Summary
(Rana catesbeiana) sacculus De Amerikaanse brulkikker's maakt rechtstreeks onderzoek van hair-cel fysiologie. Hier de dissectie en de voorbereiding van sacculus de brulkikker voor biofysische studies beschreven. We tonen representatieve experimenten uit deze haarcellen, inclusief de berekening van een bundel van kracht-verplaatsing relatie en meting van de ongedwongen beweging.
Abstract
De studie van het gehoor en evenwicht berust op inzichten ontleend biofysische studies van modelsystemen. Een voorbeeld van zo'n model, de sacculus van de Amerikaanse brulkikker is een steunpilaar van auditieve en vestibulair onderzoek. Studies van dit orgel is gebleken hoe zintuigcellen haar kan actief signalen detecteren uit de omgeving. Door deze studies hebben we nu beter de mechanische gating en lokalisatie van een haar cel transductie kanalen rol van calcium in mechanische bewerking, en de identiteit van haar cel stromen. Deze zeer toegankelijke orgel blijft om inzicht te geven in de werking van haarcellen. Hier beschrijven we de voorbereiding van sacculus de brulkikker voor biofysische studies over de haarcellen. We nemen de volledige dissectie procedure en geven specifieke protocollen voor de bereiding van de sacculus specifieke contexten. We hebben tevens representatieve resultaten met behulp van deze voorbereiding, inclusief de berekening vaneen haar bundel van momentane kracht-verplaatsing relatie en meting van spontane oscillatie een bundel's.
Introduction
De acousticolateralis organen van zoogdieren bezitten een complexe architectuur en in een anatomische niche die moeilijk kan zijn om toegang te liggen. Bijvoorbeeld het zoogdier slakkenhuis omvat een spiraalvormige labyrint is ingebed in de dikke slaapbeen. Isolatie van het slakkenhuis veroorzaakt vaak mechanische schade aan de zintuigcellen liggen binnen het en heeft dus bewezen een moeilijke taak 1 zijn. Neurowetenschappers aldus zich tot systemen die gemakkelijker worden uit het sanctum van het oor modelleren.
Een van deze modelsystemen, de sacculus van de Amerikaanse brulkikker (Rana catesbeiana), al decennia opgeleverd generaliseerbaar inzicht in de werking van auditieve en evenwichtsorgaan. De sacculus een gemengde functie orgel met zintuiglijke rollen in zowel laagfrequente gehoor en seismische sensatie. De sensorische cellen van de sacculus zijn de haarcellen, gespecialiseerde transducers die mechanische energie om te zettenin elektrische signalen binnen onze auditieve en vestibulair organen. Projecteren van het apicale oppervlak van elke haar cel is een mechanosensitieve haarbundel dat een gesorteerde plukje vergrote microvilli genoemd stereocilia omvat. De uiteinden van aangrenzende stereocilia zijn verbonden door filamenteuze tip-koppeling eiwitten die mechanisch poort ionenkanalen in reactie op mechanische stimuli 2, 3. Hoewel auditieve en vestibulaire organen reageren op verschillende stimuli, zij door eenheid detectiemechanisme. Deze gemeenschappelijkheid ligt ten grondslag aan de vele inzichten in het haar cel mechanotransductie door middel van studies van de brulkikker sacculus. Zo heeft het haar cel actief proces uitgebreid onderzocht in dit orgaan 4, 5, 6, 7, en de haarbundel gebruikt een energieverslindende proces mechanische producerenwerk. Niet alleen heeft zij aangetoond dat haarcellen genereren actief werk 6, maar verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan het actieve proces en tuning kenmerken een haar cel werden onthuld door studies van brulkikker acousticolateralis organen. Deze omvatten actieve hair-bundel motiliteit 8 en haarcellen elektrische resonantie 9, 10, 11 in de sacculus en frequentie selectiviteit lint van het haar cel synaps 12 in de amfibie papilla.
sacculus de brulkikker is een beroep op zintuiglijke neurowetenschappers voor tal van redenen. In tegenstelling tot de zoogdieren slakkenhuis, dit orgel ligt binnen de gemakkelijk toegankelijke otic capsule. Ten tweede kan haarcellen in het orgaan gezonde enkele uren blijven onder geschikte omstandigheden 13, 14. Dit maakt experimentation op deze cellen over lange tijdschalen in verhouding tot hun zoogdieren tegenhangers. Ten derde, het orgel heeft weinig kromming, waardoor gemakkelijke manipulatie. Ten vierde, elk orgaan omvat duizend of meer haarcellen 15, die zowel een hoge doorvoer en een hoge waarschijnlijkheid van het vinden van een passende reeks haarcellen voor een gegeven experiment. Tenslotte wordt de sacculus bullfrog makkelijk gevisualiseerd door de dunheid van het orgel en grote omvang van de haarcellen.
Deze eigenschappen zorgen voor een grote veelzijdigheid voor de studie van de zintuigcellen binnen sacculus de brulkikker's. Afhankelijk van de vraag bij de hand, kan een van de verschillende experimentele preparaten worden verkregen bij de sacculus. De eenvoudigste van deze is het één kamer preparaat. Hier de sacculus geïmmobiliseerd in een kamer gevuld met kunstmatige perilymfe, natrium-rijke en calciumrijke zoutoplossing. Deze voorbereiding maakt de studie van haar cel stromen en basic haarbundel mechanica. Een tweede configuratie, de twee kamers preparaat kan worden gebruikt om spontane haarbundel bewegingen bestuderen. Hier de apicale kant van haarcellen wordt blootgesteld aan een kalium-rijke en kalkarme zoutoplossing genoemd kunstmatige endolymfe, terwijl de basolaterale kant baadt in kunstmatige perilymfe. Deze twee compartimenten na te bootsen de in vivo opstelling van salines en bieden een omgeving die het mogelijk maakt haar bundels spontaan oscilleren.
We beschrijven in dit document de voorbereiding van sacculus de brulkikker voor biofysische studie van de sensorische haarcellen. Wij bieden eerst een gedetailleerde weergave van de isolatie van dit orgel uit binnenoor van de kikker. Daarna beschrijven we zowel de één- en twee-kamer experimentele preparaten en omvatten representatieve resultaten voor elke configuratie.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij de Rockefeller University.
1. Pre-experimentele Prespanparation
- Oplossingen
- Bereid de eugenol-oplossing (2,5 g · L -1 · kg -1 kikker). Bereid de zoutoplossingen (tabel 1).
LET OP: Voor een one-kamer voorbereiding, bereiden kunstmatige perilymfe; voor een twee-kamer voorbereiding, voor te bereiden zowel kunstmatige perilymfe en kunstmatige endolymfe.
- Bereid de eugenol-oplossing (2,5 g · L -1 · kg -1 kikker). Bereid de zoutoplossingen (tabel 1).
2. Experimentele Gereedschap
- Bereiding van glas stimulatie glasvezel
- Beperk een borosilicaatglas capillair met een elektrode puller in een één-lijn te trekken met een hoge warmte en hoge snelheid. Laad de getrokken capillaire in een elektromagnetisch aangedreven puller.
- Breng de punt van de capillaire's in de richting van een filament met een glas kraalsmolt op het tot de capillaire contact maakt met de glazen kraal.
- Zet de draad aan het uiteinde van de capillair smelten in de glaskraal. Zodra een dunne brug van glas vormen tussen het capillair en de hiel, zet de gloeidraad en rond dezelfde tijd activeren van de elektromagnetische trekker.
LET OP: Dit zal trekken het glas capillair in een rechte hoek ten opzichte van de lengteas en een solide vezel. - Zorgen dat de diameter van de vezel is niet meer dan 0,5-1 urn en dat de lengte niet meer dan 100-300 urn. Als de lengte van de vezel deze dimensie overschrijdt, trim het met iris schaar. Gebruik een schaar die al saai om te voorkomen dat schade aan de dissectie tools zijn.
- Om optisch contrast verbeteren, sputteren de vacht van de vezel. Gebruik een sputter coater met een goud-palladium bron. Verticaal laden van elke vezel in een sputter coater met een taps toelopende uiteinde naar de bron. Breng de punt van de vezel op een afstand van 1-2 cm van de goud-palladium source.
- Sluit desputter coater's kamer naar een afdichting te vormen en zet hem aan. Herhaaldelijk spoelen van de omgevingslucht met argon. Na het spoelen van de lucht, verminder de druk in de kamer tot 10 Pa (70 mTorr).
- Sputteren jas in 10 s pulsen met 10 s vertraging meer dan een cursus van 120 s.
OPMERKING: tip van de vezel wordt donkerder over de duur van dit protocol als de sputter coating was een succes.
- Voorbereiding van de scherpe micro-elektroden
- Trek een glazen capillaire met een interne filament met behulp van een one-lijn high-heat pull. Elektroden moet een weerstand van 100 - 300 MQ, wanneer gevuld met 3 M KCl. Vul elke elektrode met 3 M KCl.
- Bend tip elke elektrode met de microforge om het loodrecht op de haren cel apicale oppervlak maken bij montage in de versterker headstage 16.
- Voorbereiding van de iontoforese pipetten
- Trek een glazen capillaire met een internegloeidraad een 50 MQ tip. Vul met geconcentreerde opgeloste stof (bijvoorbeeld 500 mM gentamicine sulfaat).
- Bereiding van aluminium montage vierkante
- Snij een 1 cm x 1 cm in het vierkant van aluminiumfolie. Perforeer de folie in het centrum met de punt van een pithing staaf of een ander scherp voorwerp. Vorm de perforatie zodat het cirkelvormig en ongeveer 1 mm in diameter.
- Voorbereiding van de vacuüm-vet spuit.
- Verwijder de zuiger uit een 5 ml spuit. Vul spuit uit de rug met vacuüm vet. Vervang de zuiger.
- Bereiding van polytetrafluorethyleen lijmapplicator
- Voeg een 2 mm axiaal in het uiteinde van een houten stok applicator snijden. De spleet moet in het midden van de applicator gezien end-on.
- Met scherpe schaar of een scheermesje, snij een 2 mm x 4 mm rechthoek polytetrafluoretheen uit een vel van 1 mm dikte. Gebruik een scheermesje om dunne één van de 2 mm-lange zijden van de rechthoek polytetrafluorethyleen. Vanaf het midden van de rechthoek, vermindering van de dikte van de rechthoek snijden van buiten een afschuining aan het uiteinde van de rechthoek vormen.
- Plaats de polytetrafluorethyleen rechthoek in de houten applicator sleuf zodanig dat de schuine rand is afgekeerd van de stick. Toepassen 5 min epoxy aan de basis van de polytetrafluorethyleen rechthoek om het vast te zetten. Zodat de lijm applicator harden 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Voorbereiding van de onderste helft van de twee-kamer-mount
- Machine of 3D-printen de onderste helft van de twee-kamer mount (Aanvullende bestand 2). Identificeer de diameter verzonken cirkel 20 mm aan de onderkant van de kamer.
- Een dunne laag van epoxy op het meest laterale 3 mm van de uitsparing cirkel. Breng een 18 mm ronde glazen dekglaasje op de epoxy. Sta epoxy uitharden 1h.
3. Extractie van Inner-ear Organen
- Verdoven een Amerikaanse brulkikker door het te plaatsen in een kleine emmer met eugenol verdoving oplossing gedurende 10 minuten. Pas het volume van de oplossing, zodat de kikker humero-scapulier joint ligt net boven de vloeistof-lucht-interface.
- Euthanaseren het verdoofd brulkikker door dubbel pithing.
- Pak de verdoofde kikker met een vinger boven op zijn neus en een ander onder de kaak en draai het hoofd van de kikker naar voren.
- Snel dompelen de pithing staafje in de neurocranium door het foramen magnum, die is gevonden in de middellijn tussen de kikker achterhoofd processen.
- Langzaam trekken en draai de stang totdat de punt afwijkt van het foramen magnum. Dwingen stang caudaal door de vertebrale foramina naar het ruggenmerg te vernietigen.
- Controleer of de kikker op de juiste dubbel is pithed door het observeren dat de onderste ledematen worden verlengd.
- Pak de kikker met een duim boven op de neus en wijsvinger grijpen de vomerine tanden voor een betere stabiliteit. Onthoofden de kikker door het doorsnijden van het kaakgewricht bilateraal en vervolgens loodrecht snijden om de rostrocaudale as. Om ervoor te zorgen dat de binnenste oor organen binnen de schedel intact blijven, ervoor te zorgen dat de snede is caudaal van beide timpanen.
- Met behulp van een microscoop stereodissection, voeren een middellijn doorsnijden de palatale weefsel van de vomerine tanden om de meest postérieure deel van het weefsel (Figuur 1A).
- Verbreken en duidelijk met horizontale delen van de scalpel elke spier liggen onder de palatinale weefsel om het achterste kraakbeen te onthullen. Na verwijdering van de spier, observeert de lolly vorm van temporele kraakbeenvormende de begrenzing van het otische capsule.
- Sever de columella op haar punt van contact met het kraakbeen van de otic capsule.
- Herhaaldelijk scheren dunne lagen van dit kraakbeen door het maken van shallow horizontaal doorsnijdt het. Vermijd diepe bezuinigingen op schade aan het binnenoor organen te voorkomen. Dit opent de Otic capsule gevonden binnen de lollipop structuur van de temporale kraakbeen (Figuur 1B). Binnen de Otic capsule zijn de kikker binnenoor organen (figuur 1C).
- Snijd de achterste en de zijkanten van het otische kapsel, het verzorgen van de innerlijke-ear organen niet te beschadigen. Bij de dissectie vaak vloeien zoutoplossing via binnenoor organen zodat zij ondergedompeld blijven en gehydrateerd.
- Zoek de twee cirkelvormige openingen in het slaapbeen bij de binnenste verbinding van het kraakbeen op de middellijn. Snijd omlaag door de meest mediale opening naar het slaapbeen scheuren.
- Maak een tweede neerwaartse snede door het otische kapsel op haar postero-zijrand. Verwijder het stukje kraakbeen tussen deze en de voorgaande fragment toegang tot het binnenoor organen verschaffen.
- Wrikken los het kraakbeen tussen de bezuinigingen van stap 3.8 eennd 3.9 en snijd het uit de buurt van de otic capsule. Deze actie scheidt de dichtstbijzijnde halfronde kanaal, dat vervolgens kan worden gebruikt als een handvat voor verdere manipulaties.
- Het verzorgen van de sacculus niet aan te raken, te verbreken de VIII ste hersenzenuw.
- Houd de ampulla van de dichtstbijzijnde halfronde kanaal. Voorzichtig Draai het binnenoor aan de resterende twee halfcirkelvormige kanalen bloot te leggen. Bij het blootstellen van elk kanaal, verbreken het.
- Het houden van de zenuw of een halfronde gracht ampulla, pak het binnenoor van het hoofd en plaats deze in een schaal gevuld met gekoelde zuurstofrijk kunstmatige perilymfe. Verwijdering van het binnenoor maakt visualisatie van de passages in het slaapbeen waardoor de halfcirkelvormige kanalen eenmaal gepasseerd (figuur 1D).
OPMERKING: Herhaal deze stappen om de tweede oor te halen.
4. One-kamer Voorbereiding
- Isolatie van sacculus
- Zoek de sacculus door het identificeren van de grote white massa van otoconia en de sacculaire zenuw dat ligt boven (figuur 1E). Zorg ervoor dat u fysiek traumatiseren de sacculus tijdens de volgende stappen om de integriteit van sacculaire haarcellen te handhaven.
- Knip de halfcirkelvormige kanalen naar het binnenoor meer wendbaar maken.
- Verwijder de perilymphatic stortbak die over de neurale kant van de sacculus. Maak zachte bezuinigingen rond de omtrek van de stortbak. Volgende scheiden de kleine pijlers van weefsel dat het membraan de stortbak van een brug naar de neurale kant van de sacculus.
- Verwijder de Lagena en de bijbehorende zenuw.
- Houd de zakvormig zenuw, til de sacculus en snijd door de dunne membraan van de otoconial weg. Zoals otoconia morsen uit de zak, vrij de sacculus door te snijden rond de omtrek.
LET OP: Na het isoleren van de sacculus, kunnen de overige binnenoor organen indien gewenst worden opgeslagen. Verwijdering van de sacculus vergemakkelijkt identificatie van andere structuren, zoalsde amfibieën en basilaire papillae. - Gebruik een schaar of tang om zorgvuldig weg te vegen elke otoconia nog op de sacculus. Zorg ervoor dat de sacculus niet aanraakt tijdens dit proces.
- Trim alle resterende otoconial-sac membraan vanaf de rand van het sacculus '. Dit membraan heeft de neiging om zich aan plastic en glazen oppervlakken en de verwijdering minimaliseert problemen bij de behandeling van het weefsel.
- Zachtjes stromen zoutoplossing over de sacculus met een Pasteur pipet om alle resterende otoconia (Figuur 1F) te verwijderen.
OPMERKING: Herhaal deze procedure voor de tweede sacculus, die een spiegelbeeld van de eerste is.
- Spijsvertering en montage
- Met de achterkant van een Pasteur pipet met de punt gebroken, breng de geïsoleerde sacculi een petrischaal met 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV kunstmatige perilymfe.
LET OP: Deze protease behandeling verteert de links tethering elke kinociliary bol aan de otolithicmembraan, waardoor het verwijderen van het membraan zonder de zintuighaarcellen bundels. - Incubeer het weefsel voor 30 min bij 22 ° C (of 35 minuten bij 21 ° C). Transfer elk verteerd sacculus naar een open-faced experimentele kamer en zet het weefsel met magnetische pinnen.
- Het zakvormig macula ligt direct onder de otolithic membraan en het gedeelte van de sacculus die haarcellen bevat. Identificeren en verwijder voorzichtig de bovenliggende otolithic membraan met een fijne wimpers, het verzorgen van de zakvormig macula niet aan te raken.
- Met de achterkant van een Pasteur pipet met de punt gebroken, breng de geïsoleerde sacculi een petrischaal met 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV kunstmatige perilymfe.
5. Twee-kamer Voorbereiding
- Isolatie van sacculus
- Isoleer de sacculus uit de binnenste oor organen, zoals in paragraaf 4.1.
- Montage en spijsvertering
- Vul het montageblok (Aanvullende bestand 3) met kunstmatige perilymfe en plaats de geperforeerde aluminium folie op een opening, met behulp van twee plekken van vacuumvet om het te houden op zijn plaats en vormen een zwakke afdichting.
- Transfer één sacculus aan de folie en centreren het op de top van het gat met de macula naar beneden en de zenuw stomp naar boven.
- Verwijder de zoutoplossing rondom de sacculus met een stuk verwrongen weefsel. Wick de zoutoplossing om het oppervlak van het aluminium rondom de vierkante sacculus drogen.
- Gebruik het polytetrafluorethyleen applicator cyanoacrylaat lijm om een goede afdichting langs de grens tussen de rand van de sacculus en aluminium vierkant vormen. Zorg ervoor dat de gehele omtrek van de sacculus is bedekt met lijm.
LET OP: Uitgaande te langzaam laat de cyanoacrylaatlijm te kruipen over de neurale kant van de sacculus en uiteindelijk bedekken. Het is daarom noodzakelijk om deze taak snel af te ronden. - Een druppel zoutoplossing bovenop de gemonteerde weefsel om de lijm te harden. Een dunne lijmlaag kan bovenop de druppel zoutoplossing te vormen; verwijderen met een pincet.
- Haal tHij folie van het montageblok. Flip de gemonteerde weefsel om zodat de macula kant van de sacculus kijkt omhoog en drijven het op een kunstmatige-perilymfe gevulde petrischaal.
- Voeg een druppel protease XXIV oplossing boven de macula en incubeer gedurende 30 minuten bij 22 ° C (of 35 minuten bij 21 ° C). Vul het onderste kanaal van de twee-kamer apparaten (Aanvullende file 2) met perilymfe en plaats vacuüm vet rond de centrale kamer.
- Plaats de folie aangebracht sacculus op de onderste kamer met zijn zenuw gerichte oppervlak van de Kamer. vet voeg rond de omtrek van de folie.
- Plaats de bovenste kamer (Aanvullende file 1) van het preparaat op de folie, en zorg ervoor dat een volledige afdichting met het vacuüm vet te vormen. Vul de bovenste kamer met borrelen kunstmatige endolymfe en verwijder voorzichtig de otolithic membraan met een wimper.
Representative Results
Het sensorische epitheel van de sacculus bullfrog kan worden toegepast in diverse configuraties om de fysiologie van haarcellen sonde. Omdat het weefsel relatief vlak kan zowel één- en twee-kamer preparaten worden gemonteerd. De een-kamer configuratie zorgt voor een eenvoudige setup voor elektrofysiologische en micromechanische opnames van haarcellen. De twee-kamer voorbereiding simuleert in plaats van zowel de endolymfatische en perilymfatische compartimenten op respectievelijk de apicale en basale kanten van haarcellen. Deze compartimenten bieden samen een fysiologisch relevante omgeving voor de studie van mechanotransductie door haarcellen.
De gevoeligheid en transductie eigenschappen van haarcellen ten grondslag liggen aan de elektrische respons op mechanische stimulatie. Om deze functies te onderzoeken, we tegelijkertijd opgenomen van een individuele haar cel van de positie van de bundel ende cel receptor potentiaal (Figuur 2). We hebben eerst hierbij een flexibele glasvezel naar de kinociliary bol van een haar bundel kracht pulsen toe te passen. Vervolgens gemeten verplaatsing van het haar bundel met behulp van een dubbele fotodiode systeem 2 (Figuur 2A). We tegelijkertijd het potentieel van de haren cel overgenomen door gespietst de cel met een scherpe micro-elektrode. We kregen een verplaatsing-response curve door het uitzetten van de piekspanning respons opgewekt door elk mechanische stimulus tegen overeenkomstige verplaatsing van de haarbundel's (Figuur 2B). elektrische respons van het haar cel verzadigt voor zowel positieve- en negatieve-displacement extrema. De vermindering van membraanpotentiaal met negatieve verplaatsing stappen geeft de aanwezigheid van een rustende mechanotransductie binnenwaartse stroom. Deze rust stroom wordt gemoduleerd door de werking van Ca2 + zowel snelle als langzame aanpassing 17, 18, 19, 20, 21.
Een gedrag haarcellen hangt niet alleen van de elektrische eigenschappen, maar ook van de micromechanica van de zintuighaarcellen bundel. De twee-kamerconfiguratie bootst de scheiding van endolymfe en perilymfe in vivo, waardoor ideale omstandigheden voor de studie van monteurs haarbundel's. Onder deze omstandigheden en met de otolithic membraan verwijderd, kan het haar bundels spontaan 6 oscilleren. Hier gebruikten we de twee-kamer voorbereiding op de micromechanica van afzonderlijke bundels beoordelen. We namen de spontane oscillaties van een haarbundel door gieten zijn schaduw op een dual-fotodiode verplaatsing monitor (figuur 3). Om de rol van de aminoglycoside antibiotica gentamicine op mechanotransductie beoordelen, we iontoforetisch rele ased gentamicine direct op het haar bundel (figuur 3). De concentratie vrijgegeven gentamicine stijgt evenredig met de stroom die door de micropipet. Gentamicine remt oscillaties een haarbundel en induceert een statische verschuiving van de bundel in de richting van zijn hoge kant. Deze effecten weerspiegelen de rol van gentamicine als een open-kanaal blocker dat de open toestand handhaaft van mechanotransductie kanalen, terwijl het blokkeren van hun permeatie porie. Iontoforese geladen chemicaliën vergunningen gelokaliseerd en meetbare afgifte van chemische stoffen bij verschillende concentraties in de afwezigheid van fluïdum stromingsgeïnduceerde mechanisch afbreken en daardoor uitermate geschikt voor de studie van mechanosensitieve organellen zoals haarbundel 22.
Spontane beweging A haarbundel's vloeit voort uit de wisselwerking tussen aanpassing en niet-lineaire bundel stijfheid 7,xref "> 8, 23, 24. Deze spontane beweging een handtekening van actief proces een haarbundel, dat signaalenergie omzet in mechanische arbeid viskeuze weerstand te overwinnen. haarbundels is aangetoond dat lineaire instantane stijfheid vertonen in het vestibulaire 2, auditieve 25, en laterale-line systemen 26.
We direct gemeten momentane stijfheid van een haarbundel van bullfrog de sacculus (figuur 4). Hiervoor gekoppeld wij het uiteinde van een flexibele glasvezel kinociliary lamp de haarbundel's (Figuur 4A). Leverden we krachten om de haarbundel door het verplaatsen van de basis van de vezel. De kracht van de stimulus op de vezel uitgeoefende haarbundel overeenkomt met het verschil tussen de verplaatsingen van de bas vezele en tip, vermenigvuldigd met de stijfheid van de vezel 2, 27. Het leveren van pulsen in een heel scala van krachten blijkt dat er een verband tussen de kracht op de bundel en de daaropvolgende verplaatsing van de bundel is uitgeoefend. De helling van deze kracht-verplaatsing relatie overeen met momentane stijfheid van het haar bundel's (Figuur 4A).
Deze methode konden we momentane stijfheid individuele bundel te meten als functie van de vervorming (figuur 4B). De momentane kracht-verplaatsing curve toont een lineaire relatie, onthullen een lineaire stijfheid van de bundel over een bereik van ongeveer 20 nm rond zijn ruststand. Buiten dit bereik, het haar bundel gedraagt zich als een Hookean materiaal, de stijfheid lineair voor grote-magnitude vervormingen.
Deze resultaten demonstwaardeert de veelzijdigheid van de brulkikker sacculus in de studie van haar cel fysiologie. Met behulp van deze en andere preparaten kan men mechanotransductie in meerdere trappen verkennen in de overdracht van informatie van de bundel naar de hersenen.
Figuur 1: Dissectie van binnenoor de Bullfrog's. (A) Het bekijken van gehemelte van de brulkikker's uit de ventrale kant maakt de identificatie van de buis van Eustachius (cirkel). Laterale reflectie van de huid die de rechterkant van het gehemelte onthult de locatie van het binnenoor (gestippelde rechthoek). (B) het verwijderen van het kraakbeen aan de buikzijde van slaapbeen de kikker opent de Otic capsule (stippellijn). (C) getoond is een sterkere vergroting van het beeld otische capsule, waarin de sacculus, Lagena, CN VIII en SACC heid op zenuw kan gemakkelijk worden geïdentificeerd. (D) Een weergave van de otic capsule na het verwijderen van het binnenste oor organen onthult de locaties van de halfcirkelvormige kanalen. (E) Na verwijdering van het geïsoleerde binnenoor, de sacculus, Lagena en VIII th craniale zenuwen (CN VIII) kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. (F) De geïsoleerde sacculus bezit een korte stronk van de zakvormig zenuw en een otolithic membraan ligt bovenop de sensorische epitheel. Labels komen overeen met de (i) sacculus, (ii) Lagena, (iii) CN VIII, (iv) zakvormige zenuw, en (v) otolithic membraan. Axis labels P en A komen overeen met de achterste en voorste richtingen. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 cm (A, B), 1 mm (C, D, E) en 400 urn (F).
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
s "target =" _ blank "> Klik hier om een vector-versie van dit cijfer te downloaden.
Figuur 2: Displacement-response curve voor een Single Hair Cell. (A) De punt van een glazen stimulus vezel werd gekoppeld aan de kinociliary bol van een haarbundel en basis van de vezel werd vervolgens verplaatst in negen afzonderlijke stappen. positie van de bundel werd gevolgd op een dual-fotodiode systeem en zijn receptor potentiaal werd gelijktijdig gemeten met een micro-elektrode waarvan de productie werd door een versterker in bridge mode. tip weerstand van de elektrode was 95 MQ en de bundel van de rust membraanpotentiaal was -47 mV. (B) Een grafiek van de bundel de receptor potentiaal als functie van zijn verplaatsing onthult een lineaire respons tussen de bundel en depositie. Elk punt waarvan het gemiddelde potentiaal en de gemiddelde verplaatsing over een 2,5 ms venster, beginnend 2,5 ms na het begin van mechanische stimulatie. Elke kleur staat voor een set van tijdreeksen corresponderen met dezelfde cilinderinhoud pols.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Klik hier om een vector-versie van dit cijfer te downloaden.
Figuur 3: Effect van gentamicine spontane haarbundel Oscillation. De spontane beweging van een haarbundel in een twee-kamer preparaat werd opgenomen met een dubbele fotodiode systeem. Aangezien iontoforetische afgifte van gentamicine (0 nA), het haarbundel toont symmetrische oscillaties. Als de magnitude van stroom geleid door een iontoforetische pipet gevuld met 500 mM gentamicinesulfaat groeit (10 nA, 20 nA), de frequentie van haar bundel excursies valt op een dosis-afhankelijke wijze en de bundel is verschoven naar zijn hoge rand langer tijds perioden.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Klik hier om een vector-versie van dit cijfer te downloaden.
Figuur 4. Het berekenen van een haarbundel's Onmiddellijke stijfheid. (A) Een stimulus vezel (rood) stijfheid K F gekoppeld to de kinociliary bol (bruin) van een individu haarbundel (geel). Verplaatsen van de voet van de vezel een bekende afstand X F veroorzaakt dat de bundel op een afstand X B bewegen. Het verschil tussen de verplaatsingen van de vezel en de bundel is evenredig met de kracht op de bundel van de stimulus vezel F F uitgeoefend. Herhaling van dit een heel scala van krachten levert een ogenblikkelijke kracht-verplaatsing relatie (rechts), de helling van die overeenkomt met momentane stijfheid van de haarbundel's. (B) Een individuele bundel werd onderworpen aan pulsen van toenemende omvang en de schuifkracht in de eerste 50 ms na het begin puls werd gemeten (blauwe vlekken). Hier geeft de haarbundel een lineaire momentane stijfheid over een bereik van ongeveer 20 nm rond zijn ruststand. De rode kromme correspondeert met een fit aan de relatie F = k * X - 60 * z * (1 / (1 + exp (- z * (X - X 0) / (k B * T))) + F 0, waarbij F de kracht op de bundel, X de bundel van verplaatsing, k = 790 ± 51 μN ∙ m -1 is de bundel constante stijfheid wanneer alle kanalen zijn ofwel gesloten of open, z = 0,43 ± 0,04 pN is de kracht van een enkele gating lente, X 0 = 2 ± 1,9 nm is het standpunt van de bundel bij die 50% van de kanalen zijn open, k B is Boltzmann constante, T de temperatuur en F 0 = 11,7 ± 1,3 pN is een offset kracht. De pasvorm heeft een determinatiecoëfficiënt van 0,98. De stimulans vezel had een stijfheid van 107 μN ∙ m -1.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> Klik hier om een vector-versie van dit cijfer te downloaden.
| opgeloste stof | Formule Gewicht (g / mol) | Voeg toe aan 1 L | |
| kunstmatige perilymfe | kunstmatige endolymfe | ||
| NaCl | 58.4 | 6,54 g | 0,117 g |
| KCl | 0,149 | 0,149 g | 8,62 g |
| CaCl2 ⦁ 2H 2 O | 147 | 2 ml 1 M CaCl2 voorraad | 250 ul van 1 M CaCl2 voorraad |
| HEPES | 238,3 | 1,19 g | 1,19 g |
| D - (+) - glucose | 180,2 | 0,541 g | 0. 541 g |
Tabel 1. Oplossingen voor Dissection en Experimentele Voorbereiding. In deze tabel zijn de recepten voor kunstmatige perilymfe en kunstmatige endolymfe oplossingen gebruikt in de dissectie en in één- of twee-kamer-preparaten. De oplossingen moeten op pH 7,2 gebracht - 7,4 met ongeveer 2 ml NaOH (perilymfe) of 2 ml KOH (endolymfe). De osmotische kracht moet ongeveer 230 mmol lezen · kg -1 als gevolg van onvolledige ionische dissociatie.
Discussion
Binnen sacculus de brulkikker's liggen enkele duizenden gemakkelijk toegankelijke sensorische haarcellen. Hier laten we zien winning en het wassen van de sacculus voor één- en twee-kamer-opnames. Beide preparaten mogelijk zowel micromechanische en elektrofysiologische studies van haarcellen en de bijbehorende bundels. Omdat het weefsel kan overleven gedurende enkele uren met frequente vervanging van zuurstofrijk zoutoplossing kan experimenten voortgezet lange duur. Haarcellen in deze preparaten gewoonlijk blijven nog gedurende microelektrode opname voor maximaal 6 uur na sectie terwijl haarbundels spontaan oscilleren tot 24 uur na extractie.
Succesvolle extractie en montage van de sacculus scharnieren na het overwinnen van een aantal gemeenschappelijke uitdagingen. Ten eerste moet direct contact met het apicale oppervlak van het zakvormig macula gedurende de bereidingsprocedure worden vermeden. De zakvormig zenuw is een handige handgreep voor een veilige manipuning van de sacculus. Eenmaal bevrijd van de rest van het binnenoor organen, zijn sacculus worden overgebracht met een grote diameter pipet terwijl de resterende ondergedompeld in fluïdum mechanische schade aan het sensorische epitheel voorkomen. De verwijdering van otoconia van de macula-oppervlak moet worden voltooid zonder mechanische schade aan de haarcellen. Omdat de otoconia rechtstreeks liggen boven op de macula, kunnen haarcellen worden beschadigd door toevallig contact tussen dissectie-instrumenten en de otolithic membraan tijdens het verwijderen van otoconia. Om schade te voorkomen, adviseren wij de geleiachtige massa van otoconia ver worden gehouden op een locatie in de macula en verwijderd als een enkele massa. Vermijdt fragmentatie van de otoconial massa in talrijke clusters, die elk afzonderlijk worden geëxtraheerd. Als kleine clusters van otoconia blijven zij kunnen worden verwijderd met zachte fluïdumdruk door een Pasteur pipet opgeleverd. Een laatste uitdaging omvat de vorming van een afdichting tussen de sacculus en aluminium montage plein in detwee-kamer voorbereiding. Gebruikmakend van een vierkant met een perforatie klein genoeg om overlapping van ongeveer 100 urn tussen de sacculus en het omliggende aluminium is een volledige afdichting van het weefsel mogelijk. De lijm dient om een afdichting te vormen in contact worden gebracht met ongeveer 100 urn zakvormig weefsel rond de omtrek van de macula.
De concentratie van vrij Ca2 + is een belangrijke overweging bij de studie van haarcellen. Ca2 + regelt zowel snelle als langzame aanpassing, waardoor het bepalen van de kinetiek van de mechanotransductie inrichting en de eigenschappen van de actieve-proces fenomenen haarbundel, waaronder spontane beweging bundel 8, 23. Endolymphatic calcium in vivo aanwezig is in 250 uM derhalve de fysiologisch relevante kinetiek worden beoordeeld in deze concentratie (Maunsell JHR, R. Jacobs en AJ Hudspeth. Unpublished waarnemingen 16). Echter, micro-elektrode opnames van haarcellen is een externe calciumconcentratie dan 2 mM voor een goede afdichting van de celmembraan rond de micro-elektrode. Het is daarom noodzakelijk om een high-calcium zout te gebruiken voor deze experimenten. Tenslotte kan men wensen om de effecten van externe calcium op mechanotransductie met verschillende calciumconcentraties bestuderen. In deze gevallen is het belangrijk om te onthouden dat calcium concentraties onder 1 uM doorgaans leiden tot tip-koppeling scheuren en onomkeerbaar verlies van transductie 28.
De twee hier beschreven experimentele voorbereidingen zorgen voor een reeks biofysische metingen aan haarcellen. Echter, kunnen bijkomende metingen worden uitgevoerd met lichte wijzigingen aan deze voorbereidingen. In de gevouwen sacculaire voorbereiding, zijn haar bundels lateraal gevisualiseerd. Imaging hair-bundel beweging vanuit dit gezichtspunt onthult samenhangend motion van zowel korte als lange stereocilia 29. Hier het zakvormig macula wordt eerst gescheiden van het onderliggende weefsel en vervolgens langs de door het zakvormig zenuw zodat haarbundels buiten wijzen en zijdelings zichtbaar bij de vouw as gevouwen. Een tweede wijziging, hair-cel dissociatie, stelt de studie van zowel de haren cel bundel en de soma. Haarcellen mechanisch gedissocieerd op een glasplaatje voor beeldvorming en elektrofysiologische opname 30. Tenslotte kan haarcellen worden geëxtrudeerd uit het epitheel door daarbij een vergelijkbare dissociatie protocol, maar zonder mechanische dissociatie stap. Deze behandeling resulteert in haarcellen die geleidelijk extruderen uit van het epitheel, het verstrekken van basolaterale toegang voor elektrofysiologische opnames terwijl het minimaliseren van mechanische schade. Deze preparaten en hun vele wijzigingen tonen de veelzijdigheid van de kikker sacculus als een modelsysteem voor de biofysischestudie van sensorische haarcellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
