Abstract
中枢神経系（CNS）へのリンパ球の血管外漏出は、免疫監視のために重要です。リンパ球の血管外漏出の疾患関連変異は、CNSにおける病態生理学的変化をもたらす可能性があります。このように、CNSへのリンパ球遊走の調査は、炎症性CNS疾患を理解するために、新たな治療アプローチを開発することが重要です。ここでは、リンパ球の血管外漏出を研究するために、ヒトの血液脳関門のin vitroモデルを提示します。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）がコンフルエント血液脳関門の内皮を模倣するように挿入TRANSWELL多孔性ポリエチレンテレフタレート上に成長させます。バリア機能は、閉鎖帯occludens免疫組織化学、経内皮電気抵抗（TEER）の測定ならびにエバンスブルー透過の分析によって確認されます。 NK細胞-このモデルは、CD56 明るい CD16 dimに/ような稀なリンパ球サブセットの漏出の調査を可能にします。 Furtherm鉱石、他の細胞、サイトカインおよびケモカイン、疾患関連の変化、およびリンパ球の遊走能に異なる治療計画の効果を研究することができます。最後に、内皮バリアに炎症性刺激の影響だけでなく、異なる治療計画を解析することができます。
Introduction
組織への血液からリンパ球遊走は免疫監視のために重要です。特定の分子間相互作用の順序は、小腸、皮膚、リンパ節、中枢神経系（CNS）、および他の組織1内に部位特異的血管外遊出を確実にします。リンパ球遊走における変化は広い拡散疾患2の数の病態生理に関与しています。免疫特権CNSへの移行は厳密に調節され、それに応じて、このプロセスの変化は脳脊髄炎3、視神経脊髄炎、脳卒中、及び多発性硬化症（MS）2、4、5、6、7のようなCNS関連疾患に関与しています。したがって、より良い病気の病態生理を理解し、のためのツールを開発するために、リンパ球の血管外漏出を研究することが重要です疾病負担8、9、10、11、12の干拓。
リンパ球は、異なる経路を介してCNSに移動します。脈絡叢内の血液-脳脊髄液関門を介して、及び血液脳関門を通過くも膜下空間に後毛細血管細静脈を通って溢出1に記載されている、13、14、15。血液脳関門を横切って移動は、内皮細胞14とリンパ球との相互作用によって行われます。周囲の内皮細胞とは対照的に、CNSの内皮細胞は、それによって厳密に血液脳関門を通過することが可能な細胞およびタンパク質の量を制限する、タイトジャンクション分子を大量に発現します小娘= "外部参照"> 16。タイトジャンクションの緩みにおける炎症の結果および接着分子の発現を誘導します。従って、CNS 1、17、18へのリンパ球の遊走を増強します。
血液脳関門を介した血管外漏出は、多段階プロセスです。内皮細胞へのテザーを、リンパ球、次いで主セレクチン1、15により媒介されるプロセスにおける内皮に沿って転がります。その後、リンパ球上に発現内皮によって分泌ケモカインそれぞれケモカイン受容体との間の相互作用は、それによって内皮細胞1に強固な接着を促進し、インテグリンの立体構造変化を誘導します。最後に、血管周囲の空間にtransmigrating前に、血流に対する内皮バリアに沿っていずれかのクロールをリンパ球、または直ちに直接transmストール強固な接着1、19、20のサイトでigrate。リンパ球の血管外漏出のすべての手順は、異なる技術21を用いてインビトロで分析することができます。タイムラプスビデオ顕微鏡は、初期テザリングとローリング15を研究するために使用されます。接着アッセイは、障壁22を内皮細胞へしっかり逮捕に関する詳細な情報を提供します。ここで実証されるように遊出アッセイは、免疫細胞の遊出21、23、24、25、26、27、28、29の分析を可能にします。
体外血液脳関門モデルに人間を使用して、我々は最近、高いMIGRことを示すことができましたCD56 明るい CD16 dimに/のatory容量-そのCD56 ディム CD16 +対応物と比較して、NK細胞は、クモ膜下区画21において、このNK細胞サブセットの優位性により反映されました。したがって、我々の実験は、in vivoでの状況を模倣するのに適しのようです。
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Protocol
ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）1.細胞培養
- 細胞培養フラスコのコーティング
- フィブロネクチン溶液を調製し、15 mL遠心管に10mLのPBSを加えます。 150μLのフィブロネクチンを加え、よく混ぜます。
- 底部を覆うようにT-25細胞培養フラスコは、フィブロネクチン溶液2mLを加えます。インキュベーター中で37℃で少なくとも3時間、細胞培養フラスコをインキュベートします。フィブロネクチンコーティングしたフラスコを37℃/ 5％CO 2で2週間貯蔵することができます。
- シーディングとHBMECの細胞培養
- 細胞培養フラスコの底から吸引フィブロネクチン溶液。 6mLのECM-B培地に懸濁7.2×10 4 HBMEC / cm2での追加（= ECM-Bは、5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％の内皮細胞増殖サプリメントを補充しました）。 37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。顕微鏡を用いて毎日細胞増殖を確認してください。
- 3日ごとに培地を変更します。HBMECが約80％コンフルエンスに達し収穫または分割細胞、。 HBMECは、生理学的特性の損失を避けるために、継代1と15の間で使用されるべきです。
- 収穫HBMEC。
- 1の比でPBSでACCUTASE（1X）を混合することにより、ACCUTASE溶液を調製する：1。さらに使用するまで水浴中で37℃でACCUTASEソリューションをしてください。
- 15mLの遠心管に細胞培養フラスコからECM-B培地を移します。洗浄HBMEC細胞培養フラスコの底に5 mLのPBSを添加することによって。吸引PBSと洗浄工程を繰り返してさらに2回。
- 2 mLのACCUTASE予め温めソリューションを追加します。 2分間37℃でインキュベートします。その後、HBMECはしっかりと細胞培養フラスコを数回タップして再懸濁されています。細胞の剥離を顕微鏡を用いて制御されます
- 以前に15 mLチューブに格納されたECM-B媒体はすぐHBMECデタッチし始めるようにバック細胞培養フラスコに添加します。最もHBMECがあるまで繰り返しフラスコの底をすすぎます再懸濁しました。
- 15mLの遠心管に細胞懸濁液を移します。室温で10分間、300×gで遠心分離。上清を捨て、1mLのECM-B培地中に細胞を再懸濁。細胞をカウントし、mLのECM-B培地あたり3×10 5 HBMECの最終濃度を達成するために、細胞懸濁液を希釈します。
細胞培養インサートの調製
- 細胞培養インサートのコーティング
重要な注意 ：細胞培養インサートの膜に触れないようにしてください。- 各細胞培養インサートに100μLのフィブロネクチン溶液（1.1.1を参照）（ 図1A）、96ウェル平底プレートの1つのウェル（光制御ウェル）を加えます。 37℃で少なくとも3時間インキュベートします。インキュベーション吸引フィブロネクチンソリューションの後。
- 細胞培養インサートとウェルの光学制御に100μLHBMEC懸濁液を加えます。 600μlのECM-B媒体は、セルの下部コンパートメントに追加します培養インサート。 3インキュベート-障壁の完全性（ 図1B）が到達するまでCO 2、37℃/ 5％で4日間、ウェルの光学制御にHBMECの微視的評価によって細胞増殖を確認。注意：4日先以降の細胞増殖を、お勧めしません。
- オプション：炎症状態を模倣するためには、下部区画から培地を吸引し、24時間遊走アッセイ前に500 U / mLのIFN-γ/ TNF-αを補充したECM-B培地と交換してください。
遊出アッセイの日にエバンスブルー3.品質管理
- エバンスブルー溶液の調製
- 15mLの遠心チューブを用いて200μlのB27サプリメントとPBS / B27溶液混合物10 mLのPBSを調製しました。エバンスブルーストック溶液を希釈した（20mg / mLのPBS）1：PBS / B27 1,000。
- エバンスブルー透過性アッセイ
- 上部コンパートメントに続く下部コンパートメントから培地を吸引コンフルエントHBMEC単層を含有するもの、細胞培養インサート。細胞培養インサートに100μLエバンスブルー溶液を追加します。
- 下部コンパートメントに600μLのPBS / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で60分間インキュベートします。慎重にピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り外します。
- エバンスブルーの測定
- 下部コンパートメントからPBS / B27を除去し、黒色ポリスチロール96ウェル平底プレートの2つのウェルに100μLずつ移します。テカンインフィニットM200プロプレートリーダーでプレートを挿入し、最適なz位置を決定します。
- （例：励起：620nmで、発光：680nmの励起帯域幅：9nmで、発光帯域幅：20nmの、175x強調、25のフラッシュ、積分時間：20マイクロ秒）エバンスブルー用いて、各設定の尺度励起。
- HBMECバリア機能を決定するためにシードした後の異なる時点でHBMEC横切るエバンスブルー透過性を示す標準曲線に取得したデータを比較しますINGの細胞（右図1B）。
4.移動アッセイ
- 末梢血単核細胞（PBMC）の調製。
- 15 mLの遠心分離管に10 mLのRPMIを追加し、200μLB27のサプリメントを追加します。 5分間300×gでPBMCと遠心細胞を数えます。 5×10 6細胞/ mLでRPMI / B27の最終濃度にPBMCを再懸濁。
- 移動アッセイのセットアップ
- コンフルエントHBMEC単層（ 図1A）を含む細胞培養インサートの上部区画に続く下部区画から吸引媒体。ドナーあたりにつき24ウェルプレートの1つのウェル（in vitroでの対照）にも、細胞培養インサート100μLPBMC懸濁液各々を追加し。
- in vitroでの対照のPBMCに細胞培養インサート500μLの下部区画に600μLのRPMI / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で6時間インキュベートします。
- 移行したPBMCの収穫
- ピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り出し、慎重に膜を触れることなく400μLPBSでボトムをすすぎます。細胞培養インサートを廃棄します。
- ならびにインビトロ制御するために挿入してよく混合細胞培養の下部コンパートメントに20μLフローカウント蛍光粒子（約1,000ビーズ/μL）を加えます。転送サイトメトリー管を流れるようにPBMC懸濁液を得1mLの。
5.フローサイトメトリー
- サンプル調製
- 室温で5分間、300×gで遠心分離PBMC。
- 100μLに蛍光標識抗体を添加することによって抗体溶液を調製するには、サンプルあたり緩衝液（PBS / 1％BSA / 2mMのEDTA）フローサイトメトリー。 1μLCD4-FITC、1μLCD3-PerCPを/ Cy5.5を以下に示す結果を得るために、1μLCD56-PC7、1μLCD8-A700、および1μLのCD16-A750は、サンプルごとに使用しました。
- 再懸濁PB抗体溶液の100μLにMC、4℃で30分間インキュベートします。
- 250μLを5分間300×gでバッファと遠心フローサイトメトリーを追加します。
- サンプル取得
- フローサイトメトリー緩衝液の必要量の再懸濁PBMC（使用するフローサイトメーターに依存して変化します）。
- （ - 700 nmの励起488 nmの発光525）フローカウント蛍光粒子を検出するために525と700 nmの波長の間の活性検出器を、フローサイトメーターを用いて染色したPBMCを取得します。
（カルツァGソフトウェアで動作サイトメーターGallios流れた場合、次の手順は一例では、使用される：（1）コンピュータを起動し、オペレーティングシステムが完全にロードされたとき（2）、ボタン「オンサイトメーター」を押すことでフローサイトメーターを開始します。 （3）「オープンプロトコル」ボタンを押すことにより、それぞれの取得プロトコルをロードする。（4）必要なプロトコルを選択し、「開く」を選択する。（5）右でクリックすることにより、すべてのサンプルのためのプロトコルを複製フィールド上の仮想カルーセルと左クリックで表示プロトコルの上でマウスボタンは、「複製」。 （6）サンプル・リスト内の各サンプルにラベルを付けます。 （7）カルーセルの示された位置にサンプルを移し、取得を開始します。）
- サンプル分析
- それぞれのソフトウェアを使用してフローサイトメトリーのデータを結果として開きます。 in vitroでの対照ウェルから遊出PBMCの対象ならびに細胞の亜集団の数を決定し、それぞれの分析ソフトウェアを使用してカウント蛍光粒子を流れます。
ゲーティング戦略を結果部分に与えられている（実施例（ 図1 C：NK細胞サブセットの遊出を分析するために、第一前方散乱チャネル（FSC）プロット対側方散乱チャネル（SSC）中でリンパ球を選択リンパ球です。次いで、CD56プロット対CD3及びCD56 + CD3に表示- NK細胞が選択されるNK細胞サブセットを区別するために、NK細胞は、で表示されますCD56 CD16に対してプロット及びCD56 明るい CD16 /暗く-ならびにCD56 ディム CD16 + NK細胞が選択されます。また、流量計蛍光粒子は、SSCプロット対FSCから選択され、その後、それらの数を決定するための時間対525と700nmの間の発光を有するチャネルのプロットで表示します）。 - 各試料の総細胞数を計算するために、流量計蛍光粒子を用いた細胞の検出数を正規化します。
- in vitroでの制御中の全遊走細胞と全細胞の比として遊走した細胞のパーセンテージを決定します。
- それぞれのソフトウェアを使用してフローサイトメトリーのデータを結果として開きます。 in vitroでの対照ウェルから遊出PBMCの対象ならびに細胞の亜集団の数を決定し、それぞれの分析ソフトウェアを使用してカウント蛍光粒子を流れます。
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Representative Results
ヒト血液脳関門モデル（ 図1A）を使用して、NK細胞およびT細胞サブセットの遊出を示す代表的な結果が示されています。 HBMEC単層の完全性は、タイトジャンクション分子ZO-1、経内皮電気抵抗（TEER）の測定、及びエバンスブルー透過（ 図1B）の染色によって確認しました。 3次- 4日間培養HBMECは、タイトジャンクション分子ZO-1（左図1Bを ）発現しました。さらに、HBMEC（右図1B）エバンスブルーのための経内皮電気抵抗（ 図1Bの中央）ならびに減少浸透を示す単層で成長しました。 2元として及びCD56 ディム CD16 + NK細胞サブセット及びCD4 +およびCD8 + T細胞を含むT細胞- HBMEC単層をCD56 明るい CD16 dimに/を含むNK細胞の遊出を研究するために使用されましたamples（それぞれ図1D + E）。遊走した細胞のパーセンテージを、内部コントロール（ 図1C）のようにフローサイトメトリーと正規使用してフローカウント蛍光粒子によって得られた細胞数に基づいて計算しました。 HBMEC単層は、炎症状態を模倣するためにアッセイする以前にIFN-γおよびTNF-αの24時間で刺激しました。サイトカイン刺激はすべて分析したリンパ球集団の移動の増加が生じました。これは、ICAM-1（データは示していない）を含む接着分子の発現増加によるものかもしれません。 CD56 明るい CD16 dimには、/ -両方の非刺激（10.88パーセント対 0.86パーセント）を横切って彼らのCD56 ディム CD16 + NKと比較した場合、NK細胞は、より高い遊走能を示し、IFN-γγ/ TNF-αは、（18.22パーセント対 2.94パーセント）を刺激しましたHBMEC（ 図1D）。しかしながら、炎症の結果として遊出の相対的増加は、CD56 ディム CD16 +ために高かったです明るい CD16 dimに用+ 342パーセント対 + 167パーセント/ - ）>アップ。これらの結果は、CD56 明るい CD16は/暗くすることをin vivoで観察を模倣- NK細胞は、クモ膜下区画に富んでいます。従って、血液脳関門モデルはCNS 21に稀リンパ球集団の免疫細胞の漏出の基本原理を解析するのに好適であると思われます。最後に、CD4およびCD8 T細胞サブセットのtransmigratory容量が（ 図1E）が示されています。
図1：非炎症及び炎症HBMEC単層を通過するNK細胞サブセットの差動移行。 A.トランスウェルインサート（左）と実験（右）の例示の画像。 HBMECバリア機能のB.検証。左：タイトジャンクションモルの免疫組織化学的染色ecule ZO-1ウサギ抗ヒトZO-1（Abcam社、1：200）を使用し、ヤギ抗ウサギIgG-Cy3の（1：300）HBMECで3日間培養しました。中心：2日目及び培養の4日間HBMECの経内皮電気抵抗（TEER）。右：（「炎症」赤）または24時間、500 U / mLのIFN-γおよびTNF-αを有する（「非炎症」黒）刺激なしとHBMECためのエバンスブルー透過性の標準曲線。 96時間HBMEC（黒矢印）の播種後 - 遊出アッセイを72行われます。 CE。プロトコルセクションに記載されているように16の健康な個体に由来するPBMCは、遊走アッセイに供しました。アッセイ前の24時間は、細胞培養インサートの半分が500 IU / mLのIFN-γおよびTNF-αで刺激しました。遊出細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析しました。 PBMC用C.代表的な結果は、ウェル（上）および非炎症HBMEC（下）を横切って移動した後、in vitroでコントロールに由来します。 NK CEL LSはCD3総リンパ球からゲートされた- CD56 +細胞とさらに区別をCD56 明るい CD16のDIM /に- （ " 明るい CD56 "）およびCD56 ディム CD16 + NK細胞のサブセット（" CD56 薄暗いです "）。フローカウント蛍光粒子（「ビーズ」）は、FSC / SSC特性に基づいてゲートされ、その数は時間プロット対FL3で決定しました。移行CD56 明るく CD56 ディム NK細胞のパーセンテージを決定するための例示的な計算は、右側に示されています。移行NK細胞のD.パーセンテージならびにCD56 明るく CD56 ディム NK細胞サブセット、およびCD4 +及び非炎症（黒）の両端の遊出又は炎症（赤）は、以下のCD8 + T細胞サブセットを含む移行T細胞のE.百分率 HBMECは平均±SEMとして示されています。 P値は対応のあるスチューデントt検定により計算しました。 ** P <0.01、*** P <0.001。/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、ヒトの血液脳関門を通過するリンパ球の遊出を調査する手法を提示します。 CNSへのリンパ球遊走のin vitroでの解析では 、リンパ球の血管外漏出、潜在的な疾患関連の変更、および新しい治療アプローチの基本的なプロセスを研究することが重要です。
血液脳関門モデルのいくつかの変更が可能です。例えば、上部区画からの細胞を非遊走細胞集団の組成を調べるために分析することができます。さらに、アッセイの24時間前にIFN-γおよびTNF-αとHBMEC単層の処理は、炎症性CNS疾患21、25の効果を研究するために炎症を起こし、血液脳関門を模倣するために使用することができます。同様に、他の物質とHBMECまたはリンパ球の処置は、リンパ球の血管外遊出に及ぼす影響を調べることができ（ 例えば、それらを接着分子に対する効果）30、31。特定の接着分子の関与は、インテグリンまたはそのリガンド32遮断抗体を使用して研究することができます。さらに、ここで提示実験は、星状細胞または他の細胞33に由来するケモカインまたは上清から走化性効果の分析を可能にする34。初代ヒト脳由来の上皮細胞とHBMECの交換は、血液脳脊髄液関門15の調査のために、この実験のスペクトルを広げます。 HBMECモデルのCNS特異性を維持するために、他の臓器に由来する不死化内皮細胞または細胞に置き換えるべきではありません。しかしながら、他の種からの脳由来の内皮細胞は、それぞれ動物35に遊出を分析するために使用されるかもしれません。また、レチノイン酸またはヒドロocortisoneバリア機能を高めるために記載されており、したがって、36、37を用いるかもしれません。我々のモデルは、2×10 5と1×10 6 PBMC（データは示さず）との間の線形回収率を提供するため、限られた細胞数の場合にはアッセイに供した細胞の量は、減少されるかもしれません。遊出以下希少細胞集団を分析することは、フローサイトメトリーのために必要な十分な細胞を得るために、いくつかのウェルからプール細胞に必要であるかもしれません。最後に、私たちの実験はまた、CNS 38への薬物送達を研究するために使用することができます。 0.4μmの孔径は、リンパ球の遊出を妨げるが、薬物送達の39、40、41、42を研究することができ、一方、3μmの孔サイズは、典型的には、リンパ球の遊出を可能にするために使用されます。
43における血液脳関門の完全性を評価するために実証されたようにHBMEC単層の品質は、合流の顕微鏡的評価だけでなく、エバンスブルーの浸透によって分析することができます。低グラム力と早期継代の使用でHBMECの遠心分離（ すなわち
ここで説明されたプロトコルの遵守が有意義かつ再現性のある結果を保証するが、この技術は、いくつかの制限を有しています。まず、 インビボで血液脳関門は、様々な方法で相互作用し、タイトジャンクション1の形成に影響を与えることにより、バリア機能を強化した細胞の数によって形成されます。この血液脳関門モデルは、in vivoでの状況の良好な近似値であるにもかかわらずそのため、重要な側面が欠落しています。加えて、血液脳関門を横切ってCNSへのリンパ球の血管外遊出は、多段階プロセスです。各シングルステップを個別に調査することができますが、ここで紹介するテクニックは誰についての情報を提供していません。剪断力2、44、45、46の影響下溢出のル・プロセス。細胞の通常のみ一桁の周波数が遊出ので最後に、PBMCから移動した細胞の分析は、目的の細胞の頻度に応じて挑戦することがあります。したがって、複数の細胞培養インサートを横切って移動した細胞のアッセイまたはプーリングの前に関心の集団の分離が必要であるかもしれません。 CNSへの白血球遊走を分析するための他のモデルは、我々のモデルに欠けている側面の一部をカバーしています。アストロサイト、周皮細胞、および/または神経細胞との共培養は、47より良い血液脳関門の複雑さを模倣するために使用されています。そのようなDIV-BBBなどのせん断力を含むモデルは、リンパ球漏出48のより高度な分析を可能にする、従って、より多くの生理学的条件を反映しています。 要約すると、我々は、ヒトの血液脳関門を通過定性的および定量的なリンパ球の漏出の調査に適して簡単にアクセスできる方法を提示します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1 mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
References
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