Summary
अमेरिकी Bullfrog का (राणा catesbeiana) sacculus बाल-सेल शरीर क्रिया विज्ञान के प्रत्यक्ष परीक्षा दे सकते हैं। यहाँ विच्छेदन और biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी में वर्णित है। हम इन बालों की कोशिकाओं से प्रतिनिधि प्रयोगों, एक बंडल के बल विस्थापन संबंध की गणना और उसके unforced गति की माप सहित दिखा।
Abstract
सुनवाई और संतुलन के अध्ययन के मॉडल प्रणाली की biophysical अध्ययन से तैयार की अंतर्दृष्टि पर टिकी हुई है। ऐसा ही एक मॉडल, अमेरिकी Bullfrog की sacculus, श्रवण और vestibular अनुसंधान का एक मुख्य आधार बन गया है। इस अंग की पढ़ाई कैसे संवेदी कोशिकाओं बाल सक्रिय रूप से पर्यावरण से संकेतों का पता लगाने कर सकते हैं पता चला है। क्योंकि इन अध्ययनों के, अब हम बेहतर यांत्रिक gating और एक बाल सेल के पारगमन चैनलों, यांत्रिक रूपांतर में कैल्शियम की भूमिका के स्थानीयकरण, और बाल सेल धाराओं की पहचान को समझते हैं। यह अत्यधिक सुलभ अंग बालों की कोशिकाओं के कामकाज में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी है। यहाँ हम अपने बालों की कोशिकाओं पर biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी का वर्णन है। हम पूरा विच्छेदन प्रक्रिया में शामिल हैं और विशिष्ट संदर्भों में sacculus की तैयारी के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम इसके अतिरिक्त की गणना सहित इस तैयारी का उपयोग प्रतिनिधि परिणामों में शामिलएक बाल बंडल के तात्कालिक बल विस्थापन संबंध और एक बंडल के सहज दोलन की माप।
Introduction
स्तनधारियों की acousticolateralis अंगों एक जटिल संरचना के अधिकारी और एक संरचनात्मक आला कि उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है के भीतर झूठ बोलते हैं। उदाहरण के लिए, स्तनधारी कोक्लीअ एक चढ़ती भूलभुलैया शामिल हैं और मोटी अस्थायी हड्डी के भीतर एम्बेडेड है। कोक्लीअ के अलगाव अक्सर यह भीतर झूठ बोल संवेदी कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति का कारण बनता है और इसलिए एक मुश्किल काम है 1 साबित हो गया है। Neuroscientists इस प्रकार सिस्टम जो और अधिक आसानी से कान के गर्भगृह से निकाले जाते हैं मॉडल के लिए खड़ा हो गया है।
इन मॉडल प्रणालियों में से एक है, अमेरिकी Bullfrog (राणा catesbeiana) की sacculus, दशकों श्रवण और vestibular प्रणाली के समारोह में generalizable अंतर्दृष्टि झुकेंगे के लिए है। sacculus दोनों कम आवृत्ति सुनवाई और भूकंपीय अनुभूति में संवेदी भूमिकाओं के साथ एक मिश्रित समारोह अंग है। sacculus का संवेदी कोशिकाओं को अपने बालों की कोशिकाओं, विशेष ट्रांसड्यूसर कि यांत्रिक ऊर्जा में परिवर्तित कर रहे हैंहमारे श्रवण और vestibular अंगों के भीतर विद्युत संकेतों में। प्रत्येक बाल सेल के शिखर सतह से पेश एक mechanosensitive बाल बंडल कि stereocilia बुलाया बढ़े microvilli के एक वर्गीकृत गुच्छा शामिल है। आसन्न stereocilia के सुझावों filamentous टिप-लिंक प्रोटीन से जुड़े रहते हैं कि यांत्रिक उत्तेजनाओं 2, 3 के जवाब में यंत्रवत् गेट आयन चैनल। हालांकि श्रवण और vestibular अंगों उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार का जवाब है, वे एक आम का पता लगाने तंत्र का हिस्सा है। यह समानता कई अंतर्दृष्टि Bullfrog sacculus के अध्ययन के माध्यम से बाल-सेल mechanotransduction में प्राप्त की underlies। उदाहरण के लिए, बाल सेल के सक्रिय प्रक्रिया इस अंग 4, 5, 6, 7 में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और बाल बंडल एक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया को रोजगार यांत्रिक उत्पादन करने के लिएकाम। इतना ही नहीं यह दिखाया गया है कि बालों की कोशिकाओं सक्रिय काम 6 उत्पन्न है, लेकिन अलग-अलग सक्रिय प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र और एक बाल सेल की ट्यूनिंग विशेषताओं अंगों acousticolateralis Bullfrog के अध्ययन के माध्यम से अनावरण किया गया है। इन सक्रिय बाल बंडल गतिशीलता 8 और बाल सेल विद्युत अनुनाद 9, 10, sacculus में 11 और आवृत्ति चयनात्मकता उभयचर papilla में बाल सेल के रिबन अन्तर्ग्रथन 12 में शामिल हैं।
Bullfrog के sacculus कई कारणों के लिए संवेदी neuroscientists के लिए अपील की। स्तनधारी कोक्लीअ के विपरीत, इस अंग आसानी से सुलभ कान का कैप्सूल के भीतर निहित है। दूसरा, इस अंग के भीतर बालों की कोशिकाओं, 14 उपयुक्त परिस्थितियों 13 के तहत कई घंटे के लिए स्वस्थ रह सकते हैं। इस experimentat परमिटउनकी स्तनधारी समकक्षों के सापेक्ष लंबे समय से timescales पर इन कोशिकाओं पर आयन। तीसरा, अंग थोड़ा टेढ़ापन भालू, आसान हेरफेर की अनुमति है। चौथा, प्रत्येक अंग एक उच्च throughput और एक भी प्रयोग के लिए बालों की कोशिकाओं का एक उचित सेट लगाने का एक उच्च संभावना दोनों उपलब्ध कराने, एक हजार या उससे अधिक बालों की कोशिकाओं 15 शामिल हैं। अंत में, Bullfrog के sacculus आसानी से इस अंग और अपने बालों की कोशिकाओं के बड़े आकार का दुबलापन के कारण कल्पना की है।
इन गुणों के Bullfrog sacculus भीतर संवेदी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए महान बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं। हाथ पर सवाल पर निर्भर करता है, कई प्रयोगात्मक तैयारियों में से एक sacculus से प्राप्त किया जा सकता है। इनमें से सबसे आसान एक चैम्बर तैयारी है। यहाँ sacculus कृत्रिम perilymph, एक सोडियम युक्त और उच्च कैल्शियम नमक से भरे एक कक्ष में स्थिर है। यह तैयारी बाल सेल धाराओं और बुनियादी बाल बंडल यांत्रिकी के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। एक दूसरा विन्यास, दो कक्ष तैयारी, सहज बाल बंडल आंदोलनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां बालों की कोशिकाओं के शिखर की ओर एक पोटेशियम से भरपूर और कैल्शियम-गरीब खारा के संपर्क में है कृत्रिम endolymph करार दिया, जबकि basolateral ओर कृत्रिम perilymph में नहाया है। इन दो डिब्बों Salines के vivo व्यवस्था की नकल और एक वातावरण है कि बाल बंडलों अनायास दोलन करने की अनुमति देता है प्रदान करते हैं।
हम इस पत्र में अपनी संवेदी बालों की कोशिकाओं की biophysical अध्ययन के लिए Bullfrog के sacculus की तैयारी का वर्णन है। हम पहले मेंढक के भीतरी कान से इस अंग के अलगाव की एक विस्तृत चित्रण प्रदान करते हैं। हम तो दोनों एक और दो चैम्बर प्रयोगात्मक तैयारियों का वर्णन है और प्रत्येक विन्यास के लिए प्रतिनिधि परिणाम शामिल हैं।
Protocol
आचार कथन: सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) रॉकफेलर विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. पूर्व प्रयोगात्मक Prespanparation
- समाधान की
- Eugenol समाधान तैयार (2.5 ग्राम · एल -1 · किलो -1 मेंढक)। खारा समाधान (तालिका 1) तैयार करें।
नोट: एक एक कक्ष तैयारी के लिए, कृत्रिम perilymph तैयार; एक दो कक्ष तैयार करने के लिए, दोनों कृत्रिम perilymph और कृत्रिम endolymph तैयार करते हैं।
- Eugenol समाधान तैयार (2.5 ग्राम · एल -1 · किलो -1 मेंढक)। खारा समाधान (तालिका 1) तैयार करें।
2. प्रायोगिक उपकरण
- कांच उत्तेजना फाइबर की तैयारी
- उच्च गर्मी और उच्च वेग के साथ एक एक लाइन खींचने में एक इलेक्ट्रोड खींचने के साथ एक borosilicate ग्लास केशिका संकीर्ण। एक solenoid संचालित खींचने में खींच लिया केशिका लोड।
- एक गिलास मनका के साथ एक रेशा की ओर केशिका की नोक लाओकेशिका संपर्कों गिलास मनका जब तक इसे पर पिघल गए।
- रेशा को चालू गिलास मनका में केशिका की नोक पिघला। एक बार जब केशिका और मनका के बीच कांच रूपों की एक पतली पुल, रेशा बंद कर देते हैं और एक ही समय के आसपास solenoid खींचने को सक्रिय करें।
नोट: यह अपने लंबे अक्ष के लिए एक सही कोण पर कांच केशिका खींचने के लिए और एक ठोस फाइबर का निर्माण करेगा। - सुनिश्चित करें कि फाइबर का व्यास कोई 0.5 की तुलना में अधिक है - 1 माइक्रोन और इसकी लंबाई 100 से अधिक नहीं है कि - 300 माइक्रोन। फाइबर की लंबाई इस आयाम से अधिक है, आईरिस कैंची से यह ट्रिम। कैंची कि पहले से ही विच्छेदन उपकरण को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए सुस्त हैं का प्रयोग करें।
- ऑप्टिकल विपरीत बढ़ाने के लिए, कोट फाइबर धूम। एक सोने पैलेडियम स्रोत के साथ एक धूम coater का प्रयोग करें। खड़ी स्रोत के प्रति अपनी पतला अंत के साथ एक धूम coater में प्रत्येक फाइबर लोड। सोने-पैलेडियम स्रोत से 2 सेमी - 1 की दूरी के लिए फाइबर की नोक लाओ।
- बंद करोcoater के कक्ष धूम एक मुहर फार्म और यह मोड़ पर है। बार बार आर्गन साथ परिवेशी वायु को बाहर निकलवाने। हवा निस्तब्धता के बाद, 10 Pa (70 mTorr) को कक्ष के भीतर दबाव को कम।
- 120 S के एक कोर्स पर 10 एस देरी के साथ 10 एस दालों में कोट धूम।
नोट: फाइबर की नोक इस प्रोटोकॉल की अवधि से अधिक काला कर देगा, तो धूम कोटिंग एक सफलता थी।
- तेज microelectrodes की तैयारी
- एक पंक्ति उच्च गर्मी पुल का उपयोग करते हुए एक आंतरिक रेशा के साथ एक गिलास केशिका खींचो। 300 MΩ जब 3 एम KCl के साथ भरा - इलेक्ट्रोड 100 के प्रतिरोध करना चाहिए था। 3 एम KCl के साथ प्रत्येक इलेक्ट्रोड भरें।
- बेंड microforge के साथ प्रत्येक इलेक्ट्रोड की नोक यह बाल सेल शिखर सतह को सीधा जब एम्पलीफायर headstage 16 में घुड़सवार प्रस्तुत करना।
- योणोगिनेसिस pipettes की तैयारी
- एक आंतरिक के साथ एक गिलास केशिका खींचोएक 50 MΩ टिप करने के लिए रेशा। केंद्रित घुला हुआ पदार्थ (जैसे, 500 मिमी जेंटामाइसिन सल्फेट) के साथ भरें।
- एल्यूमीनियम बढ़ते वर्ग की तैयारी
- एल्यूमीनियम पन्नी की एक 1 सेमी एक्स 1 सेमी वर्ग में कटौती। एक pithing रॉड या अन्य तेज वस्तु की नोक के साथ केंद्र में पन्नी छेदना। छेदों आकार इतना है कि यह परिपत्र और व्यास में लगभग 1 मिमी है।
- वैक्यूम तेल से भरे सिरिंज की तैयारी।
- 5 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें। वैक्यूम तेल के साथ पीछे से सिरिंज भरें। सवार बदलें।
- Polytetrafluoroethylene गोंद applicator की तैयारी
- एक 2 मिमी लंबे अक्षीय एक लकड़ी के applicator छड़ी के अंत में कटौती करें। जब अंत पर देखा भट्ठा applicator के केंद्र में होना चाहिए।
- तेज कैंची या एक धार के साथ, 1 मिमी मोटाई की एक चादर से polytetrafluoroethylene की एक 2 मिमी x 4 मिमी आयत काटा। polytetrafluoroethylene आयत 2 मिमी लंबी किनारों की पतली एक के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। आयत के बीच में प्रारंभ हो, जावक टुकड़ा करने की क्रिया आयत की नोक पर एक उठाव के लिए फार्म से आयत की मोटाई कम।
- लकड़ी के applicator भट्ठा ऐसे में polytetrafluoroethylene आयत डालें कि beveled बढ़त छड़ी से दूर का सामना करना पड़ता। यह जगह में सुरक्षित करने के लिए polytetrafluoroethylene आयत के आधार पर 5 मिनट epoxy लागू करें। गोंद applicator कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इलाज के लिए अनुमति दें।
- दो कक्ष के निचले आधे की तैयारी माउंट
- मशीन या 3 डी मुद्रित दो कक्ष के निचले आधे माउंट (पूरक फ़ाइल 2)। कक्ष की निचली सतह पर 20 मिमी व्यास recessed चक्र को पहचानें।
- अवकाश सर्कल के पार्श्व सबसे 3 मिमी के लिए epoxy की एक पतली परत लागू करें। epoxy पर एक 18 मिमी परिपत्र गिलास coverslip लागू करें। epoxy 1 के लिए इलाज करने की अनुमतिज।
3. भीतरी कान अंगों की निकासी
- 10 मिनट के लिए eugenol संवेदनाहारी समाधान युक्त एक छोटे से बाल्टी में रखकर एक अमेरिकी Bullfrog anesthetize। समाधान की मात्रा समायोजित करें ताकि सिर्फ तरल हवा अंतरफलक ऊपर मेंढक humero-स्कंधास्थि संयुक्त निहित है।
- डबल pithing द्वारा anesthetized Bullfrog euthanize।
- जबड़े के नीचे अपनी नाक के ऊपर एक उंगली और एक अन्य के साथ anesthetized मेंढक समझ और मेंढक के सिर को आगे घुमाएगी।
- तेजी से रंध्र मैग्नम, मेंढक के पश्चकपाल प्रक्रियाओं के बीच midline पर पाया जाता है जिसके माध्यम से कपाल तिजोरी में pithing रॉड उतर रही है।
- धीरे-धीरे वापस लेने और रॉड से बारी बारी से जब तक इसकी टिप रंध्र मैग्नम से रवाना। कशेरुकी foramina दुमदारी के माध्यम से रॉड सेना रीढ़ की हड्डी को नष्ट करने की।
- पुष्टि करें कि मेंढक ठीक से दोगुना देख रहा है कि इसकी कम पांव बढ़ा रहे हैं द्वारा pithed कर दिया गया है।
- नाक और पहली उंगली स्थिरता में सुधार के लिए vomerine दांत लोभी के ऊपर एक अंगूठे के साथ मेंढक समझ। द्विपक्षीय temporomandibular संयुक्त विच्छेद और बाद में rostrocaudal धुरी के orthogonally काटने से मेंढक सिर काटना। विश्वास दिलाता हूं कि खोपड़ी के भीतर भीतरी कान अंगों बरकरार रहेगा, यह सुनिश्चित करें कि कटौती दोनों तीम्प्न के लिए दुम है।
- एक stereodissection माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक midline ऊतक (चित्रा 1 ए) के सबसे पीछे हद तक vomerine दांत से तालु के ऊतकों के माध्यम से कटौती निष्पादित।
- तोड़ और छुरी की क्षैतिज कटौती किसी भी मांसपेशियों के ऊतकों तालु के नीचे झूठ बोल पीछे उपास्थि प्रकट करने के साथ साफ है। मांसपेशी को हटाने के बाद, अस्थायी उपास्थि कान का कैप्सूल की सीमा बनाने का लॉलीपॉप आकार निरीक्षण करते हैं।
- कान का कैप्सूल की उपास्थि के साथ संपर्क की अपनी बात पर स्तम्भिका तोड़।
- बार बार shallo बनाकर यह उपास्थि की पतली परत दाढ़ीइसके माध्यम से डब्ल्यू क्षैतिज कटौती। भीतरी कान अंगों को नुकसान को रोकने के लिए गहरी कटौती से बचें। यह अस्थायी उपास्थि (चित्रा 1 बी) का लॉलीपॉप संरचना के भीतर पाया कान का कैप्सूल खुल जाता है। कान का कैप्सूल के भीतर मेंढक के भीतरी कान अंगों (चित्रा 1 सी) कर रहे हैं।
- पीछे और कान का कैप्सूल के पार्श्व किनारों ट्रिम, देखभाल करने के भीतरी कान अंगों को नुकसान नहीं। विच्छेदन के दौरान, अक्सर भीतरी कान अंगों पर खारा प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए कि वे जलमग्न और हाइड्रेटेड रहना।
- midline के लिए उपास्थि की औसत दर्जे का कनेक्शन पर अस्थायी हड्डी में दो परिपत्र के उद्घाटन का पता लगा। सबसे औसत दर्जे का उद्घाटन के माध्यम से नीचे कट लौकिक हड्डी टूटना करने के लिए।
- इसकी postero पार्श्व किनारे पर कान का कैप्सूल के माध्यम से एक दूसरे के नीचे कटौती करें। इस और पिछले कटौती के बीच उपास्थि का टुकड़ा हटाये भीतरी कान अंगों के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए।
- जिज्ञासा कटौती के बीच उपास्थि ढीला कदम 3.8 एक सेएन डी 3.9 और इसे दूर कटौती कान का कैप्सूल से। यह कार्रवाई निकटतम semicircular नहर, जो फिर आगे जोड़तोड़ के लिए संभाल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता severs।
- Sacculus छूने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, आठवीं वें कपाल तंत्रिका तोड़।
- निकटतम semicircular नहर का कलसा पकड़ो। धीरे शेष दो semicircular नहरों को बेनकाब करने के भीतरी कान घुमाएगी। प्रत्येक नहर को उजागर करने पर, यह तोड़।
- तंत्रिका या एक semicircular नहर कलसा होल्डिंग, सिर से भीतरी कान निकालने के लिए और ठंडा ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम perilymph से भरा एक डिश में जगह है। भीतरी कान का हटाया अस्थायी हड्डी के माध्यम से जो semicircular नहरों एक बार पारित कर दिया (चित्रा -1) के भीतर मार्ग के दृश्य परमिट।
ध्यान दें: दूसरे कान से निकालने के लिए इन चरणों को दोहराएँ।
4. एक-चैंबर तैयार
- Sacculus का अलगाव
- अपने बड़े कण की पहचान के द्वारा sacculus का पता लगाएँotoconia की ई द्रव्यमान और saccular तंत्रिका (चित्रा 1E) के ऊपर है कि यह निहित है। शारीरिक रूप से आदेश saccular बालों की कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखने के लिए निम्न चरणों के दौरान sacculus घाव नहीं ख्याल रखना।
- semicircular नहरों ट्रिम भीतरी कान अधिक maneuverable प्रस्तुत करना।
- perilymphatic तालाब sacculus के तंत्रिका पक्ष overlying निकालें। तालाब की परिधि के आसपास कोमल कटौती करें। अगली ऊतक के छोटे खंभे कि sacculus के तंत्रिका ओर करने के लिए तालाब की झिल्ली को पाटने तोड़।
- Lagena और उसके संबंधित तंत्रिका निकालें।
- saccular तंत्रिका होल्डिंग, धीरे sacculus उठा और otoconial थैली की पतली झिल्ली के माध्यम से कटौती। थैली से बाहर otoconia फैल के रूप में, अपनी परिधि के आसपास काटने से sacculus मुक्त।
नोट: sacculus को अलग-थलग करने के बाद, शेष भीतरी कान अंगों अगर वांछित बचाया जा सकता है। sacculus का हटाया जैसे अन्य संरचनाओं, की पहचान आसान बनाता हैउभयचर और आधारी papillae। - कैंची या संदंश का प्रयोग सावधानी से किसी भी sacculus पर शेष otoconia पोंछ लिए। इस प्रक्रिया के दौरान sacculus को छूने के लिए नहीं ख्याल रखना।
- sacculus 'किनारे से किसी भी शेष otoconial थैली झिल्ली ट्रिम। यह झिल्ली प्लास्टिक और कांच सतहों का पालन करने के लिए जाता है और इसकी हटाने के ऊतकों से निपटने में चुनौतियों को कम करता है।
- धीरे sacculus खत्म खारा प्रवाह पाश्चर विंदुक के साथ किसी भी शेष otoconia (चित्रा 1F) को हटा दें।
नोट: दूसरा sacculus है, जो पहले के एक दर्पण छवि है के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- पाचन और बढ़ते
- इसकी टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक टूट के पीछे के अंत का उपयोग करना, कृत्रिम perilymph में 67 मिलीग्राम ∙ एल -1 प्रोटीज XXIV के 3 एमएल युक्त एक पेट्री डिश के लिए पृथक sacculi हस्तांतरण।
नोट: यह प्रोटीज उपचार otolithic करने के लिए प्रत्येक kinociliary बल्ब tethering लिंक हज़मझिल्ली, संवेदी बाल बंडलों को नुकसान पहुँचाए बिना झिल्ली को हटाने के लिए सक्षम करने से। - 22 डिग्री सेल्सियस (या 21 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट) पर 30 मिनट के लिए ऊतक सेते हैं। एक खुला का सामना करना पड़ा प्रायोगिक कक्ष के लिए प्रत्येक पचा sacculus स्थानांतरण और चुंबकीय पिन के साथ ऊतक सुरक्षित।
- saccular मैक्युला सीधे otolithic झिल्ली के नीचे स्थित है और sacculus बालों की कोशिकाओं में शामिल है कि का हिस्सा है। यह पहचानें और ध्यान से अपने overlying otolithic झिल्ली ठीक एक बरौनी का उपयोग कर हटाने, देखभाल करने के saccular मैक्युला को छूने के लिए नहीं।
- इसकी टिप के साथ एक पाश्चर विंदुक टूट के पीछे के अंत का उपयोग करना, कृत्रिम perilymph में 67 मिलीग्राम ∙ एल -1 प्रोटीज XXIV के 3 एमएल युक्त एक पेट्री डिश के लिए पृथक sacculi हस्तांतरण।
5. दो चैंबर तैयार
- Sacculus का अलगाव
- धारा 4.1 में के रूप में भीतरी कान अंगों से sacculus अलग।
- बढ़ते और पाचन
- कृत्रिम perilymph के साथ बढ़ते ब्लॉक (पूरक फ़ाइल 3) भरें और एक खोलने पर छिद्रित एल्यूमीनियम पन्नी जगह है, शून्य के दो स्थानों का उपयोग करयह जगह में पकड़ और एक कमजोर सील फार्म तेल।
- स्थानांतरण पन्नी के लिए एक sacculus और मैक्युला नीचे का सामना करना पड़ और तंत्रिका स्टंप का सामना करना पड़ के साथ छेद के शीर्ष पर केंद्र।
- मुड़ ऊतक का एक टुकड़ा के साथ sacculus आसपास के खारा निकालें। खारा sacculus आसपास एल्यूमीनियम वर्ग की सतह सूखी बाती।
- sacculus के किनारे और एल्यूमीनियम वर्ग के बीच सीमा के साथ एक तंग सील फार्म cyanoacrylate गोंद लागू करने के लिए polytetrafluoroethylene applicator का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि sacculus के पूरे परिधि गोंद के साथ कवर किया जाता है।
नोट: भी धीरे धीरे आगे बढ़ने से cyanoacrylate गोंद sacculus के तंत्रिका किनारे पर रेंगना और अंत में इसे कवर की अनुमति देता है। यह इस कार्य को तेजी से पूरा करने के लिए इसलिए जरूरी है। - घुड़सवार ऊतक के शीर्ष पर खारा की एक बूंद गोंद का इलाज करने के लिए रखें। गोंद की एक पतली फिल्म खारा की बूंद के शीर्ष पर फार्म हो सकता है; संदंश के साथ इसे हटा दें।
- ध्यान से टी को दूरवह बढ़ते ब्लॉक से पन्नी। खत्म घुड़सवार ऊतक फ्लिप इतना है कि sacculus की धब्बेदार ओर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ता है और एक कृत्रिम perilymph से भरे पेट्री डिश पर तैरने लगते हैं।
- मैक्युला के शीर्ष पर प्रोटीज पूरा समाधान की एक बूंद जोड़ें और 22 डिग्री सेल्सियस (या 21 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट) पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। दो कक्ष तंत्र (पूरक फ़ाइल 2) केन्द्रीय कक्ष के आसपास perilymph और जगह वैक्यूम तेल के साथ के निचले नहर भरें।
- अपने तंत्रिका चैम्बर की सतह का सामना करना पड़ के साथ निचले सदन पर पन्नी पर चढ़कर sacculus रखें। तेल पन्नी की परिधि के आसपास जोड़ें।
- पन्नी पर तैयारी के ऊपरी सदन (पूरक फ़ाइल 1) प्लेस, देखभाल करने के वैक्यूम तेल के साथ एक पूरा मुहर के रूप में। bubbled कृत्रिम endolymph साथ ऊपरी सदन भरें और धीरे से एक बरौनी के साथ otolithic झिल्ली को हटा दें।
Representative Results
Bullfrog के sacculus का संवेदी उपकला बालों की कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच के लिए विभिन्न विन्यास में नियोजित किया जा सकता है। क्योंकि ऊतक अपेक्षाकृत सपाट है, यह दोनों एक और दो कक्ष की तैयारी में रखा जा सकता है। एक कक्ष विन्यास बालों की कोशिकाओं की electrophysiological और micromechanical रिकॉर्डिंग के लिए एक सरल स्थापना प्रदान करता है। दो कक्ष तैयारी के बजाय दोनों अन्त: कर्णोदकीय और बालों की कोशिकाओं की क्रमश: शिखर और बेसल पक्षों पर perilymphatic डिब्बों simulates। इन डिब्बों को एक साथ बालों की कोशिकाओं द्वारा mechanotransduction के अध्ययन के लिए एक physiologically प्रासंगिक वातावरण प्रदान करते हैं।
बालों की कोशिकाओं की संवेदनशीलता और पारगमन विशेषताओं यांत्रिक उत्तेजना के लिए उनके बिजली प्रतिक्रिया कायम करना। इन सुविधाओं की जांच करने के लिए, हम एक साथ एक व्यक्ति के बालों से दर्ज की गई अपनी बंडल की स्थिति को सेल औरसेल के रिसेप्टर क्षमता (चित्रा 2)। हम पहले बल दालों लागू करने के लिए एक बाल बंडल के kinociliary बल्ब के लिए एक लचीला फाइबर ग्लास संलग्न। हम तो एक दोहरी photodiode प्रणाली 2 (2A चित्रा) का उपयोग करते हुए बाल बंडल के विस्थापन मापा। हम समवर्ती एक तेज microelectrode के साथ सेल impaling से बाल सेल की क्षमता हासिल कर ली। हम पीक वोल्टेज प्रतिक्रिया बाल बंडल के इसी विस्थापन (चित्रा 2 बी) के खिलाफ एक यांत्रिक प्रोत्साहन द्वारा हासिल की साजिश रचने के एक विस्थापन-प्रतिक्रिया की अवस्था प्राप्त की। बाल सेल की विद्युत प्रतिक्रिया दोनों positive- और नकारात्मक विस्थापन Extrema के लिए संतृप्त। नकारात्मक विस्थापन कदम के साथ झिल्ली क्षमता की कमी mechanotransduction वर्तमान आवक एक आराम की उपस्थिति इंगित करता है। यह आराम वर्तमान, दोनों तेज और धीमी गति अनुकूलन 17 सीए 2 की कार्रवाई से ठीक किया जाता है
एक बाल सेल के व्यवहार न केवल अपने बिजली के गुणों की बात है, लेकिन यह भी अपने संवेदी बाल बंडल के micromechanics पर निर्भर करता है। दो कक्ष विन्यास mimics endolymph और vivo में perilymph की जुदाई, एक बाल बंडल के यांत्रिकी के अध्ययन के लिए आदर्श स्थिति प्रदान करते हैं। इन शर्तों के तहत और otolithic हटा दिया झिल्ली के साथ, बाल बंडलों अनायास 6 हिलाना कर सकते हैं। यहाँ हम अलग-अलग बंडलों की micromechanics आकलन करने के लिए दो कक्ष तैयारी कार्यरत हैं। हम एक दोहरी photodiode विस्थापन की निगरानी (चित्रा 3) पर अपनी छाया कास्टिंग द्वारा एक बाल बंडल की सहज दोलनों दर्ज की गई। mechanotransduction पर अमिनोग्लाईकोसाइड एंटीबायोटिक जेंटामाइसिन की भूमिका का आकलन करने के लिए, हम iontophoretically RELE बाल बंडल पर सीधे जेंटामाइसिन ased (चित्रा 3)। जारी की जेंटामाइसिन की एकाग्रता वर्तमान micropipette के माध्यम से पारित कर दिया साथ आनुपातिक रूप से बढ़ जाता है। जेंटामाइसिन एक बाल बंडल के दोलनों को रोकता है और एक स्थिर अपने लंबे पक्ष की ओर बंडल की भरपाई लाती है। इन प्रभावों को एक खुला चैनल अवरोधक है कि जब तक उनकी पारगमन ताकना अवरुद्ध mechanotransduction चैनलों के खुले राज्य रखता है के रूप में जेंटामाइसिन की भूमिका को प्रतिबिंबित। आरोप लगाया रसायनों के योणोगिनेसिस स्थानीय परमिट और द्रव का प्रवाह प्रेरित यांत्रिक व्यवधान के अभाव में विभिन्न सांद्रता में रसायनों की मात्रा निर्धारित करने रिहाई और इस प्रकार आदर्श ऐसे बाल बंडल 22 के रूप में mechanosensitive अंगों के अध्ययन के लिए अनुकूल है।
एक बाल बंडल की सहज गति अनुकूलन और nonlinear बंडल कठोरता 7 के बीच परस्पर क्रिया से पैदा होती है,xref "> 8, 23, 24। यह सहज गति एक बाल बंडल के सक्रिय प्रक्रिया है, जो यांत्रिक काम में संकेत ऊर्जा धर्मान्तरित चिपचिपा खींचें काबू पाने के लिए एक हस्ताक्षर है। बाल बंडलों vestibular 2, श्रवण में nonlinear तात्कालिक कठोरता प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है 25, और पार्श्व-लाइन सिस्टम 26।
हम सीधे Bullfrog के sacculus (चित्रा 4) से एक व्यक्ति बाल बंडल की तात्कालिक कठोरता मापा। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए हमें बाल बंडल के kinociliary बल्ब (चित्रा -4 ए) के लिए एक लचीला फाइबर ग्लास की नोक मिलकर। हम फाइबर के आधार विस्थापित द्वारा बाल बंडल करने के लिए बलों को जन्म दिया। बल प्रोत्साहन फाइबर द्वारा बाल बंडल पर लगाए गए फाइबर की बस के विस्थापन के बीच अंतर करने के लिए संगतई और टिप, फाइबर की कठोरता 2, 27 से गुणा किया। बलों की एक सीमा के पार दालों पहुंचाने बल बंडल और बंडल के आगामी विस्थापन पर लगाए गए के बीच एक संबंध का पता चलता है। इस बल विस्थापन संबंध की ढलान बाल बंडल के तात्कालिक कठोरता (चित्रा 4 ए) से मेल खाती है।
इस विधि हमें अपनी विक्षेपन (चित्रा 4 बी) के एक समारोह के रूप में एक व्यक्ति बंडल के तात्कालिक कठोरता को मापने के लिए अनुमति दी। तात्कालिक बल विस्थापन वक्र एक nonlinear रिश्ते को प्रदर्शित करता है, अपने आराम की स्थिति के आसपास के बारे में 20 एनएम के एक सीमा से अधिक बंडल के एक nonlinear कठोरता खुलासा। इस सीमा के बाहर, बाल बंडल बर्ताव करता है एक Hookean सामग्री की तरह, अपनी कठोरता बड़े परिमाण विक्षेपण के लिए रैखिक है।
इन परिणामों के demonstबाल-सेल शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन में Bullfrog sacculus की चंचलता दर। इन और अन्य तैयारियों का उपयोग करना, एक मस्तिष्क की ओर बंडल से सूचना के प्रसारण में कई चरणों में mechanotransduction तलाश कर सकते हैं।
चित्रा 1: Bullfrog के भीतरी कान की विच्छेदन। (ए) अपने उदर पक्ष से Bullfrog के ऊपरी तालू देखने Eustachian ट्यूब (चक्र) की पहचान के लिए परमिट। ऊपरी तालू के दाईं ओर कवर त्वचा के पार्श्व प्रतिबिंब भीतरी कान (धराशायी बॉक्स) के स्थान का पता चलता है। (बी) के मेंढक की लौकिक हड्डी के उदर पक्ष पर उपास्थि को हटाने के कान का कैप्सूल (धराशायी लाइन) को खोलता है। (सी) प्रदर्शित कान का कैप्सूल के एक उच्च बढ़ाई छवि है, जो sacculus, Lagena, सीएन आठवीं, और SACC में ular तंत्रिका आसानी से पहचाना जा सकता है। (डी) भीतरी कान अंगों को हटाने के बाद कान का कैप्सूल का एक दृश्य semicircular नहरों के स्थानों का पता चलता है। (ई) पृथक भीतरी कान, sacculus, Lagena, और आठवीं वें कपाल तंत्रिका (सीएन आठवीं) को हटाने के बाद आसानी से पहचाना जा सकता है। (एफ) पृथक sacculus saccular तंत्रिका और एक otolithic झिल्ली अपनी संवेदी उपकला के ऊपर झूठ बोल रही है की एक छोटी स्टंप के पास। लेबल (i) sacculus के अनुरूप, (ii) Lagena, (iii) सीएन आठवीं, (iv) saccular तंत्रिका, और (v) otolithic झिल्ली। एक्सिस पी लेबल और एक पीछे और पूर्वकाल के निर्देशों के अनुरूप क्रमशः। स्केल सलाखों 1 सेमी (ए, बी), 1 मिमी (सी, डी, ई), और 400 माइक्रोन (एफ) को दर्शाते हैं।
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चित्रा 2: एक बाल सेल के लिए विस्थापन-प्रतिक्रिया वक्र। (ए) एक गिलास प्रोत्साहन फाइबर की नोक एक बाल बंडल के kinociliary बल्ब और फाइबर के आधार करने के लिए मिलकर किया गया था बाद में नौ असतत चरणों भर में विस्थापित किया गया था। बंडल की स्थिति को एक दोहरे photodiode सिस्टम पर लगाया गया था, और इसके रिसेप्टर संभावित एक साथ एक microelectrode जिसका उत्पादन पुल मोड में एक एम्पलीफायर के माध्यम से पारित किया गया था का उपयोग कर मापा गया था। इलेक्ट्रोड की नोक प्रतिरोध 95 MΩ था और बंडल के आराम झिल्ली संभावित था -47 एम वी। (बी) अपने विस्थापन के एक समारोह के रूप में बंडल के रिसेप्टर क्षमता का एक भूखंड बंडल की प्रतिक्रिया और उसके बीच एक nonlinear संबंध का पता चलता हैपद। प्रत्येक बिंदु 2.5 एमएस समय खिड़की पर मतलब क्षमता और मतलब विस्थापन से मेल खाती है, यांत्रिक उत्तेजना की शुरुआत के बाद 2.5 एमएस शुरुआत। हर रंग एक ही विस्थापन नाड़ी के लिए इसी समय श्रृंखला का एक सेट का प्रतिनिधित्व करता है।
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चित्रा 3: सहज बाल बंडल दोलन पर Gentamicin का प्रभाव। एक दो कक्ष तैयार करने में एक बाल बंडल की सहज गति एक दोहरी photodiode प्रणाली का उपयोग कर दर्ज किया गया था। जेंटामाइसिन का iontophoretic रिहाई की अनुपस्थिति (0 एनए) में, बालबंडल सममित दोलनों प्रदर्शित करता है। वर्तमान की भयावहता एक iontophoretic 500 मिमी जेंटामाइसिन सल्फेट बढ़ता है (10 एनए, 20 एनए), बाल-बंडल आस की आवृत्ति एक खुराक पर निर्भर ढंग से गिर जाता है और बंडल समय के लिए अपने लंबे किनारे की ओर ऑफसेट है के साथ भरा पिपेट के माध्यम से पारित कर दिया समय की अवधि।
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चित्रा 4. एक बाल बंडल की तात्कालिक कठोरता गिना जा रहा है। (ए) एक प्रोत्साहन फाइबर (लाल) कठोरता कश्मीर एफ टी युग्मित हैओ kinociliary बल्ब एक व्यक्ति बाल बंडल (पीला) के (ब्राउन)। फाइबर के आधार विस्थापित एक ज्ञात दूरी एक्स एफ बंडल एक दूरी एक्स बी स्थानांतरित करने के लिए कारण बनता है। करने के लिए बल प्रोत्साहन फाइबर, एफ एफ द्वारा बंडल पर लगाए गए फाइबर और बंडल के विस्थापन के बीच अंतर आनुपातिक है। बलों की एक सीमा के पार इस दोहरा एक तात्कालिक बल विस्थापन संबंध (दाएं), जो की ढलान बाल बंडल के तात्कालिक कठोरता से मेल खाती है अर्जित करता है। (ख) एक व्यक्ति बंडल पहले 50 एमएस के भीतर बढ़ती परिमाण और अपने विस्थापन की दालों के लिए मजबूर करने के बाद पल्स शुरुआत (नीला अंक) मापा गया था अधीन था। यहां बाल बंडल आराम कर अपनी स्थिति के आसपास लगभग 20 एनएम के एक सीमा से अधिक एक nonlinear तात्कालिक कठोरता प्रदर्शित करता है। 60 * Z * (1 / (1 + EXP (- - लाल वक्र संबंध एफ = कश्मीर * एक्स के लिए एक फिट से मेल खाती Z * (एक्स - एक्स 0) / (कश्मीर बी टी *))) + एफ 0, जिसमें एफ बल बंडल के लिए आवेदन किया है, एक्स बंडल के विस्थापन, कश्मीर है = 790 ± 51 μN ∙ एम -1 बंडल के स्थिर है कठोरता, जेड जब सभी चैनलों या तो बंद है या खुला रहे हैं = 0.43 ± 0.04 पी.एन. एक भी gating वसंत की शक्ति है, एक्स 0 = 2 ± 1.9 एनएम बंडल की स्थिति है, जिस पर अपने चैनलों का 50% खुले हैं, कश्मीर बी बोल्ट्जमान के है निरंतर, टी तापमान है, और एफ 0 = 11.7 ± 1.3 पी.एन. एक ऑफसेट बल है। फिट 0.98 के निर्धारण के गुणांक के पास। प्रोत्साहन फाइबर 107 μN की कठोरता एम -1 ∙ था।
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es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक वेक्टर संस्करण को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
| घुला हुआ पदार्थ | फॉर्मूला वजन (जी / मोल) | 1 एल में जोड़े | |
| कृत्रिम perilymph | कृत्रिम endolymph | ||
| NaCl | 58.4 | 6.54 छ | 0.117 जी |
| KCl | 0.149 | 0.149 जी | 8.62 छ |
| 2 CaCl ⦁ 2H 2 ओ | 147 | 1 एम 2 CaCl शेयर के 2 एमएल | 1 एम 2 CaCl शेयर के 250 μL |
| HEPES | 238.3 | 1.19 छ | 1.19 छ |
| डी - (+) - ग्लूकोज | 180.2 | 0.541 जी | 0. 541 जी |
तालिका 1. विच्छेदन और प्रायोगिक तैयारी के लिए समाधान। इस तालिका में प्रदर्शित कृत्रिम perilymph और कृत्रिम endolymph विच्छेदन में और एक या दो कक्ष की तैयारी में इस्तेमाल किया समाधान के लिए नुस्खे हैं। NaOH (perilymph) या 2 एमएल KOH (endolymph) के बारे में 2 एमएल के साथ 7.4 - समाधान पीएच 7.2 में लाया जाना चाहिए। आसमाटिक ताकत लगभग 230 mmol पढ़ना चाहिए · किलो -1 अधूरा आयनिक हदबंदी के कारण है।
Discussion
Bullfrog के sacculus के भीतर कई हजार आसानी से सुलभ संवेदी बालों की कोशिकाओं झूठ बोलते हैं। यहाँ हम एक और दो चैम्बर रिकॉर्डिंग के लिए निष्कर्षण और sacculus की तैयारी प्रदर्शित करता है। इन दोनों की तैयारी बालों की कोशिकाओं और उनके संबद्ध बंडलों के दोनों micromechanical और electrophysiological अध्ययन की अनुमति है। क्योंकि ऊतक ऑक्सीजन युक्त नमक की लगातार प्रतिस्थापन के साथ कई घंटे के लिए जीवित रह सकते हैं, प्रयोगों लंबी अवधि के लिए जारी रख सकते हैं। इन तैयारियों में बालों की कोशिकाओं को आम तौर पर, विच्छेदन के बाद 6 घंटे के लिए microelectrode रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम रहते हैं, जबकि बाल बंडलों अप करने के लिए 24 घंटे के लिए निकासी के बाद अनायास हिलाना।
सफल निष्कर्षण और sacculus के बढ़ते कई आम चुनौतियों surmounting पर टिका है। सबसे पहले, saccular मैक्युला के शिखर सतह के साथ सीधे संपर्क तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान बचा जाना चाहिए। saccular तंत्रिका सुरक्षित manipu के लिए एक सुविधाजनक संभाल प्रदान करता हैsacculus की आबादी। एक बार जब भीतरी कान अंगों के शेष से मुक्त कर दिया, sacculus एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग कर शेष तरल पदार्थ में डूबे अपने संवेदी उपकला के लिए यांत्रिक क्षति से बचने के लिए, जबकि स्थानांतरित किया जाना चाहिए। धब्बेदार सतह से otoconia को हटाने के बालों की कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति के बिना पूरा किया जाना चाहिए। क्योंकि otoconia मैक्युला के ऊपर सीधे झूठ, बालों की कोशिकाओं विच्छेदन उपकरण और otolithic झिल्ली otoconia हटाने के दौरान बीच आकस्मिक संपर्क द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है। नुकसान से बचने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि otoconia का पतला जन मैक्युला से दूर एक स्थान पर आयोजित किया है और एक भी बड़े पैमाने पर हटाया जाना। यह कई समूहों, जिनमें से प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से निकाले होगा में otoconial जन के विखंडन से बचा जाता है। अगर otoconia के छोटे समूहों रहने के वे कोमल तरल पदार्थ एक पाश्चर विंदुक द्वारा दिया दबाव के साथ हटाया जा सकता है। एक अंतिम चुनौती में sacculus और एल्यूमीनियम बढ़ते वर्ग के बीच एक तंग सील का गठन शामिल हैदो कक्ष तैयारी। एक वेध काफी छोटा बारे में 100 माइक्रोन sacculus और आसपास के एल्यूमीनियम परमिट के ऊतकों की पूरी सील के बीच की अनुमति देने के लिए ओवरलैप के साथ एक वर्ग को रोजगार। गोंद के क्रम में एक तंग सील फार्म में लगभग 100 माइक्रोन मैक्युला की परिधि के चारों ओर saccular ऊतक के साथ संपर्क में लाया जाना चाहिए।
मुक्त सीए की एकाग्रता 2 + बालों की कोशिकाओं के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विचार है। सीए 2 दोनों तेज और धीमी गति अनुकूलन को नियंत्रित करता है, इस प्रकार सहज बंडल प्रस्ताव 8, 23 सहित mechanotransduction तंत्र के कैनेटीक्स और बाल बंडल के सक्रिय प्रक्रिया घटना की विशेषताओं का निर्धारण। विवो में अन्त: कर्णोदकीय कैल्शियम, 250 सुक्ष्ममापी पर मौजूद है इसलिए सबसे physiologically प्रासंगिक कैनेटीक्स इस एकाग्रता (Maunsell JHR, आर याकूब, और ए जे Hudspeth पर मूल्यांकन कर रहे हैं। UnpublisHed टिप्पणियों 16)। हालांकि, बालों की कोशिकाओं से microelectrode रिकॉर्डिंग एक बाहरी कैल्शियम एकाग्रता microelectrode चारों ओर सेलुलर झिल्ली के समुचित सील के लिए 2 मिमी से अधिक की आवश्यकता है। यह इन प्रयोगों के लिए एक उच्च कैल्शियम खारा का उपयोग करने के लिए इसलिए जरूरी है। अंत में, एक कैल्शियम की सांद्रता की एक किस्म का उपयोग mechanotransduction पर बाहरी कैल्शियम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इच्छा हो सकती है। इन मामलों में, यह आम तौर पर टिप-लिंक टूटना और पारगमन 28 के अपरिवर्तनीय नुकसान के लिए नेतृत्व 1 माइक्रोन से नीचे है कि कैल्शियम की सांद्रता याद रखना महत्वपूर्ण है।
दो प्रयोगात्मक यहाँ वर्णित की तैयारी बालों की कोशिकाओं पर biophysical माप की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, अतिरिक्त माप इन तैयारियों को मामूली संशोधनों के साथ बनाया जा सकता है। मुड़ा हुआ saccular तैयारी में, बाल बंडलों laterally कल्पना कर रहे हैं। इमेजिंग इस सुविधाजनक मोरचा से बाल-बंडल गति सुसंगत चुटकुला का पता चलता हैदोनों छोटी और लंबा stereocilia 29 के आयन। यहाँ saccular मैक्युला पहले उसके अंतर्निहित ऊतकों से अलग किया जाता है और बाद में अक्ष saccular तंत्रिका कि इस तरह के बाल बंडलों बाहर का सामना करना और क्रीज पर laterally कल्पना कर रहे हैं द्वारा परिभाषित साथ मुड़ा। एक दूसरा संशोधन, बाल-सेल हदबंदी, दोनों बाल सेल के बंडल और उसके सोमा के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। बालों की कोशिकाओं यंत्रवत् इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग 30 के लिए एक गिलास स्लाइड पर अलग कर रहे हैं। अंत में, बालों की कोशिकाओं के लिए एक समान हदबंदी प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, लेकिन यांत्रिक हदबंदी कदम के बिना उपकला से निकाला जा सकता है। बालों की कोशिकाओं है कि धीरे-धीरे उपकला से बाहर निकालना, electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए basolateral पहुँच प्रदान करते हुए यांत्रिक क्षति को कम करने में यह उपचार का परिणाम है। इन तैयारियों और उनके कई संशोधनों biophysical के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मेंढक sacculus की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शनसंवेदी बालों की कोशिकाओं का अध्ययन।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
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