Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55381
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 1
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الأوعية الدموية تشكيل في فيفو وفي الوقت الحقيقي في السقالات 3D بالفحص المجهري مولتيفوتون. ودرس الأوعية في السقالات المعدلة وراثيا في نموذج عيب مورين كالفاريال العظام حرجة. تم الكشف عن مزيد من الأوعية الدموية الجديدة في مجموعة العلاج من الضوابط.

Abstract

إعادة بناء تشوهات العظام الحجم حاسمة لا يزال يمثل مشكلة سريرية خطيرة بسبب ضعف الأوعية داخل هندسة الأنسجة السقالات أثناء الإصلاح، مما يؤدي إلى عدم وجود إمدادات كافية من الدم ويسبب نخر الأنسجة الجديدة. الأوعية السريع شرطا حيويا لبقاء الأنسجة الجديدة والتكامل مع أنسجة المضيف القائمة. جيل دي نوفو المفرج في السقالات واحد من أهم الخطوات في جعل تجديد العظام أكثر كفاءة، مما يسمح لإصلاح الأنسجة أن تنمو لتصبح سقالة. لمعالجة هذه المشكلة، يستخدم التعديل الوراثي سقالة مادة بيولوجية للتعجيل بالأوعية وتكون العظم. ومع ذلك، تصور وتتبع في فيفو تشكيل الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي والسقالات (3D) ثلاثي الأبعاد أو أنسجة العظام جديدة لا يزال عقبة لهندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هي طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن الحصول على بيانات حجمية من الهياكل البيولوجية بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وكان الهدف من هذه الدراسة لتصور الأوعية مع الفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في سقالة 3D-بلجا/نهاب معدلة وراثيا لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة. وقد فونكتيوناليزيد السقالات بلجا/نهاب لإيصال الجين ب pdgf عامل النمو تحمل ناقلات لينتيفيرال (LV-بدجفب) تيسيرا للأوعية وتعزيز التجدد العظام مستمرة. في العظام حرجة كالفاريال مزروع سقالة عيب طراز الماوس، مجالات الأوعية الدموية (بفاس) في السقالات بي كانت أعلى بكثير من درجة الحموضة السقالات. بالإضافة إلى ذلك، زيادة التعبير عن بدجف-ب والجينات المتعلقة بالأوعية، فوف و VEGFR2، في المقابل. تحليل ميكروكت أشارت إلى أن تكوين العظام الجديدة في مجموعة بي إتش بي تحسنت بشكل كبير بالمقارنة مع المجموعات الأخرى. على حد علمنا، هذا هو أول مرة استخدمت مجهرية مولتيفوتون في هندسة الأنسجة العظام للتحقيق في الأوعية في 3D سقالة القابلة للتحلل الأحيائي في فيفو وفي الوقت الحقيقي.

Introduction

العظم هو نسيج vascularized العالية التي لا يزال تشكيلها خلال فترة حياة الفرد1. تجديد العظام السريع والفعال لتشوهات العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات، ونقابية، والورم ريسيكشنز، أو تشوهات الجمجمة عملية فيزيولوجية معقدة. وتشمل النهج العلاجية التقليدية المستخدمة لإصلاح عيب العظام غرس أوتوجرافت و allograft، ولكن استخدامها ينطوي على العديد من المشاكل والقيود، مثل محدودية، والاعتلال موقع كبير من المانحين، وارتفاع مخاطر العدوى، و استضافة الرفض المناعي2،3. ومع ذلك، توفر ترقيع العظام الاصطناعية بديل فعال للتخفيف من هذه القيود. أنها يمكن أن تكون مصنوعة من مواد قابلة للتحلل وسهلة لأن اختﻻق مع حجم مسام مناسبة، ويمكن أن تكون الكائنات المعدلة وراثيا4،5.

حاليا، تم توظيف السقالات هندسة الأنسجة المختلفة في تطوير هندسة الأنسجة العظام6،7. للحث على إصلاح العظام والتجديد أكثر فعالية، ظهرت الهندسة الحيوية جنبا إلى جنب مع عوامل النمو وحققت نتائج جيدة8،9. لسوء الحظ، نصف عمر قصيرة وسهلة لتفقد النشاط وجرعة سوبرافيسيولوجيكال من عوامل النمو للفعالية العلاجية الحد على التطبيق السريري10. للتغلب على هذه المشاكل، أثبت إيصال الجينات عامل النمو بدلاً من عوامل النمو كنهج فعال للحفاظ على بيواكتيفيتي لعلاج العيوب العظمى والأمراض11،12. النواقل الفيروسية إيصال واعدة أدوات لتجديد الأنسجة نتيجة عالية على التعبير عن الكفاءة13.

بين عوامل النمو، عوامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF-BB) تم اختيارها في هذه الدراسة لأنها ليس فقط mitogen وتشيمواتراكتانت لخلايا mesenchymal وأوستيوجينيك، ولكن أيضا منشط للأوعية14،15 . وأظهرت الدراسات السريرية والسريرية السابقة أن PDGF-BB يمكن تعزيز إصلاح العظام في اللثة العيوب العظمى16،17بأمان وفعالية. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن يحفز PDGF-BB تولد الأوعية بتحفيز الخلايا غشائي الهجرة والانتشار في فيفو18،19. وعلاوة على ذلك، PDGF-BB يمكن أن تجعل أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) قادرة على التفريق في خلايا بطانية20، وهذا يسلط الضوء على مواصلة الدور المحتمل ل MSCs في نيوفاسكولاريزيشن. ولذلك، الذي يحفز تشكيل حيثياته المفرج في السقالات مع PDGF-BB خطوة هامة لإصلاح الأنسجة التي نمت في السقالات في هندسة الأنسجة العظام.

شفاء عيب العظام هو عملية morphogenetic أنسجة حيوية تتطلب منسقة تكون العظم والأوعية في مواقف إصلاح21. هو نيوانجيوجينيسيس إلى السقالات هندسة الأنسجة مزروع شرطا مسبقاً أساسيا لتزويد الخلايا بالمغذيات والأكسجين للنمو والبقاء على قيد الحياة وإزالة النفايات الأيضية. يشيع استخدام أساليب التصوير، بما في ذلك الأشعة السينية الصغرى-حسبت التصوير المقطعي (ميكروكت) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، والتصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري، يتم تطبيق بدلاً من الفحص النسيجي للحصول على الأوعية المعلومات22،23. ومع ذلك، هذه الأساليب عقبات مختلفة في تصور وقياس نيوفاسكولاتوري في 3D السقالات في هندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هو تقنية بيو-تصوير رواية نسبيا يحتوي على ميزة واضحة في نفس الوقت تصور الخلايا، المصفوفة خارج الخلية، والمحيطة بشبكات الأوعية الدموية في المجراة. أنها تمتلك قدرة تصوير ثلاثي الأبعاد الملازمة لاختراق الأنسجة العميقة ويسبب د منخفضة. أم في العقد الماضي، ومن ثم فقد اكتسب الكثير من الاهتمام في الدراسات الطبية24، بما في ذلك في علم الأعصاب، وعلم المناعة، وديناميات الخلايا الجذعية. ومع ذلك، يتم استخدامه بالكاد في أبحاث العظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

العناية بالحيوان كان امتثالا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات مقاطعة قوانغدونغ المختبر. وأجريت جميع الإجراءات تحت إشراف وموافقة "لجنة الأخلاقيات" "بحوث الحيوان"، شنتشن معاهد للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم-

1-إنتاج لينتيفيرال (LV)

  1. استنساخ كدنا pdgf-ب إلى ناقل تعبير لينتيفيرال (pLenti6/5-اجفب أو اجفب LV) متعددة-استنساخ مخصصة موقع المصب من المروج الفيروس المضخم للخلايا باستخدام الدائرة الأولى وسأل أنا تقييد مواقع لتشييد بلازميد pLenti6/5-بدجفب-اجفب (LV-بدجفب) 25-
  2. إنتاج جزيئات لينتيفيرال (LV-بدجفب) من الخلايا HEK-293 مترا بالتعاون ترانسفيكتينج مع الفيروس والبلازميدات التغليف (pLP1 و pLP2 وبفسف-ز) باستخدام الأسلوب القياسي من فوسفات الكالسيوم مع الكلوروكين (التركيز النهائي: 25 ميكرومتر) 25-
  3. بعد 48 ساعة تعداء، الحصاد وتصفية 500 مل المحتوية على الفيروس طافية مع عامل تصفية (0.45 ميكرومتر). وفي وقت لاحق، تركز الجزيئات الفيروسية تنبيذ فائق في س 89,000 ز 2 حاء ريسوسبيند في 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الكوة، وتخزين في-80 درجة مئوية.
  4. لتحديد عيار lentivirus، احتضان خلايا HEK293T مع الحل لينتيفيرال متسلسل المخفف ح 24 وحساب عيار لينتيفيرال، كما هو موضح سابقا 25-

2. تصنيع السقالات بلجا/نهاب طباعة 3D وتجميد LV

المواد
  1. ز حل 20 من بلجا (بولي د، للاكتيدي-co-جليكوليدي) في 20 مل من 1، 4-ديوكساني أن يشكل حلاً متجانسة. إضافة 2 غ نانوسيزيد هاب (نانو-هيدروكسياباتيدي) مسحوق (نهاب) إلى الحل؛ بلجا: ينبغي أن نهاب نسبة 10:1 (w/w).
  2. إثارة الحل مختلطة بشدة (إثارة السرعة: 1500 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة ح 16 استخدام محرض مغناطيسي لتشكيل عجينة موحدة. اختﻻق في مسامية السقالات بلجا/نهاب استخدام طابعة درجات الحرارة المنخفضة ثلاثية الأبعاد مع فوهة محوسبة تودع أسفل طبقة بطبقة، لصق إلى أعلى، وفقا نموذج تم تصميمه مسبقاً 26؛ أحجام مسام من السقالات تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرون.
    3. فريزيدري
  3. فراغ السقالات عن 48 ساعة لإزالة المذيبات تماما قدر الإمكان. نقع السقالات في الحل الإيثانول 75% ح 1 للتعقيم وليوفيليزي للحصول على السقالات محايدة والعقيم.
    ملاحظة: تشمل المعلمات الرئيسية للتجميد فراغ التكثيف درجة الحرارة (درجة مئوية) ودرجة فراغ السلطة (الفلسطينية). تحت درجة 45 فراغ السلطة الفلسطينية، كانت السقالات بلجا/نهاب فراغ المجفف في-78 درجة مئوية ح 48 دقة إزالة المذيب.
  4. إضافة 10 ميليلتر من الجسيمات LV (4.5 × 10 5) لكل بلجا/نهاب سقالة (4 مم × 4 مم × 2 مم) واحتضان السقالات ح 2 في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد للسماح الامتزاز.
  5. بعد التثبيت، شطف السقالات مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الجسيمات LV غير منضم. الأداة الإضافية-تجميد السقالات المغلفة بالجسيمات LV في النتروجين السائل وليوفيليزي مرة أخرى وتخزينها في-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. في المختبر حركية LV الجسيمات الإفراج من السقالات وتوصيل LV نشاط الإنزيم

  1. إينكوباتي 3D السقالات (4 مم × 4 مم × 2 مم) تحمل LV-أخضر نيون البروتين (LV-اجفب، 4.5 × 10 5 LV الجسيمات) في 1 مل دميم كاملة في 2.0 مل المبردة قارورة في 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 5 أيام-
  2. أخذ عينة 1 مل كل ح 12 من 12 ساعة إلى 120 ساعة بعد انتهاء الحضانة، واستبدال المتوسطة. عند كل نقطة الوقت، أضف 1 مل متوسطة جديدة بدلاً من 1 مل من الحضانة المتوسطة-
  3. استخدام الوسائط التي تم جمعها إلى ترانسدوسي HEK293T الخلايا التي تفرخ المشترك ل 48 h. تدبير العدد من النشطة بيولوجيا الجزيئات LV بتحديد عدد المصابات بالتجارة والنقل HEK293T الخلايا بالتدفق الخلوي 27-
    1. قبل ترانسدوسينج الخلايا HEK293T، إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا HEK293T مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط الإعلام المجمعة التي تحتوي على لينتيفيروس أفرج عنه من السقالات للبئر (1 مل/جيد) والثقافة مع الخلايا HEK293T عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد.

4. في المختبر تقييم للهجرة "لجنة السلامة البحرية" (بمسك) المشتقة من نخاع العظم

  1. قبل فحص الهجرة، إعداد بمسكس الإعراب عن الطماطم الفلورسنت البروتين (بمسكس-T) و البروتين (بمسكس ف) BB بدجف- 28-
  2. إجراء المقايسة الهجرة بمسك بدائرة Boyden استخدام لوحة 24-جيدا ومرشحات البولي مع حجم مسام ميكرومتر 8-
    1. مكان 0.5 مل بمسكس (5 × 10 4) transfected مع LV معربا عن الطماطم الفلورسنت البروتين (بمسكس-T) في الدوائر العليا. ضع 0.5 مل بمسكس (2 × 10 5) transfected مع LV معربا عن PDGF-BB البروتين (بمسكس ف) في الغرف السفلية.
  3. وتشمل ست مجموعات في هذه التجربة وإضافة 500 ميليلتر إلى حجرة أقل من كل بئر.
    ألف فارغة التحكم، خالية من المصل المتوسط فقط
    FBS باء التحكم، المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS
    السيطرة جيم PDGF-BB, 4 نانوغرام/مليلتر PDGF BB في المتوسط خالية من المصل
    دال PDGF-BB تغتنم المجموعة، PDGF-BB (4 نانوغرام/مليلتر) والأجسام المضادة-بدجف-BB (4 نانوغرام/مليلتر) [بولكلونل] في المتوسط خالية من المصل
    الفريق بمسك هاء، 2 × 10 5 بمسكس في المتوسط خالية من المصل
    مجموعة ف. بمسكس-س، 2 × 10 5 ف بمسكس في المصل المتوسطة الحرة.
  4. احتضانها ل 48 ساعة في 5% CO 2 و 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد. وبعد ذلك، إزالة الخلايا التي تم ترحيلها على الجانب السفلي من الدائرة وجمعها للتحديد الكمي لعدد بمسكس-T بالتدفق الخلوي-
    1. إزالة الجانب استخدام مكشطة خلية من الخلايا التي تم ترحيلها في مجلس النواب وريسوسبيند الخلايا التي تم ترحيلها مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. تحديد عدد تي بمسكس التي تم ترحيلها بالتدفق الخلوي 29-

5. إنشاء الحرجة كالفاريال موريني العظام عيب النموذجي وزرع السقالة

ملاحظة: الفئران الذكور بالب/c (7 أسابيع) تم شراؤها من قوانغدونغ المركز الطبي للمختبرات الحيوانية (قوانغدونغ، الصين)-

تجربة
  1. تسجيل ما مجموعة 42 الفئران الذكور لعيب كالفاريال العظام. تقسيم الفئران عشوائياً إلى ثلاث مجموعات، مع 14 شخصا في كل مجموعة لتلقي العلاجات التالية: المجموعة أ، لا يزرع؛ المجموعة ب، السقالات PH مزروع (بلجا/نهاب)؛ و "المجموعة جيم"، السقالات بي مزروع (بلجا/نهاب/LV-بدجفب)-
  2. تخدير الحيوانات مع الإدارة داخل للصوديوم بينتوباربيتال (50 مغ/كغ). إزالة الفراء مع لصق مزيل الشعر وتنظيف الجلد الرأس مع 75% من محلول الكحول قبل إجراء الشق الأول. فيكس رئيس كل الماوس مع صك المناظير باستخدام الأشعة للحفاظ على ما زال أثناء الجراحة.
  3. جعل شق أولية مع مشرط وثم تكبيره فيتح مقص لإنشاء شق جلد 1 سم خطية. تتخلص من السمحاق من العظم للجمجمة لتكشف عن سطح العظام الجمجمة باستخدام مسحه القطن معقمة.
  4. استخدام لدغ ترفين لإنشاء عيب حرجة حجم قطرها 4 ملم في الجانب الأيسر من كالفاريا 30. زرع السقالة في الموقع خلل العظام.
    ملاحظة: تم تعريف العيوب الحجم الحرج (كسدس) أصلاً ك " أصغر حجم إينتراوسيوس الجرح في العظام خاصة والأنواع الحيوانية التي لا تشفي تلقائياً خلال فترة حياة الحيوان. " في هذه التجربة، عيب 4 مم-قطر عيب عظم حجم حرجة، وفقا لسبق دراسة 31 ، 32.
  5. استخدام الملقط العيون لنقل السمحاق العودة بلطف إلى تغطية موقع الجراحية. خياطة الجلد قطعي مع ثلاثة غرز كل سم.
  6. أداء الرعاية بوستوبيراشونال. إدارة البوبرينورفين مسكن (0.1 مغ/كغ) لتخفيف الألم. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع وسادة تدفئة حتى يوقظ الحيوان. وفي وقت لاحق، تغذية الحيوانات بالغذاء والماء وتسجيل نشاطهم كل يوم حتى نهاية الاختبار. ملاحظة: يمكن أن تدار التسكين قبل الإجراءات الاعتماد الخاصة بك الرعاية الحيوانية المحلية اللجنة التوجيهية.

6. في فيفو تصوير الأوعية داخل العظام العيب بام

ملاحظة: مترافق FITC 250 دينار كويتي ديكستران (10 مغ/مل) في المحلول الملحي كان حقن الوريد في الفئران للحصول على عالية-دائرة الاستخبارات الوطنية (نسبة الإشارة إلى الضوضاء) صور للأوعية الدموية الجديدة ووفقا دراسة سابقة 33. يرجى ملاحظة أن هذا هو الإجراء البقاء على قيد الحياة.

  1. تجميع نظام الفحص المجهري مولتيفوتون (أم) اثنين-فوتون متحمس الفلورية (تبيف) وجيل التوافقي الثاني إشارة (SHG) تصوير-
  2. تخدير الحيوانات مع حقن داخل بينتوباربيتال الصوديوم (50 مغ/كغ) وشل الحيوانات على لوحة تدفئة الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء هذه التجارب. استخدام غاز isoflurane 3.0 في المائة في الأكسجين 100% للحفاظ على مرض التخدير والتسكين أثناء عملية التصوير. حقن المحلول الملحي (200 ميليلتر في الحيوان) منع الجفاف قبل التصوير إينترابيريتونيلي.
  3. لحن ليزر femtosecond تي-ياقوت إلى 860 نانومتر. إنشاء مساحة 512 × 512 ميكرومتر أخذ عينات عن طريق مسح زوج من المرايا galvo واستخدام عدسة الهدف غمر المياه NA1.0 لشعاع الإثارة فوكوسثي في العينة وجمع إشارة تبيف/SHG المستطار.
    ملاحظة: أجريت التصوير في المنزل-مولتيفوتون المجهري تصوير نظام البناء (أم). أثناء التصوير، تم ضبطها ليزر femtosecond تي-ياقوت إلى 860 نانومتر كالطول الموجي الإثارة الأمثل. وكان شعاع الليزر النقطية الممسوحة ضوئياً عبر طائرة عينة باستخدام زوج من المرايا جلفانومتر. بعد مرورها عبر مرآة مزدوج اللون من 685 نانومتر، الشعاع انصب على العينة بهدف X NA1.0 20. وجمعت الإشارات تبيف و SHG المستحث بنفس الهدف. تم تقسيم الإشارات من الليزر الإثارة من مرآة مزدوج اللون المذكورة أعلاه وتنقيته من مرشح تمرير قصيرة 680 نانومتر. إشارات تبيف و SHG جمعتها حزمة ألياف وأجرى إلى مرسمه طيف. وكان الكاشف في مرسمه طيف مجموعة خطية من أنابيب ضوئي (بمتس). المزيج من مرسمه طيف و PMTs صفيف خطية تقدم القدرة على تسجيل الإشارات في نطاقات طيفية 16 على التوالي، من 400 نانومتر إلى 600 نانومتر، على فترات 12.5-شمال البحر الأبيض المتوسط. ولذلك، كشف في الوقت نفسه إشارات تبيف و SHG وفصل في النطاقات الطيفية. وعلاوة على ذلك، استخدمت لتصوير ثلاثي الأبعاد، محرك محوري التحكم في عمق التصوير. تم تعيين مجال كل صورة إلى 512 × 512 ميكرومتر، وتم تعيين الفاصل الزمني العمق إلى 2 ميكرومتر (مجموعة المراقبة، 5 ميكرومتر). جدير بالذكر أن 5 مواقع في كل عيب تم تصويرها لجمع البيانات إحصائيا، ومواقع تصوير مختارة ووزعت بالتساوي وعشوائياً على طول العيب.
  4. 5 مسح المواقع على كل عيب لجمع البيانات ذات دلالة إحصائية لقياس تشكيل السفينة.
    1. استخدام مسح مواقع موزعة بالتساوي وعشوائياً على طول العيب. لمجموعة المراقبة، بالميدان لمشاهدة غلاف (FOV) منطقة العظم الأصلي وحافة العيب، ولكن للأس الهيدروجيني وبي المجموعات، فوف على سقالة مزروع.
    2. شق جلد خطي 1 سم باستخدام مشرط وخياطة الجلد مفتوحة لتثبيت البرنامج للكشف عن موقع الزرع. استخدام المحاقن لوضع قطره الماء بين غمس العدسة وزرع شكل كوب الماء.
  5. الحصول على صورة مكدسات كل 12 s على ح 2 التصوير الفترة. عرض وتحليل البيانات الحجمي باستخدام برنامج MATLAB مخصص وتحديد مجالات الأوعية الدموية مع ImageJ البرمجيات 34 ، 35-

7. تحليل التعبير الجينات pdgf-ب والجينات المتعلقة بالأوعية ب RT-قبكر

ملاحظة: بكر كان يؤديها اتباع الخطوات المعتادة: 95 درجة مئوية لمدة 30 s، دورات 40 من 95 درجة مئوية 5 s، و 60 درجة مئوية لصهر 30 وظيفة-بكر س. منحنيات أكدت خصوصية التضخيم الهدف واحد، وتقرر تغيير حظيرة من الجينات ذات الأهمية بالنسبة إلى β-أكتين. أن رد الفعل لكل عينة تم اختبارها ثلاث مرات-

  1. حصاد مزروع السقالات والأنسجة من الفئران التجريبية في 2 و 4 و 8 أسابيع بعد انتهاء العملية 36؛ ومراقبة العينات المجموعة (n = 4)، المتخذة في نفس الوقت النقاط، يجب أن تكون من نسيج العظام المجاورة.
    ملاحظة: في كل مرة نقطة (2، 4، و 8 أسابيع)، euthanized الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون 2. تشريح في كالفاريا، وبعد ذلك، إزالة وحصاد السقالات مزروع من كالفاريا.
  2. استخدام كاشف تجارية استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من كل عينة حسب الشركة المصنعة ' بروتوكول s. استخدام "أدوات النسخ العكسي" لعكس-نسخ الجيش الملكي النيبالي في كدنا عقب الشركة المصنعة ' بروتوكول s-
  3. إجراء الكمي PCR في الوقت الحقيقي باستخدام "نظام كشف الأخضر سيبر"؛ الإشعال ترد في الجدول 1-
Primer(5'–3')
الجينات إلى الأمام عكس
بدجفب كاتككجكتككتتجاتجاتكت جتجكتكججتكاتجتكاجت
فوف كتكتتجججاكجاكتكاتك تكككجاجاتجاجاجاك
VEGFR2 AG جااتجاكاكتجاجككتاكا ز تككاتجكتجتكاكتاكاجا
β-أكتين AGG جتاتككاتجااتاجتجتاك قبل CAAT جكاجتاكاتاتتاكاكاجاج

الجدول 1: مجموعات بيمير.

8-التحليل ميكروكت التجدد العظام

  1. يوثانيزي الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون 2 في 8 أسابيع بعد انتهاء العملية. في بيئة جيدة التهوية، بلطف ضع كل الماوس داخل قفص ماوس نظيفة وضخ غاز CO 2 إلى القفص تخدير الفئران قبل القتل الرحيم.
  2. تشريح الجمجمة لتصوير ميكروكت من منطقة عيب العظام. المستخدم التالي مسح معلمات في التجارب: 9 ميكرومتر القرار، 50 كيلوفولت الجهد وال 0.5 ملم التصفية والحالي 142 µA.
    3. ركن
  3. البنية جميع بيانات التصوير باستخدام البرمجيات التجارية التي تقدمها الشركة. معايرة عمليات التفحص باستخدام الدالة المعايرة للبرمجيات كتان.
    ملاحظة: وضع وحدة هاونسفيلد (هو جين تاو) تحت الفئران في كل عملية مسح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بلجا مسامية أسطواني/نهاب السقالات 0.6 مم في الارتفاع، وكانت ملفقة قطرها 4 ملم مع طابعة 3D. مورفولوجيس من السقالات حللت عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني وميكروكت. ويبين الشكل 1A صورة سقالة مزروع. وكشف المسح ميكروكت أن أكثر من 85% المسام أحجام تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرون (الشكل 1B). أظهر تصوير وزارة شؤون المرأة أن سطح السقالة من ميكروتوبوجرافي الخام، مع ميكروبوريس (أقطار حوالي 5-10 ميكرون) التي مترابطة داخل السقالات (الشكل 1-د-و). حوالي 40% المبلغ الإجمالي للجسيمات اجفب LV المغلفة (4.5 × 105) أطلق سراحه من السقالات بلجا/نهاب بدأت مع تأثير اندفاع أولى خلال 24 ساعة. بيواكتيفيتي صدر الفيروسات LV وصلت إلى القمة في 24 ساعة وثم تتضاءل باستمرار، تقترب إلى 0 في ح 120 (الشكل 2). تشير هذه البيانات إلى يمكن الإبقاء بيواكتيفيتي المعطل تداولها السقالة أكثر الجسيمات LV ليصل إلى 96 ساعة. لوحظ قدرة الهجرة MSCs-T مع أسلوب نظام مراقبة الأصول الميدانية للتحقيق في ما إذا كان LV تحمل كدنا pdgf-ب يمكن التعبير عن، وتؤدي إلى بمسك به، كما هو موضح في الشكل 3- مراقبة إيجابية (ج) ومجموعة معربا عن BB PDGF (F) أظهرت مستوى أعلى بكثير من الهجرة بمسك من المجموعات الأخرى 4. وباﻹضافة إلى ذلك، هجرة بمسكس في "الفريق و" كان أعلى بكثير من التي في "المجموعة جيم." لا توجد أي اختلافات كبيرة في الهجرة بمسك بين المجموعات الأخرى 4.

تم تقييم الأوعية داخل عيب العظام من 2 إلى غرس ما بعد الأسبوع الثامن قبل أم المسح الضوئي. ويبين الشكل 4A مثالاً تخطيطي بالماوس إطار المسح أم. تم الكشف عن الأوعية واضحة في المجموعات الأس الهيدروجيني وبي إتش بي، ولكن كانت الأوعية الدموية بالكاد يمكن ملاحظتها في المجموعة عنصر التحكم، حيث شكلت طبقة من الأغشية الليفية عبر منطقة عيب فقط (الشكل 4 باء). وتظهر الرسوم البيانية المتحركة توموجرافس الأوعية الدموية لكل مجموعة (البيانات التكميلية). المنطقة الأوعية الدموية الجديدة زادت تدريجيا مع مرور الوقت في مجموعات الأس الهيدروجيني وبي، مع أنماط زيادة مماثلة. في الأسبوع الثامن، ظهرت السفن مماثلة في التشكل لتلك التي لوحظت في مرحلة مبكرة؛ وكان التغيير الوحيد أن يتزايد عدد متزايد من سفن أصغر حجماً إلى السقالات (الشكل 4 باء). بي الفريق بي كان أعلى بكثير من أن الفريقين الآخرين في جميع الأوقات النقاط (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، هناك العديد من مواقع ترسبات الكولاجين، كما ورد من إشارات SHG (اللون الأخضر في الرسوم البيانية والرسوم البيانية المتحركة) في المجموعات الأس الهيدروجيني وبي إتش بي، ولكن ليس في السيطرة على المجموعة (الشكل 4 باء).

ولتوضيح العلاقة بين PDGF BB التعبير وتولد الأوعية، قارنا مستويات التعبير نسخة الجين ب بدجف، فوف، و VEGFR2 مع الأسلوب RT-قبكر في 2 و 4 و 8 أسابيع بعد زرع ( الشكل 5). كما هو متوقع، زاد ب pdgf التعبير إلى حد كبير في مجموعة بي إتش بي في جميع النقاط الزمنية، مع زيادة بنسبة 5 إلى 13 مرات مقارنة بالسيطرة والمجموعات الأس الهيدروجيني (الشكل 5A). لم يكن هناك كبير فرق بين مجموعة الأس الهيدروجيني والتحكم، ومستوى PDGF BB التعبير تقريبا ظل ثابتاً من الأسبوع الثاني إلى الأسبوع 8، كما هو موضح في الشكل 5 ألف. زيادة مستويات التعبير مرناً فوف و VEGFR2 في جميع الفئات الثلاث تدريجيا وكانت أعلى في مجموعة بي إتش بي على الإطلاق ثلاثة الوقت النقاط (الشكل 5 وج 5). المجموعة الأس الهيدروجيني، كان هناك لا دلالة إحصائية مقارنة بمجموعة التحكم، على الرغم من الأوعية واضحة (الشكل 4 باء).

كذلك تأكيد أن بدجف-ب-السقالات التي تتضمن تعزيز العظام التجدد في فيفو استخدام عيوب خطيرة الحجم كالفاريال في الفئران الذكور بالب/ج، ومسح ميكروكت وقدمت معلومات لتقييم التجدد العظام في 8 أسابيع غرس ما بعد. عيوب في مجموعة بي إتش بي كما هو موضح في الشكل 6، كانت مليئة بكتلة من العظم الجديد أنسجة إينجرووث في السقالات، بينما كان هناك العظام الجديدة أقل بكثير في السيطرة والمجموعات الأس الهيدروجيني.

Figure 1
رقم 1: توصيف الهيكلية سقالة بلجا/نهاب 3D- (أ) صورة من السقالة المطبوعة 3D. (ب) صورة ميكروكت المسامية عموما من السقالة. (ج) ميكروتوبوجرافي السطح السقالة التي لاحظها SEM في 60 س، 2,000 X (د)، 5,000 X (E)، والتكبير X 10,000 (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: إعداد Lentivirus وتقييم بيواكتيفيتي للجسيمات LV-التجارة والنقل- (أ) التمثيل التخطيطي بناء ناقلات لينتيفيرال. بعد 48 ساعة تعداء، لوحظت خلايا HEK-293 مترا تحت الضوء (ب) والظروف الميدانية (ج) الأسفار. (د) تقييم في المختبر بيواكتيفيتي الجسيمات LV-بروتينات فلورية خضراء تراكمياً صدر من السقالات بلجا/نهاب. يتم عرض كافة البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. BB بدجف-بيواكتيفيتي كاستجابة قوية Chemotactic عامل الهجرة بمسك. بمسكس-T (5 × 104) كانت المصنفة على رأس الدوائر ترانسويل، ومع مختلف وسائل الإعلام شرط يوضع في الجزء السفلي من الدوائر. (A) التحكم فارغة، خالية من المصل المتوسطة فقط؛ (ب) يمول التحكم، المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS؛ (ج) PDGF-BB التحكم، 4 نانوغرام/مليلتر PDGF BB في المتوسط خالية من المصل؛ (د) بدجف-BB مصادرة المجموعة، PDGF-BB (4 نانوغرام/مليلتر) وجسم [بولكلونل] مكافحة--بدجف--BB (4 نانوغرام/مليلتر) في المتوسط خالية من المصل؛ (ﻫ) بمسكس المجموعة، 2 × 105 بمسكس في المتوسط خالية من المصل؛ والمجموعة (F) بمسكس-س، 2 × 105 بمسكس-P في المتوسط خالية من المصل. يتم عرض كافة البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 4). #: مقارنة بين المجموعة ج وسائر الفئات، باستثناء المجموعة واو، ف # < 0.0001. *: مقارنة بين الفريق و وجميع الفئات الأخرى، * ف < 0.05، * * * ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تصوير مجهرية مولتيفوتون عالية الدقة (SHG/تبيف) والتحديد الكمي للأوعية في منطقة كالفاريا ماوس عيب العظام.في س > التوضيح التخطيطي (A) A بالماوس إطار المسح أم. دائرة اللون البرتقالي يمثل موقع عيب والأنابيب الحمراء تمثل الأوعية الدموية، والأخضر يمثل الكولاجين. تم تفحص أونوبيراتيد (ب) والحيوانات تعمل مع أم في غرس ما بعد 8 أسابيع. دمج SHG SHG، تبيف،/تبيف، وتظهر الصور الثلاثية الأبعاد. ويمثل الخط المنقط الحدود على طول العيب العظام في المجموعة عنصر التحكم استناداً إلى إشارات SHG. (ج) الأوعية الدموية المجال الكمي داخل منطقة عيب التحكم ودرجة الحموضة، وبي من الأسبوع الثاني لغرس ما بعد الأسبوع 8. يتم عرض كافة البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 5). : تحليل الإحصائية بين المجموعات الأس الهيدروجيني وبي، ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: تحليل RT-قبكر بدجف-b (A) والجينات المتعلقة بالأوعية فوف (ب) والتعبير VEGRF2 (ج) في "ثلاث مجموعات". تم تحليل عينات من الحيوانات 4 لكل نقطة في الوقت. #: مقارنة بين مجموعات بي إتش بي، ودرجة الحموضة، ف # < 0.05، # ف < 0.01، وف #< 0.0001. *: مقارنة بين مجموعات بي إتش بي والتحكم، * ف < 0.05، * * ف < 0.01، و * * * ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: تقييم في فيفو تكوين العظام مع فحص ميكروكت. المجموعة التحكم دون السقالات مزروع. المجموعة الأس الهيدروجيني داخل مزروع بلجا/نهاب سقالة فقط. مجموعة بي إتش بي ضمن مزروع سقالة بلجا/نهاب تعديل بواسطة الجسيمات LV-بدجفب . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العظم نسيج vascularized عاليا بقدرة فريدة على استمرار الشفاء وإعادة تشكيلها طوال عمر على الفردية1. مستوى الأوعية الدموية مهم لإصلاح تكون العظم وعيب. الأوعية منخفضة يحد التطبيق السريري واسعة لهندسة الأنسجة العظام. بناء العظام هندسة الأنسجة عالية vascularized وفقا لنظرية بيوميميتيقا أصبح أداة لإصلاح تشوهات العظام شريحة كبيرة. أنواع مختلفة من السقالات طبقت بنجاح لإصلاح العيوب العظمى صغيرة نسبيا. ومع ذلك، لعيوب العظام الحرجة، تطبيق السقالات لإصلاح ما زال يواجه عقبات، أساسا بسبب عدم كفاية الدم توريد لإصلاح الخلل. ولذلك، تحسين إمدادات الدم أثناء عملية إصلاح تشوهات العظام الكبيرة واحدة من القضايا الرئيسية في هندسة الأنسجة.

الناس استخدام السقالات المغلفة بالمواد النشطة بيولوجيا للمساعدة في إنشاء الحقول morphogenetic الضرورية التي يمكن أن تحفز وتجنيد وتعزيز إنزيمية والتمايز، وتكاثر الخلايا اللازمة لتكوين نيوفاسكولاتوري والعظم 37. نيوفاسكولاتوري في هندسة الأنسجة السقالات ضروري للخلايا للحصول على الأوكسجين والمواد المغذية، لإزالة النفايات، وفي نهاية المطاف للوفاء بمهمة السقالات. وتمثلت أهداف هذه الدراسة التحقيق الأوعية مع فيفو مولتيفوتون المجهري في سقالة بلجا/نهاب المعدلة وراثيا، وطباعة 3D لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة وتقييم آثار استخدام التجدد العظام ميكروكت.

وعلى الرغم من الإنجازات الهائلة في هندسة الأنسجة العظام، و في فيفو التصور والتقدير الكمي ل neovascularization في السقالات أثناء العظام التجديد ما زال يشكل تحديا. نظم التصوير المجهري آخر تعجز عن توفير المعلومات الحجمي على تولد الأوعية. أساليب التصوير التقليدي، مثل ميكروكت، والتصوير بالرنين المغناطيسي، وتحاليل نسيجية، غير المدمرة ومعقدة وشاقة والقرارات المكانية منخفضة واقتناء الصورة طويلة مرات38. ومع ذلك، هو تصوير أم إشارات طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن القبض على الأوعية الدموية في فيفو بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وقادر على الكشف عن السفن الجديدة أرق من 10 ميكرون (الشكل 4 باء). وإلى جانب صور الأوعية الدموية، لاحظنا أيضا كتلة من ترسبات الكولاجين الجديد (اللون الأخضر في الشكل 4B) والرسوم البيانية المتحركة في المواد التكميلية، كما ورد من إشارات SHG، والتي تشير إلى تكوين أنسجة العظام من زاوية أخرى. ونظريا، يمكن الحصول على صور الأوعية الدموية دون استخدام عوامل التباين. بيد في هذه الدراسة، يستخدم عامل على النقيض للحصول على أفضل الصور وإزالة الجلد المحلية لضمان عمق المسح السليم. هذا سيكون غير ضروري عندما تتوافر نظم التصوير أكثر قوة في المستقبل لتصوير حقاً غير الغازية.

المشمولين بالمساعدة الإنسانية هي مواد الطبية الحيوية لتجديد أنسجة العظام التي يستخدم على نطاق واسع نظراً أوستيوكوندوكشن الجيدة والصفات أوستيويندوكشن. هاب لديه القدرة الجيدة ملزمة ناقلات الحمض النووي والإبقاء على استقرار ناقلات الأمراض، بما في ذلك ناقلات الأمراض الفيروسية39. مقارنة ميكروسيزيد المشمولين بالمساعدة الإنسانية، جسيمات هاب نانوسيزيد امتلاك المساحات المحددة عالية وذلك إظهار أفضل سلوك الخلوية والخصائص الميكانيكية40. لهذه الأسباب، جسيمات نهاب واحدة من مكونات السقالات. الصور SEM السطحية ومستعرضة من السقالة بلجا/نهاب هو مبين في الشكل 1 يبين أن السقالات ملفقة يحمل بنية مسام جيدا مترابطة وأحجام المسام الموزعة بانتظام. يمكن أن يؤثر تعطيل تداول الفيروس على الناقلين مادة بيولوجية نشاط الفيروس. ولذلك، قمنا باختبار بيواكتيفيتي LV الجسيمات الصادرة من السقالات التحقيق في نشاطهم تعداء. تم الإفراج عن التشكيلات الجانبية للجسيمات LV من السقالات وبهم بيواكتيفيتيس المقيمة في المختبر، مما يدل على التسليم المراقب النشطة بيولوجيا الجزيئات LV لمدة خمسة أيام (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، ركزت دراستنا في المختبر على إمكانات PDGF BB لحفز هجرة MSCs الأولية. هذه النتائج تشير إلى أن جزيئات LV أعرب BB PDGF النشطة بيولوجيا، وحفز فعالية بمسك الهجرة.

للتأكد من القدرة للأوعية والعظام التجدد في فيفو، كانت مزروع السقالات بي إلى عيوب مورين كالفاريال العظام الحرجة. وأكد تشكيل السفينة مع علامات الأوعية وتحليل RT-قبكر وكثافة الأوعية الدموية ولاحظت مع التصوير SHG/تبيف. كل من هاتين المجموعتين من التجارب أثبتت أن الأوعية وتشكيل الأوعية الدموية قد تحسنت مع معاملة السقالات المعدلة وراثيا. تشير هذه النتائج إلى أن PDGF-BB لا يحفز الأوعية مباشرة فحسب، بل أيضا الحث على جينات أخرى متعلقة بالأوعية. ومن ناحية أخرى، تبين القياسات ميكروكت أن بدجف-ب-التي تحتوي على السقالات إلى حد كبير تعزيز تكوين العظام مقارنة بغير معدلة السقالات، الذي يرتبط أيضا مع نيوفاسكولاتوري في السقالة. تشير هذه النتائج إلى أن السقالات النشطة بيولوجيا الكائنات المعدلة وراثيا، وسيحسن بتجديد الأوعية والأنسجة.

وتبين النتائج المعروضة هنا أن التعديل الوراثي لينتيفيروس بوساطة من السقالات ويسهل إصلاح العيب العظمى الكبيرة في نموذج عيب موريني كالفاريال العظام حرجة، والمحتمل من خلال تحسين الأوعية. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر في فيفو تصوير أم أداة فريدة من نوعها لفهم تولد الأوعية وتكون العظم في العظام السقالات ويتيح المزيد من الإيضاح لما إذا كانت سقالة معينة يعود بالفائدة على نيوفاسكولاريزيشن. تصوير مجهرية مولتيفوتون إينترافيتال يوفر وسيلة لفهم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للأوعية في الأنسجة والسقالات. ومع ذلك، هناك العديد من القيود عند استخدام هذا الأسلوب. أولاً، إعداد العمليات الجراحية يتطلب خبرة خاصة. الالتهابات الناجمة عن تشغيل العمال غير المهرة ستنخفض إلى حد كبير أم التصوير الجودة. ثانيا، بسبب أم التصوير الحد من السرعة، مطلوب حامل رأس ماوس مصممة خصيصا للحد من الآثار الناجمة عن ضربات القلب والتنفس. ثالثا، لتصوير طويلة الأجل، الحيوانات يجب أن تكون إينترابيريتونيلي أو عن طريق الوريد حقن المحلول الملحي منع الجفاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذه الدراسة وكان يدعمها "البرنامج الطاووس شنتشن"، الصين (رقم 110811003586331)، برنامج البحوث الأساسية شنتشن (رقم JCYJ20150401150223631، رقم JCYJ20150401145529020، ورقم JCYJ20160331190714896)، قوانغدونغ العامة البحوث وبناء القدرات الخاصة البرنامج (رقم 2015A020212030)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81501893)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية الكبرى للصين (2013CB945503)، برنامج الابتكار سيت للباحثين الشباب ممتازة (Y5G010).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) Sigma P1941 L/G ratio 75:25, MW 66000-107000
Hydroxyapatite nanoparticles Sigma 702153 Average diameter < 200 nm
Chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
FITC-conjugated 250-kD dextran Sigma FD250S
1,4-dioxane lingfeng,Shanghai 0.45 micron
Stericup filters Merck Millipore Corporation SLHV033RB
PDGF-BB Cdna Sino Biological, Inc MZ50801-G
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody  BioVision, Inc 5489-30T
PDGF-BB recombinant protein 4489-50
Calcium-phosphate transfection solution Promega Corporation E1200
L-DMEM Hyclone SH30021.01
DPBS Hyclone SH30028.01
Penicillin-Streptomycin, Liquid Thermo Fisher Scientific 15140122
FBS Thermo Fisher Scientific 10099-141
Transwell  Corning 3422
Male BALB/c mice Guangdong Medical Laboratory Animal Center 
sodium pentobarbital  Merck 1063180500
multiphoton microscopy A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG).
isoflurane Keyuan, Shandong 401750169
TRIzol reagent Invitrogen 15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) Takara RR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) Takara RR036B
Hematoxylin and eosin Beyotime C0105
Paraffin Leica  RM2235
Ultracentrifuge OPtima L-100XP Beckman Coulter L-100XP
Low-temperature printer  Tsinghua university A homemade in Tsinghua university
LightCycler 480 instrument  Roche 5815916001
microCT Bruker 1176
commercial software Bruker
Buprenorphine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
  2. Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
  3. Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
  4. Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
  5. Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
  6. Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  7. Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
  8. Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
  9. Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
  10. Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
  11. Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
  12. Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
  13. Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
  14. Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
  15. Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
  16. Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
  17. Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
  18. Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
  19. Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
  20. Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
  21. Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
  22. Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
  23. Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
  24. Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
  25. Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
  26. Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
  27. Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
  28. Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
  29. Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
  30. Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
  31. Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
  32. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
  33. Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
  34. Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
  35. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  36. Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
  37. Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
  38. Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
  39. Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
  40. Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).

Tags

الهندسة الحيوية، مسألة 127، عيوب العظام، تكوين العظام، 3D-بلجا/نهاب سقالة، محوره وراثيا، تولد الأوعية، الفحص المجهري مولتيفوتون
تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون<em> في فيفو</em> في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, J., Jahr, H., Zheng, W., Ren, P. … More

Li, J., Jahr, H., Zheng, W., Ren, P. G. Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair. J. Vis. Exp. (127), e55381, doi:10.3791/55381 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter