬/DMEM/DNA ソリューションを追加します。ミックス プレートを軽くタップします。37 ° C 24 時間インキュベート
- 後 24 h、メディアを交換し追加の 24 時間の培養細胞
- プレートから積極的なピペッティングにより細胞を除去し、フローサイトメトリーによるキメラ TCR の発現を確認するマウスの抗 CD3 抗体 (2.5 μ g/mL) で細胞を染色します 。 CD3 式と同様のレベルに細胞間を比較するために
- ゲート蛍光レポーター分子 (CD3 複合、GFP と TCR の発現ベクターのアメトリン) のような高レベルに発現する細胞の解析。GFP + アメトリン + 10 内のセル上の分析のゲート制御、最適な 4 10 5 蛍光強度 ( 図 3 a).
注: キメラ コンストラクト トランスフェクション細胞の CD3 発現のレベルは制御マウス (元のテンプレート) のベクトル ( 図 3 a) に匹敵する必要があります。生成された TCR retroviral ベクトルは、前述 4 体内 式システムと互換性がある 。
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Representative Results
多重ネスト PCR の反作用の効率は agarose のゲルの 5µL 2 番目の反応のうち実行している 3.2.7 (図 2) の手順でチェックします。TCR アルファ反応の効率は通常より低い、約 50% に 80% を前後になると TCR β 増幅の効率の予想平均4。TCR 式だけペア TCR アルファと TCR β 鎖使えますただし、すべての PCR の製品は、TCR シーケンスおよびレパートリーについてシーケンスでした。
遺伝子サイレンシング特定の T 細胞に表現される単一 TCR β 鎖のみできるようになります。ただし、第 2 の TCR α 鎖の位置を換えることができる T 細胞、T 細胞の約 25% が14チェーン 2 番目のフレームの TCR アルファを表現します。それは分離の TCR α 鎖のいくつかの割合が「正しい」のアルファ鎖の代わりにセカンダリのアルファをされる予定です。セカンダリのアルファ鎖は頻繁には TCR β 鎖と最適な結合パートナーです。その結果、すべての複製された Tcr が安定した複雑で、細胞の表面の表現を形成する予定です。したがって、適切な TCR チェーンを組み合わせると細胞表面式の株 HEK293T 細胞 (図 3 a) で確認します。
図 1.合理化された多重ネスト PCR および単一の T 細胞からのレトロ ウイルスの構築開発。PCR の 2 ラウンドは、対応する TCR アルファとベータ鎖の増幅。プライマーに埋め込まれた制限のサイトは、合理化された補助的クローニングとマウス細胞における発現の人間/マウス キメラ ベクトルの生成を許可します。マウス細胞キメラマウス人間 TCR retroviral ベクトル表現と互換性を生成する人間の領域の変数マウスを簡単に切り替えられるテンプレート マウス ベクトルを使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.単一セル PCR の例。単一ヒト T 細胞 1 つの 96 ウェル プレートに分類から T 細胞受容体ベータとアルファ鎖の多重の入れ子にされた PCR の拡大。示すように単一のセルから対応する (上下) PCR 産物増幅 TCR β と人間 PBMCs。 NC - テンプレート コントロール、PC - 肯定的な制御なしから TCR α 鎖。Agarose のゲル (5 μ L) の反応の一部を実行することによって単一のセル アルファとベータ鎖 PCR の反作用の効率は PCR の製品.をシーケンス処理する前に確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.セルの検証表面キメラの TCR の発現と特異性。(A) HEK293T 細胞が発現するマウス TCR や人間/マウス マウス CD3εγδζ との組み合わせでキメラ TCR。細胞表面の TCR の発現は、抗 mCD3ε 抗体を測定しました。戦略をゲート: まず、分析はアメトリンと GFP の二重陽性細胞 (G2) のゲートします。単一ベクトル コントロールの場合単一蛍光 (G1) に基づいているゲートします。第二に、G1 と G2 のセルは、CD3ε 式のレベルに分析されます。四量体の DRB1 293 t 細胞の汚損によって TCR (B) 特異性を確認 * 0401:GAD115-127 四量体。解析は、(A) に示すように、GFP + アメトリン + CD3ε + 細胞、ゲートです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット遺伝子 | 入門向き | シーケンス | |||
| 逆のトランスクリプション | |||||
| TRAC cDNA | AGCTGGACCACAGCCG | ||||
| TRBC1 cDNA | GAAATCCTTTCTCTTGACCATG | ||||
| TRBC2 cDNA | GCCTCTGGAATCCTTTCTCT | ||||
| TCR アルファ PCR 反応 1 | |||||
| TRAV1 1 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGCTTTCCTTCTCTATGTTT | |||
| TRAV1 2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGTTTTCCTTCTTTATGTTTC | |||
| TRAV2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCTTTGCAGAGCACTCTGG | |||
| TRAV3 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCCTCTGCACCCATCTCG | |||
| TRAV4 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAGGCAAGTGGCGAGAGTGATC | |||
| TRAV5 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTC | |||
| TRAV6 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTTT | |||
| TRAV7 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAGATGCGGAGACCTGTC | |||
| TRAV8 1 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGTTGCTCATACCAGTGC | |||
| TRAV8 2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGCTGCTCGTCCC | |||
| TRAV8 3 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGGAGCTTATCCCACTG | |||
| TRAV8 7 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCTTAGTGGTCATTCTGCTGCTT | |||
| TRAV9 1 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAATTCTTCTCCAGGACCAGCG | |||
| TRAV9 2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAACTATTCTCCAGGCTTAGTATCTCTGATACTC | |||
| TRAV10 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTG | |||
| TRAV12 1 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCC | |||
| TRAV12 2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCC | |||
| TRAV12 3 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTG | |||
| TRAV13 1 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGACATCCATTCGAGCTGTATTTATATTCC | |||
| TRAV13 2 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCAGGCATTCGAGCTTTATTT | |||
| TRAV14 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTCACTTTCTAGCCTGCTGAAGGTG | |||
| TRAV16 | フォワード | CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTG | |||
表 1:転写、PCR および配列のプライマーを逆にします。
| ステップ 2.2 | まあ当たり | ||
| RT-PCR の反作用 (6μL) | (Μ L) | ||
| 10 x バッファー | 0.6 | ||
| 2 x dNTP | 0.24 | ||
| 10% トリトン X | 0.06 | ||
| 3 特定の TCR プライマー (10 mM ea) | (x 3 = 0.69) 0.23 ea。 | ||
| 酵素 | 0.18 | ||
| リボヌクレアーゼ阻害剤 | 0.28 | ||
| NF(nuclease-free) H2O | 3.95 | ||
| ステップ 3.1 | |||
| PCR の反作用 1 (25μL) | (Μ L) | b PCR の反作用 1 (25μL) | (Μ L) |
| 5 x バッファー | 5 | 5 x バッファー | 5 |
| dNTP (10 mM) | 1 | dNTP (10 mM) | 1 |
| DMSO | 0.75 | DMSO (3%) | 0.75 |
| プール (F プライマー) (2.3μM) | 0.3 | b プール (F プライマー) (2.3μM) | 0.5 |
| 外部 R プライマー (10 um) | 0.6 | b 外部 R プライマー (10 μ m) | 1 |
| Dna ポリメラーゼ | 0.2 | Taq のポリメラーゼを行く | 0.2 |
| RT-PCR cDNA | 2.5 | RT-PCR cDNA | 2.5 |
| NF H2O | 14.65 | NF H2O | 14.05 |
| 手順 3-8 | |||
| PCR 反応 2 - のための同じと b (25μL) | (Μ L) | ||
| 5 x バッファー | 5 | ||
| dNTP (10 mM) | 1 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| アダプター F プライマー (10 μ m) | 1 | ||
| 内部 R プライマー (10 μ m) | 1 | ||
| Dna ポリメラーゼ | 0.2 | ||
| PCR rxn 1 製品 | 2.5 | ||
| NF H2O | 13.55 | ||
表 2。逆のトランスクリプションおよび PCR の反作用。
| 4.2 及び 4.3 の手順 | |||
| TRBV ダイジェスト反応 (50 μ l) | (Μ L) | 関連 pMIA ベクトル ダイジェスト (500μL) | (Μ L) |
| DNA (~ 20μg) | DNA (~ 20μg) | ||
| MfeI | 2 | MfeI | 20 |
| BstbI | 2 | BstbI | 20 |
| 10 x バッファー | 5 | 10 x バッファー | 50 |
| H2O | H2O | ||
| 4.4 ステップ | |||
| CIP 反応 (100μL) | (Μ L) | DNA(~1.5mg) | |
表 3。反応をクローニング ベクトル。
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Discussion
現在のプロトコルの単一セルの TCR 増幅特性とそれに続く補助的クローニング ペアの TCR アルファとベータ鎖のテンプレート レトロ ウイルス発現ベクターに効率的な方法をについて説明します。単一セル PCR のいくつかのプロトコルが開発されているが、どれもはこれまで即時サブ表現のベクトルへのクローニングと互換性があるされています。ほとんどの場合、可変領域を推定する十分なシーケンスで、非常に可変 CDR3 地域包括的な部分的なシーケンスは増幅されます。PCR の製品のサイズを小さくこの PCR 効率をサポートしますが、 de novo TCR 遺伝子合成機能の研究が必要になります。現在のプロトコルは、以前に発行された CDR3 に焦点を当てた単細胞 TCR シーケンス プロトコル、同時にクローン作成に適した全体変数領域を含む長い私アンプリコンを降伏時の効率を維持します。したがって、記述されているシステムは、定量的順序として機能の出力を与えることで増加する柔軟性を持ちます。
演説する科学的な質問、ソースと分析した T 細胞の特異性によって異なります。ただし、プロジェクトの最終的な目標は、生体内でTCR 関数の解析は場合、は、孤立した T 細胞の HLA の制限を知っている必要は。現在のプロトコルは、HLA ヒト化マウスにおける TCR 式体内に対応する設計にされています。これらのマウスの多くは生成されているし、HLA a2.1 適切、HLA DQ8 を含む市販されている現在 (HLA DQA1 * 301、hla-dqb1 * 302)、HLA DQ6 (DQA1 * 0102、HLADQB1 * 0602)、hla-dr4 (DRB1 * 0401)、HLA DR1 (DRA * 0101 DRB1 * 0101)、HLA A11 (A * 11:01/K)、HLA-B2705Hla-a24, と HLA-B * 0702 トランスジェニック マウス。このプロトコルは、人体 Tcr4,15,16のレトロ ウイルス仲介された骨髄幹細胞発現以前に公開されたプロトコルを正常に結合できます。我々 は自己免疫、該当して非常に便利な様々 な人間の Tcr の機能解析のためにヒトの TCR retrogenic システムがあることを期待、がんと感染症モデル。
現在の単一セル PCR のプロトコルは、重要な手順について説明し、ペア TCR α と TCR β シーケンスの正常な拡大に必要な提案を与えます。最初の重要なステップは cDNA 転写のタイムリーなパフォーマンスとマルチプレックス PCR の後の最初のラウンドです。タイムリーに関連するすべての手順を行わなければならないし、すべての試薬、細胞は RNA と cDNA の劣化を防ぐために氷で保たれます。第二に、プロトコルでは、テンプレートの低レベルに非常に敏感になることが可能なために、汚染に非常に敏感です。したがって、増幅 PCR 産物や TCR ベクトルのクローン作成から、テンプレート無料の領域で動作することが不可欠です。個別の部屋またはフード cDNA と PCR の反作用を設定する使わなければなりません。最初の PCR の反作用からのテンプレートは、PCR を設定した場所から別の領域に追加する必要があります。単一セル PCR 実験の検体の試薬の別のセットを使用することお勧めします。
具体的には最適化されているこのプロトコルは材料の表に記載されている試薬を用いると、任意の置換試薬のさらなる最適化が必要になります。抗原特異的細胞の初期の同定は、ペプチド-MHC テトラマーを使用して変更できます。HLA 制限と同様に、抗原特異性の同時評価四量体の染色が可能です。四量体試薬の不在で早期活性化マーカーの発現、炎症性サイトカインの分泌などの抗原反応の検出のため代替手段が考えられます。たとえば、T 細胞抗原と肝腎の二重特異性融合抗体は抗原反応性肝腎生産細胞を豊かにする磁気ビードの分離と結合できます。
私達のプロトコルで説明したキメラマウス人間コンストラクトは、マウス細胞との互換性を確保、一方人間 CD3 複合との互換性のレベルは不明です。私達によって形式的にテストが他17ヒト リンパ球の表面にマウスの一定領域を持つキメラの TCR 構造を表現できることを示しています。これはマウスの TCR 定数領域が人間 CD3 シグナリング複合との相互作用をサポートできることを示します。ただし、目的は人間の一次電池または Jurkat 細胞などの細胞ラインで識別された Tcr を表現より最適なアプローチは完全に人間の構造を使用するあります。これは、人間の一定領域を持つベクター内マウス定数領域を交換することによって実現できます。
TCR は、シャトル ベクターに挿入する必要があります、その後変異制限内でサイレントのヌクレオチドの変更を誘発するサイトによって指示される突然変異誘発キットを使用して特定の TCR 変数領域にクローニングに使用制限のサイトのいずれかがある場合サイトをカットします。別のアプローチは、不要な制限サイトを除外する変更の興味の TCR の可変領域のde novo合成です。
この手法の主な制限は、セカンダリの '質' のアルファ鎖の増幅を排除するためにできません。TCR α 遺伝子を通過しないような TCR β 遺伝子対立遺伝子排除したがって二次 '質' アルファ鎖14を表現する T 細胞のかなりの割合。記載されている PCR のプロトコルは、増幅のアルファ鎖ですが '質' のアルファ鎖増幅 β 鎖とペアにそれがである場合、1 つの TCR α 鎖の増幅の結果のみ。したがって、成功したチェーンを組み合わせるように HEK293T 細胞の TCR の細胞表面発現をテストすることが不可欠です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、JDRF 1-FAC-2014-243-A-N、ADA 7-14-ユニデン-07、NIH 5 P30 DK079638 05 パイロット PJ と、ロバートとジャニス ・ マクネイア財団によって賄われていた。
患者の募集、テクニカル サポート、博士ジョージ Makedonas 抗体とコントロール PCR の最適化に使用される DNA のギフトのためにサミュエル ・ ブラム、サンドラ ペーニャと Andrene マクドナルドに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 mM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 mg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 mg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 mg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
