Summary
미국 황소 개구리의 (모이 catesbeiana) sacculus 머리 세포 생리학의 직접 검사를 허용합니다. 여기에 해부 및 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비를 설명한다. 우리는 자발적인 운동의 번들의 힘 - 변위 관계의 계산과 측정을 포함하여이 유모 세포에서 대표적인 실험을 보여줍니다.
Abstract
청각과 균형의 연구는 모델 시스템의 생물 물리학 연구에서 도출 통찰력에 달려있다. 하나의 모델, 미국 황소 개구리의 sacculus는 청각 및 전정 연구의 주류가되었다. 이 기관의 연구에 적극적으로 환경으로부터 신호를 검출 할 수있는 방법 감각 세포 머리 밝혀졌다. 이러한 연구로 인해, 이제 더 기계적 게이팅 및 머리 셀의 전달 채널들, 기계적 적응 칼슘의 역할 지역화, 헤어 셀 전류의 신원을 이해한다. 이 고도로 접근 할 기관은 유모 세포의 동작에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 유모 세포에 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비에 대해 설명합니다. 우리는 완전한 박리 과정을 포함하는 특정 상황에서 sacculus의 제조를위한 특정 프로토콜을 제공한다. 우리는 추가의 계산을 포함하여이 준비를 사용하는 대표적인 결과를 포함헤어 번들의 순간적인 힘 - 변위 관계와 번들의 자연 진동의 측정.
Introduction
포유 동물의 acousticolateralis 기관은 복잡한 구조를 가지고 접근하기가 어려울 수 있습니다 해부학 틈새 시장 내에서 거짓말. 예를 들어, 포유 동물은 달팽이관 나선형 미로를 포함하고 두께 측두골 내에 포함된다. 달팽이관의 분리는 종종 그 안에 누워있는 감각 세포에 기계적인 손상이 발생하기 때문에 어려운 작업 일 것으로 입증되었습니다. 신경 과학자 따라서 더 쉽게 귀에의 서재에서 추출하는 시스템을 모델링되어있다.
이 모델 시스템 중 하나 인 미국의 황소 개구리 (모이 catesbeiana)의 sacculus은 수십 년이 청각 및 전정 기관의 기능에 일반화 통찰력을 산출하기위한 있습니다. sacculus 낮은 주파수의 청력과 지진 감각 모두에서 감각 역할이 혼합 된 기능의 기관이다. sacculus의 감각 세포는 머리카락 세포, 기계적 에너지로 변환 전문 변환기입니다우리의 청각 및 전정 기관 내에서 전기 신호로. 각 머리 셀의 혀끝의 표면에서 돌출하는 stereocilia라고 확대 미세 융모의 등급 술을 포함하는 mechanosensitive 머리 번들입니다. 인접 stereocilia의 팁 사상 팁 링크 단백질에 의해 상호 연결되는 기계적 게이트 이온 채널 기계적 자극 2, 3에 대응한다. 청각 및 전정 기관이 자극의 종류에 대응하지만, 이들은 공통의 검출기구를 공유한다. 이 공통점은 황소 개구리의 sacculus의 연구를 통해 헤어 셀 mechanotransduction에 얻은 많은 통찰의 기초. 예를 들어, 모발 세포의 활성화 과정이 장기 4, 5, 6, 7에서 광범위하게 연구되었으며, 모발 다발 기계적 생산하는 에너지 소비 프로세스를 채용작업. 뿐만 아니라 그 유모 세포가 활성 일 (6)를 생성하는 것이 도시되어 있지만, 고유 활성 프로세스 기전 및 머리 셀의 튜닝 특성 장기 acousticolateralis 황소 개구리의 연구를 통해 발표되고있다. 이들은 양서류 유두에서 헤어 셀의 리본 시냅스 (12)의 활성 헤어 번들 운동 8 헤어 셀 전기 공명 (9), (10), sacculus 11 및 주파수 선택성을 포함한다.
황소 개구리의 sacculus 수많은 이유 감각 신경 과학자에 호소. 포유류의 달팽이관과는 달리,이 기관은 쉽게 접근 귀 캡슐 내에 자리 잡고 있습니다. 둘째,이 기관 내 머리 셀 (14)은 적절한 조건하에 13 시간 동안 몇 건강한 남아있을 수있다. 이 experimentat 허용자신의 포유 동물의 대응에 상대적으로 긴 시간 척도를 통해 이들 세포에 이온. 셋째, 기관은 쉬운 조작을 허용, 작은 곡률을 맺는다. 넷째, 각 기관은 높은 처리량과 주어진 실험 머리 셀들의 적절한 세트 위치의 높은 가능성을 모두 제공 천개 이상의 모발 전지 (15)를 포함한다. 마지막으로, 황소 개구리의 sacculus 용이 인해 머리카락이 셀 기관과 큰 사이즈의 박형으로 가시화된다.
이러한 속성은 황소 개구리의 sacculus 내 감각 세포의 연구를위한 훌륭한 기능성을 제공한다. 손의 질문에 따라 여러 실험 제제 중 하나는 sacculus로부터 얻을 수있다. 이들 중 가장 간단한 하나의 챔버 제제이다. 여기 sacculus 인공 외 림프, 나트륨이 풍부한 높은 칼슘 식염수로 채워진 챔버에 고정된다. 이 혼합물은 머리 셀 전류 및 염기성 모발 다발 역학 연구있게. 두 번째 구성에, 2 실 제제, 자연 모발 다발의 움직임을 연구하는데 사용될 수있다. 기저 외측 측이 인공 외 림프에 목욕 반면 다음은 유모 세포의 꼭대기면이 칼륨이 풍부한 칼슘이 부족한 염분에 노출되어, 인공 림프 불린다. 이러한 두 구획 식염수의 생체 배열을 모방하고 모발 다발 자발적으로 진동 할 수있는 환경을 제공한다.
우리는이 논문에서의 감각 유모 세포의 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비에 대해 설명합니다. 우리는 먼저 개구리의 내이에서이 기관의 분리에 대한 자세한 묘사를 제공합니다. 우리는 그 다음 단일 및 두 챔버 모두 실험 준비를 설명하고 각 구성에 대한 대표적인 결과를 포함한다.
Protocol
윤리 정책 : 모든 절차는 록펠러 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 사전 실험 Prespanparation
- 솔루션
- 유게 놀 솔루션을 준비 (2.5 g · L -1 · kg -1 개구리). 식염수 용액 (표 1)을 준비합니다.
참고 : 하나의 챔버 준비를 들어, 인공 외 림프를 준비; 두 챔버 준비를 위해, 인공 외 림프 및 인공 림프을 모두 준비합니다.
- 유게 놀 솔루션을 준비 (2.5 g · L -1 · kg -1 개구리). 식염수 용액 (표 1)을 준비합니다.
2. 실험 도구
- 자극 유리 섬유의 제조
- 고온과 높은 속도로 한 줄 당김의 전극 풀러와 붕규산 유리 모세관을 좁 힙니다. 솔레노이드 구동 풀러에 뽑아 모세관을로드합니다.
- 유리 비드 필라멘트쪽으로 모세관의 끝 부분을 가지고모세관 콘택트 유리 비드까지 용융 상.
- 유리 구슬로 모세관의 끝 부분을 용융 필라멘트를 켭니다. 모세관과 구슬 사이의 유리 형태의 얇은 다리되면, 필라멘트 전원을 끄고 같은시기에 솔레노이드 풀러를 활성화합니다.
참고 :이 긴 축에 직각으로 유리 모세관을 당겨 단단한 섬유를 생성합니다. - 섬유의 직경이 더 이상 0.5 있는지 확인 - 1 ㎛는 그 길이가 100을 초과하지 않는 - 300 μm의. 섬유의 길이가이 치수를 초과하는 경우, 홍채 가위를 트리밍. 이미 해부 도구의 손상을 방지 할 수 둔한 있습니다 가위를 사용합니다.
- 광학 대비를 향상시키기 위해 코트를 섬유 스퍼터. 금 - 팔라듐 소스와 스퍼터 코터를 사용합니다. 수직 원본으로의 테이퍼 끝 스퍼터 코터로 각 섬유를로드합니다. 금 - 팔라듐 소스에서 2cm - 하나의 거리에 섬유의 팁을 가져옵니다.
- 닫습니다시일을 형성하고 전원을 켜 코터의 챔버를 스퍼터. 반복 아르곤으로 주변 공기를 세척합니다. 공기 세척 한 후, 10 파 (70 mTorr 이하)을 챔버 내의 압력을 감소시킨다.
- 120 s의 과정을 통해 10 초 지연으로 10 초 펄스에서 코트를 스퍼터.
주 : 스퍼터 코팅이 성공하면 섬유의 끝이 프로토콜의 지속 시간 동안 어둡게된다.
- 날카로운 미소 전극의 제조
- 한 줄 높은 열 풀을 사용하여 내부 필라멘트와 유리 모세관을 당겨. 3 M KCl을 가득 때 300 MΩ - 전극 (100)의 저항이 있어야합니다. 3 M KCl을 각 전극을 입력합니다.
- 앰프의 headstage (16)에 장착 할 때 벤드는 microforge 각 전극의 끝은 머리 세포 혀끝의 표면이 수직 렌더링합니다.
- 이온 토 포레 시스 피펫의 준비
- 내부에 유리 모세관을 당겨50 MΩ 팁 필라멘트. 농축 용질 (예를 들어, 500 밀리미터가 황산 젠타 마이신)를 입력합니다.
- 알루미늄 장착 광장의 준비
- 알루미늄 호일의 1cm X 1cm 사각형을 잘라. pithing로드 또는 다른 날카로운 물체의 끝 중앙에 호일을 관통. 그것은 원형 직경 약 1mm가되도록 관통 구멍을 형성.
- 진공 그리스 충전 된 주사기의 준비.
- 5 ML의 주사기에서 플런저를 제거합니다. 진공 그리스와 뒷면에서 주사기를 입력합니다. 플런저를 교체합니다.
- 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 접착제 도포의 준비
- 나무 주걱 스틱의 끝 부분으로 잘라 2mm 긴 축합니다. 최종에서 볼 때 슬릿은 어플리케이터의 중심에 있어야합니다.
- 예리한 가위 면도날, 1mm 두께의 시트로부터 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 2mm X 4mm 사각형을 잘라. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형의 2mm 길이의 가장자리의 얇은 하나 면도날을 사용합니다. 직사각형의 중앙에서 시작하여, 구형의 선단부에 경사면을 형성하는 외측 슬라이싱하여 직사각형의 두께를 감소시킨다.
- 경사 날 멀리 스틱에서 향하도록 나무 주걱 슬릿에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형을 삽입합니다. 제자리에 고정하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 직사각형의베이스에 5 분 에폭시를 적용한다. 접착제의 도포는, 실온에서 1 시간 동안 경화 할 수있다.
- 두 챔버의 하부 절반의 제조 탑재
- 기계 또는 3D는 2 챔버의 하부 절반 (보조 파일 2)을 탑재 인쇄. 상기 챔버의 하부면에 직경 20mm 오목 원을 식별한다.
- 오목 원의 가장 외측에 에폭시 3mm의 얇은 층을 적용한다. 에폭시에 한 18mm 원형 유리 커버 슬립을 적용합니다. 에폭시는 1 치료 허용시간.
내부 귀 기관의 3. 추출
- 10 분 동안 유게 놀 마취 용액을 함유하는 작은 양동이에 배치하여 미국 Bullfrog 마취. 용액의 부피를 조정하는, 그래서 그냥 액체 무선 인터페이스 위의 개구리의 humero - 견갑골 관절 거짓말.
- 더블 pithing에 의해 마취 황소 개구리를 안락사.
- 턱 아래 하나의 코 꼭대기 손가락과 다른과 마취 개구리를 잡고 앞으로 개구리의 머리를 돌립니다.
- 신속 개구리의 뒤통수 프로세스 사이의 중간 선에서 발견되는 난원 매그넘을 통해 뇌 볼트에 pithing로드를 뛰어.
- 천천히 철회와 팁이 난원 매그넘에서 출발 할 때까지로드를 회전합니다. 척수를 파괴하는 척추 foramina을 통해 꼬리 쪽로드를 강제로.
- 개구리가 제대로 이중 하부 사지 연장하는 것을 관찰함으로써 pithed되었는지 확인합니다.
- 안정성 향상을위한 vomerine 치아를 잡고 코와 첫 번째 손가락 꼭대기 엄지 손가락으로 개구리를 잡고. 양측 턱 관절을 절단하고 이후 rostrocaudal 축에 직각으로 절단하여 개구리 목을 벨. 두개골 내 내부 귀 기관이 그대로 남아 있음을 보장하기 위해 절단 모두 tympana에 꼬리 있는지 확인합니다.
- stereodissection 현미경을 사용하여, 조직 (도 1a)의 가장 후방 정도로 vomerine 치아에서 구개 조직을 잘라 정중선을 실행한다.
- 절단 및 후방 연골을 나타 내기 위해 구개 조직 아래에 누워 메스의 수평 컷 어떤 근육을 취소합니다. 근육을 제거한 후, 귀 캡슐의 경계를 형성하는 시간 연골 사탕 형상을 관찰한다.
- 귀의 캡슐의 연골과의 접촉의 지점에서 코 기둥을 절단.
- 반복 shallo함으로써이 연골의 얇은 층을 면도그것을 통해 w 가로 잘라냅니다. 내부 귀 기관에 손상을 방지하기 위해 깊은 상처를 피하십시오. 이 시간 연골 (그림 1B)의 롤리팝 구조 내에서 발견 된 귀 캡슐을 엽니 다. 귀의 캡슐 내에서 개구리의 내부 - 귀 기관 (도 1C)입니다.
- 내부 귀 기관이 손상되지 않도록주의하면서 후방과 귀 캡슐의 측면 모서리를 낸다. 해부하는 동안 자주가 침수 및 수화 상태를 유지하도록 내이 기관을 통해 식염수 흐름.
- 중간 선에 연골의 내측 연결에서 측두골에있는 두 개의 원형 구멍을 찾습니다. 시간적 뼈 파열 가장 내측 구멍을 통해 아래로 잘라.
- 그 측방 가장자리에 귀의 캡슐을 통해 두 번째 아래로 절단합니다. 내부 귀 기관에 대한 액세스를 제공하기 위해 이전 컷 사이의 연골 조각을 제거합니다.
- 단계 3.8을에서 컷 사이의 연골을 풀어 들어 올립니다차 3.9과 귀 캡슐에서 멀리 잘라. 이 조치는 추가 조작에 대한 핸들로 사용 될 수있는 가장 가까운 반원의 운하를 벌인.
- sacculus를 만지지 않도록주의하면서 뇌신경 번째 VIII을 절단.
- 가장 가까운 반원형 운하의 팽대부를 잡으십시오. 조심스럽게 남아있는 두 개의 반원형 운하를 노출 내이을 돌립니다. 각 운하를 노출되면, 그것을 절단.
- 신경 또는 반원형 운하 팽대부를 잡고 머리에서 내 귀를 추출하고 냉장 산소 인공 외 림프 가득 접시에 넣습니다. 내이의 제거는 반원형 운하가 한 번 통과 한 측두골 (그림 1D) 내의 통로의 시각화를 허용합니다.
참고 : 두 번째 귀를 추출하기 위해이 단계를 반복합니다.
4. 하나의 챔버 준비
- sacculus의 분리
- 대형 엉를 식별하여 sacculus를 찾습니다전자 이석의 질량과 그 꼭대기에 놓여 주머니 모양 신경 (그림 1E). 물리적 주머니 모양 머리 셀의 무결성을 유지하기 위해 다음 단계 중 sacculus를 상처를 입히다 않도록주의.
- 내이 조종 렌더링하는 반원의 운하를 낸다.
- sacculus의 신경 측 위에 놓인 perilymphatic 탱크를 제거합니다. 수조의 둘레 부드러운 컷을 확인합니다. 다음은 sacculus의 신경 측에 탱크의 멤브레인을 연결 조직의 작은 기둥을 절단.
- lagena 및 관련 신경을 제거합니다.
- 주머니 모양 신경 잡고 부드럽게 sacculus을 들어 올려 otoconial 낭의 얇은 막을 통해 절단. 낭 중 이석 유출 된 바와 같이, 그 둘레 절단하여 sacculus 무료.
참고 : 원하는 경우 sacculus을 분리 한 후, 나머지 내부 귀 기관이 저장 될 수 있습니다. sacculus 제거와 같은 다른 구조의 식별을 용이양서류와 기저 용의자. - 조심스럽게 sacculus에 남아있는 이석을 닦아 가위 또는 집게를 사용합니다. 이 과정에서 sacculus를 만지지 않도록주의하십시오.
- sacculus '가장자리에서 남아있는 otoconial 골목 막 트림. 이 멤브레인은 플라스틱 및 유리 표면에 부착하는 경향과 그 제거는 조직을 취급 문제를 최소화 할 수 있습니다.
- 부드럽게 남아있는 이석 (그림 1 층)을 제거하기 위해 파스퇴르 피펫으로 sacculus를 통해 식염수 흐름.
참고 : 첫 번째의 미러 이미지 인 제 2 sacculus에 대해이 절차를 반복합니다.
- 소화 및 설치
- 고장의 팁 파스퇴르 피펫의 백엔드를 사용하여, 인공 외 림프 67 mg의 ∙ L -1 프로테아제 XXIV의 3 ㎖을 함유하는 페트리 접시에 절연 sacculi 옮긴다.
참고 :이 프로테아제 처리는 otolithic 각 kinociliary 전구를 테 더링의 링크를 소화막 감각 모발 다발을 손상시키지 않고 막 제거를 가능하게한다. - 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분의 조직을 품어. 오픈 직면 실험 챔버에 각각 소화 sacculus를 전송하고 자기 핀 조직을 고정합니다.
- 주머니 모양 황반 직접 otolithic 막 아래에 거짓말과 유모 세포를 포함하는 sacculus의 부분이다. 그것을 확인하고 조심스럽게 주머니 모양 황반를 만지지 않도록주의하면서 좋은 속눈썹을 사용하여 상부 otolithic 막을 제거합니다.
- 고장의 팁 파스퇴르 피펫의 백엔드를 사용하여, 인공 외 림프 67 mg의 ∙ L -1 프로테아제 XXIV의 3 ㎖을 함유하는 페트리 접시에 절연 sacculi 옮긴다.
5. 두 개의 챔버 준비
- sacculus의 분리
- 4.1 절에서와 같이 내부 귀 기관에서 sacculus을 분리합니다.
- 설치 및 소화
- 진공의 두 점을 이용하여, 인공 외 림프로 장착 블록 (보조 파일 3)를 채우고 하나의 개구부에 뚫린 알루미늄 포일을 배치제자리에 고정하고 약한 시일을 형성 그리스.
- 전송 한 호일에 sacculus 및 아래로 향하게 황반과 위를 향하도록 신경 밑둥에 구멍의 상단에 중심.
- 트위스트 조직의 조각으로 sacculus 주변의 염분을 제거합니다. sacculus을 둘러싼 알루미늄 광장의 표면을 건조 할 수있는 생리 식염수를 심지.
- sacculus의 가장자리와 알루미늄 평방 사이의 경계를 따라 단단한 시일을 형성하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 어플리케이터를 사용한다. sacculus의 전체 둘레는 접착제로 피복되어 있는지 확인합니다.
참고 : 너무 느리게 진행하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제가 sacculus의 신경 측면을 통해 크리프 결국 그것을 커버 할 수 있습니다. 신속하게이 작업을 완료하는 것이 필수적이다. - 접착제를 치료하기 위해 장착 된 조직의 위에 생리 식염수의 드롭 놓습니다. 접착제의 박막 식염수 드롭의 상부에 형성 할 수 있고; 집게로 제거합니다.
- 조심스럽게 t 제거그는 장착 블록에서 호일. sacculus의 황반면이 위를 향하도록 위에 장착 된 조직 플립과 인공 외 림프 채워진 페트리 접시에 떠.
- 황반의 상단에 단백질 분해 효소 XXIV 용액 한 방울을 추가하고 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분 동안 품어. 중앙 챔버 주위에 외 림프와 장소 진공 그리스와 두 개의 챔버 장치 (보조 파일 2)의 하부 운하를 입력합니다.
- 챔버의면에 대향하는 신경과 하부 챔버에 호일 장착 sacculus를 놓습니다. 호일의 둘레 그리스를 추가합니다.
- 진공 그리스와 완벽한 밀봉을 형성하도록주의하면서 호일에 준비의 상부 챔버 (보충 파일 1)을 놓습니다. 버블 인공 림프와 상부 챔버를 입력하고 부드럽게 속눈썹으로 otolithic 막을 제거합니다.
Representative Results
황소 개구리의 sacculus의 감각 상피 유모 세포의 생리 프로브 다양한 구성으로 이용 될 수있다. 조직이 비교적 평탄하기 때문에, 단일 및 두 제제 모두 챔버 내에 장착 될 수있다. 하나의 챔버 구성은 유모 세포의 전기 생리 및 마이크로 기계식 녹음을위한 간단한 설정을 제공합니다. 두 개의 챔버 준비 대신 림프와 유모 세포의 각각 혀끝과 기저 측면에 perilymphatic 구획을 모두 시뮬레이션합니다. 이 구획 함께 머리 세포의 mechanotransduction의 연구에 대한 생리 학적으로 관련 환경을 제공합니다.
유모 세포의 민감도 및 전달 특성 기계적 자극에 대한 전기적 응답을 그 기초. 이러한 기능을 조사하기 위해, 우리는 동시에 개인의 머리에서 기록 된 것은 그 번들의 위치를 셀과세포의 수용체 전위 (그림 2). 우리는 제 1 힘 펄스를 적용하는 모발 다발의 kinociliary 전구 유연한 유리 섬유를 부착. 그런 다음 듀얼 다이오드 시스템 (2) (도 2A)을 사용하여 모발 다발의 변위를 측정 하였다. 우리는 동시에 날카로운 미세 전극과 셀을 찌르는하여 머리 세포의 잠재력을 인수했다. 우리는 머리카락 묶음의 해당 변위 (도 2B)에 대한 각각의 기계적 자극에 의해 유도 피크 전압 응답을 플로팅함으로써 용량 - 반응 곡선을 획득. 머리 셀의 전기 응답은 모두 포지티브 및 네거티브 변위 극값 대한 포화. 음의 변위 단계를 막 전위의 감소는 mechanotransduction 전류 안쪽 휴식의 존재를 나타냅니다. 이 휴지 전류가 모두 빠르고 느린 적응 17에 칼슘 이온의 작용에 의해 변조되고 18, 19, 20, 21.
헤어 셀의 동작은 그것의 전기적 특성에 따라, 또한 그 감각 모발 다발의 마이크로 메카닉에 단지 의존한다. 두 챔버 구성 모방 모발 다발의 역학 연구를위한 이상적인 조건을 제공하는 생체 외 림프 및 림프의 분리. 이러한 조건에서 제거 otolithic 막을 모발 다발 자발적 6 요동 할 수있다. 여기에서 우리는 각 번들의 마이크로 메카닉을 평가하기 위해 두 개의 챔버 준비를 고용했다. 우리는 듀얼 광 다이오드 변위 모니터 (그림 3)에 그 그림자를 주조하여 머리 번들의 자연 진동을 기록했다. mechanotransduction에 아미노 글리코 사이드 항생제 겐타 마이신의 역할을 평가하기 위해, 이온 삼투 rele 머리 번들에 직접 겐타 마이신을 ased (그림 3). 릴리스 겐타 마이신의 농도는 마이크로 피펫을 통과 한 전류에 비례하여 상승한다. 겐타 마이신은 머리 번들의 진동을 억제하고 키가 큰 쪽을 향해 번들의 오프셋 (offset) 정적을 유도한다. 이러한 효과는 투과 구멍을 차단하면서 mechanotransduction 채널의 개방 상태를 유지하고 개방 채널 차단제로서 겐타 마이신의 역할을 반영한다. 충전 화학 물질의 이온 토 포레 시스는 현지화 및 유체 유동에 의한 기계적 장애의 부재에 다양한 농도에서 화학 물질의 정량 방출 따라서 이상적으로 이러한 모발 다발 (22)로 mechanosensitive 세포 기관의 연구에 적합 허용합니다.
헤어 번들의 자발적인 운동, 적응과 비선형 번들 강성 (7) 사이의 상호 작용에서 발생외부 참조 "> 8, 23, 24.이 자발 운동 점성 저항을 극복하기 위해 기계적 일로 신호 에너지 변환 모발 다발의 활성 프로세스의 서명이다. 모발 다발 전정이 청각 비선형 순간 강도를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (25), 및 측면 라인 시스템 (26).
우리는 직접 황소 개구리의 sacculus (도 4)에서 개별 모발 다발의 순간 강도를 측정 하였다. 이를 달성하기 위해, 모발 다발의 kinociliary 전구 (도 4a)에 유연한 유리 섬유의 선단을 결합. 우리는 섬유의 기반을 변위에 의해 머리 번들로 힘을 전달했다. 자극 섬유가 모발 다발에 가해지는 힘은 섬유의 BAS의 변위의 차이에 대응E 및 팁은 섬유의 강성이 27 곱한. 힘의 범위에서 펄스를 전달하면 번들 번들의 계속되는 변위에 가해지는 힘의 관계를 보여준다. 이 힘 - 변위 관계의 기울기는 머리카락 묶음의 순간 강도 (도 4a)에 상당한다.
이 방법은 미국이 편향 (도 4b)의 함수로서 각각의 번들의 순간 강도를 측정 할 수 있었다. 순간 힘 - 변위 곡선은 정지 위치의 주위에 약 20 nm의 범위 번들의 비선형 강성을 공개, 비선형 관계를 표시합니다. 이 범위 밖에서, 머리 번들은 Hookean 재료처럼, 강성은 큰 크기의 처짐에 대한 선형 동작합니다.
이러한 결과는 demonst머리 세포 생리학의 연구에서 황소 개구리의 sacculus의 다양성을 평가. 이들 및 다른 제제를 사용하여, 하나는 뇌 향해 번들로부터의 정보의 전송의 여러 단계에서 mechanotransduction를 탐색 할 수있다.
그림 1 : 황소 개구리의 내이의 해부. 그것의 복부 측면에서 황소 개구리의 상부 미각보기 (A)는 이관 (원)의 식별을 허용합니다. 상부 입천장의 우측을 덮는 피부의 측면 반사 내이 (점선 박스)의 위치를 알 수있다. 개구리의 측두골의 복부 측면에있는 연골의 (B) 제거는 귀 캡슐 (점선)를 엽니 다. 표시 (C)는 귀 캡슐의 고배율 이미지이며, 이는 sacculus, lagena, CN VIII 및 SACC에서 울라 신경 쉽게 식별 할 수 있습니다. (D) 내부 귀 기관의 제거 후 귀의 캡슐의보기는 반원형 운하의 위치를 알 수있다. 뇌 신경 (CN VIII) 번째 고립 내이의 sacculus, lagena 및 VIII의 제거 후 (E)를 쉽게 식별 할 수 있습니다. (F)는 분리 된 sacculus는 주머니 모양 신경과 감각 상피 꼭대기 거짓말 otolithic 멤브레인의 짧은 그루터기를 보유하고있다. 라벨 (II) lagena, (ⅲ) CN VIII (IV)의 주머니 모양 신경 및 (V) otolithic 막을 상기 (I)에 대응 sacculus. 축 P 레이블 A는 후방 및 전방 방향에 각각 해당합니다. 스케일 바는 1cm (A, B), 1mm (C, D, E), 및 400 ㎛의 (F)을 나타낸다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단일 헤어 셀에 대한 변위 응답 곡선. (A) 유리 섬유 자극의 선단이 kinociliary 모발 다발의 섬유 전구의베이스에 결합시켜 후속 아홉 이산 단계에 걸쳐 변위 하였다. 번들의 위치는 이중 다이오드 시스템에서 추적하고, 그 수용체 전위를 동시에 출력이 브리지 모드에서 증폭기를 통과 한 미세 전극을 이용하여 측정 하였다. 전극의 끝 저항은 95 MΩ이고 번들의 휴식 막 잠재력이었다 -47 MV. (B)의 변위의 함수로서 번들의 수용체 전위의 플롯 번들의 반응과 그 사이의 비선형 관계를 보여위치. 각 점은 기계적 자극의 발병 후 2.5 밀리 시작, 2.5 밀리 초 시간 창을 통해 평균 잠재력과 의미 변위에 해당합니다. 각각의 컬러가 동일한 변위 펄스에 대응하는 시계열의 집합을 나타낸다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 자연스러운 헤어 번들 진동에 겐타 마이신의 효과. 두 챔버 준비 모발 다발의 자발적인 운동 듀얼 다이오드 시스템을 사용하여 기록 하였다. 젠타 마이신 이온 영동 분리의 부재 (0 NA)에서는, 머리번들은 대칭 진동을 표시합니다. 전류의 크기는 겐타 마이신 황산염의 성장에 500 밀리미터 (10 nA의 20 NA), 헤어 번들 여행의 주파수 용량 의존적으로 폭포와 번들이 이상 자사의 높이 가장자리쪽으로 오프셋 가득 이온 영동 피펫을 통과으로 시간의 기간.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 헤어 번들의 순간 강성을 계산. 강성 K F의 (A) 자극 광 (적색) t 연결된다ㅇ 개별 머리 번들 (노란색)의 (갈색)를 kinociliary 전구입니다. 섬유의베이스를 변위 공지 거리 X F는 거리 X의 B를 이동 번들시킨다. 힘 자극 섬유 F F로 다발에 작용하는 섬유 다발의 변위 사이의 차이에 비례한다. 힘의 범위에 걸쳐 이것을 반복하면 순간적으로 힘 - 변위 관계 (오른쪽), 슬로프있는 모발 다발의 순시 강도에 대응를 산출한다. (B)는 각각의 번들 펄스 발병 (청색 점)을 측정 한 후 첫 50 밀리 초 내에서 증가하는 크기와 변위 펄스를 강제로 하였다. 여기서, 모발 다발은 정지 위치 주위에 약 20 nm의 범위에 걸쳐 비선형 순간 강도를 표시한다. * Z - 60 * Z의 * (1 / (1 + 특급 (- 빨간색 곡선의 관계 F = K * X에 적합에 해당 (X - X 0) F는 번들에 적용되는 힘있는 / (K B 형 *의 T))) + F 0, X는 번들의 변위를 k = 790 ± 51 μN은 m -1 번들의 일정 ∙ 강성 모든 채널이 폐쇄 또는 개방 중 하나이며, Z = 0.43 ± 0.04 PN은 하나의 게이트 스프링의 힘, X 0 = 2 ± 1.9 nm의이 채널의 50 %가 개방되는 번들의 위치이며, K B는 볼츠만입니다 상수, T는 온도이며, F = 0 11.7 ± 1.3 PN 오프셋이 힘이다. 착용감 0.98 결정 계수를 갖는다. 자극 섬유 (107) μN의 강성 m의 -1 ∙했다.
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에스 / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 용질 | 화학 식량 (g / mol)의 | 1 L에 추가 | |
| 인공 외 림프 | 인공 림프 | ||
| 염화나트륨 | 58.4 | 6.54 g | 0.117 g |
| KCl을 | 0.149 | 0.149 g | 8.62 g |
| CaCl2를 ⦁ 2H 2 O | 147 | 1 M CaCl2를 재고 2 mL의 | 1 M CaCl2를 주식의 250 μL |
| HEPES | 238.3 | 1.19 g | 1.19 g |
| D - (+) - 글루코스 | 180.2 | 0.541 g | 0 541g |
해부와 실험 준비 표 1. 솔루션. 인공 외 림프 및 해부과 1 또는 2 실 준비에 사용되는 인공 림프 솔루션에 대한 조리법이 테이블에 표시됩니다. 솔루션은 pH를 7.2로 가져해야합니다 - 7.4 수산화 나트륨 (외 림프) 또는 2 mL의 KOH (림프)의 약 2 mL로. 삼투 강도는 약 230 밀리몰을 읽어야 · kg -1 불완전한 이온 성 해리로 인해.
Discussion
황소 개구리의 sacculus 내에서 수천 쉽게 접근 감각 유모 세포를 거짓말. 여기에서 우리는 단일 및 두 개의 챔버 녹음을 위해 추출 및 sacculus의 준비를 보여줍니다. 이 두 제제는 유모 세포 및 관련 번들 모두 마이크로 기계 및 전기 생리 연구를 허용합니다. 조직이 산소 식염수의 잦은 교체와 함께 몇 시간 동안 생존 할 수 있기 때문에 실험은 오랜 기간 지속될 수 있습니다. 머리 번들 추출 후 최대 24 시간 동안 자발적으로 진동하면서 이러한 준비에 머리 세포는 일반적으로 절개 후 최대 6 시간 동안 미세 전극 기록에 가능한 남아있다.
sacculus 성공적으로 추출 및 장착은 몇 가지 일반적인 문제를 극복에 달려있다. 첫째, 주머니 모양 황반의 혀끝의 표면과 직접 접촉은 준비 절차를 통해 피해야한다. 주머니 모양 신경 안전 manipu에 편리한 핸들을 제공합니다sacculus의 LATION. 내부 귀 기관의 나머지 부분에서 해방되면, sacculus 유체에 침지 남아있는 그 감각 상피에 기계적인 손상을 방지하면서 큰 구멍 피펫을 사용하여 전송해야합니다. 황반 표면에서 이석의 제거는 유모 세포에 기계적 손상없이 완료해야합니다. 이석은 황반 위에 직접 놓여 있기 때문에, 헤어 세포를 해부 도구와 이석을 제거하는 동안 otolithic 막 사이의 우발적 접촉에 의해 손상 될 수 있습니다. 손상을 방지하기 위해, 우리는 이석의 젤라틴 물질이 황반에서 멀리 떨어진 위치에서 개최 한 덩어리로 제거하는 것이 좋습니다. 이 개별적으로 추출 될 각각의 여러 클러스터에 otoconial 질량의 단편화를 방지 할 수 있습니다. 이석의 작은 클러스터가 남아있는 경우 그들은 파스퇴르 피펫에 의해 전달 완만 액압으로 제거 될 수있다. 마지막 과제는의 sacculus 알루미늄 장착 광장 사이에 꽉 밀봉의 형성을 포함한다두 개의 챔버 준비. 100㎛ 정도 sacculus 주변 알루미늄 허가 조직을 완전히 실링 사이의 오버랩을 허용하기에 충분히 작은 천공 사각을 채용. 접착제 타이트한 밀봉을 형성하기 위해 약 100 μm의 황반의 둘레 주머니 모양의 조직과 접촉한다.
자유 칼슘의 농도 2+ 유모 세포의 연구에서 중요한 고려 사항이다. 칼슘 따라서 자발적 번들 모션 8 (23)를 포함하는 mechanotransduction 장치의 동역학 모발 다발의 활성 프로세스 현상의 특성을 결정하고, 빠르고 느린 적응을 모두 조절한다. 생체 내 림프 칼슘 따라서 대부분의 생리 학적으로 관련 역학이 농도 (Maunsell JHR, R. 제이콥스와 AJ Hudspeth에서 평가됩니다, 250 μM 존재한다. Unpublis을 Hed 관찰 16). 그러나 유모 세포에서 미세 전극 기록은 미세 전극 주위의 세포막의 적절한 밀봉을 위해 2 밀리미터를 초과하는 외부 칼슘 농도를 필요로한다. 이들 실험을 위해 높은 칼슘 염을 사용하는 것이 필수적이다. 마지막으로, 하나는 칼슘 농도의 다양한 사용에 따라 외부 mechanotransduction 칼슘의 영향을 연구해도된다. 이러한 경우는 일반적으로 팁 링크 파열 전달 (28)의 불가역 손실을 초래할 1 μM 이하 칼슘 농도를 기억하는 것이 중요하다.
여기에 설명 된 두 가지 실험 준비는 유모 세포에 생물 물리학 적 측정의 범위를 허용합니다. 그러나, 추가 측정이 준비에 약간의 수정을 할 수있다. 접힌 주머니 모양 준비, 머리 번들은 측면 시각입니다. 이 관점에서 영상 헤어 번들 운동은 일관된 경구를 계시모두 짧고 키가 stereocilia (29)의 이온. 여기서, 주머니 모양 황반 먼저 그 하부 조직으로부터 분리하고,이어서 모발 다발 바깥면과 측 방향으로 주름에 가시화되도록 상기 주머니 모양 신경에 의해 정의 된 축을 따라 접혀. 제 2 변형은, 모발 세포 해리는 머리 셀의 다발과 소마 양자의 연구를 가능하게한다. 모세포 기계적 이미징 및 전기 생리 학적 기록 (30)을 유리 슬라이드 상에 분해된다. 최종적으로, 모발 세포는 유사한 분리 프로토콜에 따라하지만 기계적 분리 단계없이 상피로부터 압출 할 수있다. 기계적 손상을 최소화하면서 서서히 전기 생리 레코딩을위한 기저 액세스를 제공 상피 밖으로 돌출 머리 셀이 처리 결과. 이러한 제제 및 그들의 다양한 변형이 생물 물리학위한 모델 시스템으로 개구리 sacculus의 다양성을 보여감각 유모 세포의 연구.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
