Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Lymfocyt extravasering in i det centrala nervsystemet (CNS) är kritisk för immunövervakning. Sjukdomsrelaterade förändringar av lymfocyter extravasering kan resultera i patofysiologiska förändringar i CNS. Sålunda, är undersökning av lymfocyt migration in CNS viktigt att förstå inflammatoriska CNS-sjukdomar och att utveckla nya terapi tillvägagångssätt. Här presenterar vi en modell in vitro av blod-hjärnbarriären för att studera lymfocyter extravasering. Mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller (HBMEC) är confluently odlas på en porös polyetylentereftalat Transwell infoga att härma endotelet av blod-hjärnbarriären. Barriärfunktionen är validerat av zonula occludens immunohistokemi, transendotelial elektrisk resistans (TEER) mätningar samt analys av Evans Blue permeation. Denna modell möjliggör undersökning av diapedes av sällsynta lymfocytundergrupper såsom CD56 ljusa CD16 dim / - NK-celler. Furthermmalm, effekterna av andra celler, cytokiner och kemokiner, sjukdomsrelaterade ändringar och distinkta behandlingsregimer på migrationskapacitet av lymfocyter kan studeras. Slutligen kan effekten av inflammatoriska stimuli samt olika behandlingsregimer på endothelial barriären analyseras.

Introduction

Lymfocyter migration från blodet till vävnader är avgörande för immunövervakning. En sekvens av specifika molekylära interaktioner säkerställer lägesspecifik extravasering in i tunntarmen, hud, lymfkörtlar, det centrala nervsystemet (CNS), och andra vävnader 1. Förändringar i lymfocyter migration är inblandade i patofysiologin av ett antal breda sprida sjukdomar 2. Migrering in immun-privilegierade CNS är hårt reglerad och följaktligen förändringar av denna process är involverade i CNS-relaterade sjukdomar som encefalomyelit 3, neuromyelitis optica, stroke och multipel skleros (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Därför är det viktigt att studera lymfocyter extravasering att bättre förstå sjukdomen patofysiologi och att utveckla verktyg för en melioration sjukdomsbörda 8, 9, 10, 11, 12.

Lymfocyter vandrar in i CNS via olika vägar. Extravasation genom postkapillära venoler i det subaraknoidala utrymmet via blod-cerebrospinalvätska barriär inom de choroid plexus och över blod-hjärnbarriären har beskrivits 1, 13, 14, 15. Migrering genom blod-hjärnbarriären utföres genom interaktion av lymfocyter med endotelceller 14. I motsats till endotelceller i periferin, endotelceller i CNS uttrycker höga mängder av Täta fogar molekyler, vari strikt begränsa mängden av celler och proteiner som kan korsa blod-hjärnbarriärenlass = "xref"> 16. Inflammation resulterar i uppluckring av täta förbindelser och inducerar expression av adhesionsmolekyler; sålunda, förbättra lymfocyt migration in CNS 1, 17, 18.

Extravasering via blod-hjärnbarriären är en flerstegsprocess. Lymfocyter tjuder till endotelcellerna och sedan rulla längs endotelet i en process huvudsakligen förmedlas av selektiner 1, 15. Därefter, interaktioner mellan kemokiner som utsöndras av endotelet och respektive kemokinreceptorer som uttrycks på lymfocyter inducerar konformationsförändringar av integriner, därigenom främja fast adhesion till endotelcellerna 1. Slutligen, lymfocyter antingen krypa längs den endoteliala barriären mot blodflödet innan transmigrating in i perivaskulära utrymmet, eller stall omedelbart och direkt transmigrate vid stället för fast adhesion 1, 19, 20. Alla dessa steg av lymfocyt extravasering kan analyseras in vitro med användning distinkta tekniker 21. Time-lapse video mikroskopi används för att studera den initiala tjudra och rullande 15. Adhesionsanalyser ger detaljerad information om fast gripande att endotelceller hinder 22. Transmigration analyser som visat här möjliggör analys av immuncellstrans 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Använda människa in vitro blodhjärnbarriären modell kunde vi nyligen visar att en högre MIGRAtory kapacitet på CD56 ljusa CD16 dim / - NK-celler jämfört med deras CD56 dim CD16 + motsvarigheter återspeglades av en dominans av denna NK-cellunderuppsättning i det intratekala utrymmet 21. Således verkar vår experimentuppställning för att vara lämplig att efterlikna in vivo situationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture of Human Brain mikrovaskulära endotelceller (HBMEC)

  1. Beläggning av cellodlingsflaskor
    1. Att förbereda fibronektin lösningen, tillsätt 10 ml PBS till en 15 ml centrifugrör. Tillsätt 150 mikroliter fibronektin och blanda väl.
    2. För att täcka botten en T-25 cellkultur kolv tillsätt 2 ml av fibronektinlösningen. Inkubera cellkulturflaska i minst 3 timmar vid 37 ° C i inkubatorn. Fibronektinbelagda kolvar kan lagras under 2 veckor vid 37 ° C / 5% CO2.
  2. Sådd och cellodling av HBMEC
    1. Aspirera fibronektin lösning från botten av cellodlingskolv. Lägg 7,2 x 10 4 HBMEC / cm suspenderades i 6 ml ECM-b-medium (= ECM-b kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin och 1% endotelcelltillväxt tillägg). Inkubera vid 37 ° C / 5% CO2. Kontrollera celltillväxt dagligen använder ett mikroskop.
    2. Ändra mediet var 3 dagar.Skörd eller dela celler, när HBMEC når ungefär 80% konfluens. HBMEC bör användas mellan passage 1 och 15 för att undvika förlust av fysiologiska egenskaper.
  3. Harvest HBMEC.
    1. Förbereda Accutase lösning genom blandning av Accutase (1x) med PBS i ett förhållande av 1: 1. Hålla Accutase lösning vid 37 ° C i ett vattenbad tills vidare användning.
    2. Överföra ECM-b mediet från cellodlings kolven till en 15 ml centrifugrör. Tvätta HBMEC genom att tillsätta 5 ml PBS till botten av cellodlingskolv. Aspirera PBS och upprepa tvättsteg två gånger.
    3. Lägg 2 ml förvärmd Accutase lösning. Inkubera vid 37 ° C under 2 min. Efteråt HBMEC återsuspenderas genom att bestämt trycka på cellkultur kolv flera gånger. Celllösgör styrs med användning av ett mikroskop
    4. ECM-b-mediet som tidigare lagrats i ett 15 ml rör sättes tillbaka till cellkulturflaskan så snart HBMEC börjar lossna. Skölj botten av flaskan upprepade gånger tills det mesta HBMEC ärresuspenderas.
    5. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid rumstemperatur. Kasta supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml ECM-b-medium. Räkna celler och späd cellsuspensionen för att uppnå en slutlig koncentration av 3 x 10 5 HBMEC per ml ECM-b-medium.

2. Framställning av Cell Culture Inserts

  1. Beläggning av cellodlingsinsatser
    Viktigt: Undvik att vidröra membranet i cellodlingsinsatser.
    1. Lägga 100 mikroliter fibronektin lösning (se 1.1.1) till varje cellodlingsinsats (Figur 1A) och en brunn i en 96-brunnars flatbottnad platta (optisk kontrollbrunn). Inkubera under åtminstone 3 h vid 37 ° C. Efter inkubation aspirera fibronektin lösning.
    2. Lägga 100 mikroliter HBMEC suspensionen till cellodlingsinlägg och den optiska kontrollbrunnen. Lägg 600 pl ECM-b medium till den undre avdelningen av cellenodlingsinsatser. Inkubera under 3 - 4 dagar vid 37 ° C / 5% CO2 till dess barriärintegritet (Figur 1B) har uppnåtts, ta celltillväxt genom mikroskopisk utvärdering av HBMEC i den optiska kontrollbrunnen. Obs: Celltillväxt mer än fyra dagar rekommenderas inte.
    3. Valfritt: För att efterlikna inflammatoriska tillstånd aspirera mediet från den undre avdelningen och ersätta den med ECM-b-medium kompletterat med 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 timmar före analysen migration.

3. Kvalitetskontroll med Evans Blue på Day of the Trans Assay

  1. Beredning av Evans Blue-lösning
    1. Att förbereda PBS / B27-lösning mix 10 ml PBS med 200 | il B27 supplement med användning av ett 15 ml centrifugrör. Späd Evans Blue stamlösning (20 mg / ml PBS) 1: 1000 med PBS / B27.
  2. Evans blue permeabilitetsanalys
    1. Aspirera mediet från den nedre avdelningen följs av den övre avdelningenav en cellkultur insättning innehållande ett sammanflytande HBMEC monoskikt. Tillsätt 100 mikroliter Evans Blue lösning cellodlingsinsats.
    2. Lägga 600 mikroliter PBS / B27 till det nedre utrymmet och inkubera i 60 min vid 37 ° C / 5% CO2. Försiktigt bort cellodlingsinsats med hjälp av pincett.
  3. Evans blue mätning
    1. Ta bort PBS / B27 från den undre avdelningen och överföra 100 mikroliter vardera till två brunnar i en svart polystyren 96-brunnars flatbottnad platta. Infoga platta i en Tecan Oändlig M200 Pro plattläsare och bestämma optimala z-positionen.
    2. Mått excitation av Evans Blue med användning av respektive inställningar (till exempel: excitation: 620 nm, emission: 680 nm, exciteringsbandbredden: 9 nm, emission bandbredd: 20 nm, 175x förbättring, 25 blinkar, tid för integrering: 20 | is).
    3. Att bestämma HBMEC barriärfunktioner jämför förvärvat data till en standardkurva som visar Evans Blue permeation genom HBMEC vid olika tidpunkter efter utsädeing celler (Figur 1B, höger).

4. Migration Assay

  1. Beredning av perifera mononukleära blodceller (PBMC).
    1. Lägga 10 ml RPMI till ett 15 ml centrifugrör och tillsätt 200 | il B27 supplement. Räkna PBMC och centrifugera celler vid 300 xg under 5 min. Återsuspendera PBMC till en slutlig koncentration av 5 x 10 6 celler / ml RPMI / B27.
  2. Set-up av analys migration
    1. Aspirera medium från den nedre avdelningen följs av den övre avdelningen av cellodlingsinsatser innehållande konfluenta HBMEC monoskikt (Figur 1A). Per donator lägga 100 mikroliter PBMC-suspensionen vardera till cellodlingsinsatser och även till en brunn i en 24-brunnars platta per (in vitro kontroll).
    2. Lägga 600 mikroliter RPMI / B27 till den undre avdelningen av de cellodlingsinsatser och 500 mikroliter till PBMC för kontroll in vitro och inkubera 6 h vid 37 ° C / 5% CO2.
    3. Skörd av migrerade PBMC
      1. Ta ut cellodlingsinsats med hjälp av pincett och försiktigt skölja botten med 400 mikroliter PBS utan att vidröra membranet. Kasta cellodlingsinsats.
      2. Tillsätt 20 ul flödes count fluorosfärer (ca 1000 pärlor / il) och den undre avdelningen av cellodlingen för in såväl som till den in vitro-kontroll och blanda väl. Överföring 1 ml resulterande PBMC-suspensionen till flödescytometri rör.

    5. Flödescytometri

    1. provberedning
      1. Centrifug PBMC vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
      2. Bereda antikroppslösningen genom tillsats av fluorokromkonjugerade antikroppar till 100 mikroliter flödescytometri buffert (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per prov. För de resultat som presenteras nedan ett pl CD4-FITC var ett μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 mikroliter CD8-A700, och en pl CD16-A750 användes per prov.
      3. Återsuspendera PBMC i 100 mikroliter av antikropplösning och inkubera under 30 min vid 4 ° C.
      4. Tillsätt 250 pl flödescytometri buffert och centrifugera vid 300 xg under 5 min.
    2. prov förvärv
      1. Återsuspendera PBMC i den erforderliga mängden (varierar beroende på flödescytometern användes) av flödescytometri buffert.
      2. Förvärva färgade PBMC med användning av en flödescytometer med en aktiv detektor mellan 525 och 700 nm våglängd för att detektera flödes count fluorosfärer (excitation 488 nm, emission 525 - 700 nm).
        (Följande steg är ett exempel om en Gallios flödescytometer drivs med Kaluza G programvara används:. (1) Starta datorn (2) När operativsystemet är fullastad, starta flödescytometern genom att trycka på "cytometern på" -knappen . (3) Fyll på respektive förvärvsprotokollet genom att trycka "öppet protokoll" -knappen. (4) Välj önskat protokoll och välj "öppna". (5) Duplicate protokollet för varje prov genom att klicka med den högramusknapp på protokollet syns i den virtuella karusell och en vänsterklicka på fältet "duplicate". (6) Etikett varje prov i provlistan. (7) Ta proverna till de angivna positionerna för karusellen och börja förvärvet.)
    3. provanalys
      1. Open vilket flödescytometri data med hjälp av respektive program. Bestämma antalet subpopulationer av intresse för transmigrated PBMC liksom celler från in vitro-kontrollbrunnar och flödes count fluorosfärerna användning av respektive analysmjukvara.
        (Ett exempel på grindningsstrategin ges i resultatdelen (Figur 1 C: För att analysera transmigration av NK-cellundergrupper, först välja lymfocyter i en sidledes spridningskanal (SSC) relativt framåtspridning kanal (FSC) plot Lymfocyter är. visas sedan i en CD3 kontra CD56 tomt och CD56 + CD3 -. NK-celler är valda För att skilja mellan NK-cellundergrupper, är NK-celler visas ien CD56 kontra CD16 tomt och CD56 ljusa CD16 dim / - liksom CD56 dim CD16 + NK-celler selekteras. Dessutom är flödes count fluorosfärer vald från en FSC kontra SSC tomt och därefter visas i en kurva över en kanal med ett emissions mellan 525 och 700 nm mot tiden för att bestämma deras antal.)
      2. Att beräkna den totala cellantalet i varje prov, normalisera det detekterade antalet celler med användning av flödes count fluorosfärer:
        Ekvation
      3. Bestämma procentandelen av migrerade celler som förhållandet mellan totala migrerade celler och totala antalet celler i den in vitro-kontrollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat som visar transmigration av NK-cell och T-cell-underuppsättningar med användning av humant blod-hjärnbarriären modell (Figur 1A) visas. Integriteten hos HBMEC monoskiktet validerades genom färgning av den täta förbindningen molekylen ZO-1, transendotelial elektrisk resistans (TEER) mätningar, och Evans Blue trängning (Figur 1B). Följande 3 - 4 dagar kultur HBMEC uttryckte den täta förbindningen molekylen ZO-1 (Figur 1B, vänster). Vidare HBMEC växte i monoskikt som uppvisar transendotelial elektriska motståndet (Figur 1B mitten) samt minskad permeation för Evans Blue (Figur 1B, höger). HBMEC monoskikt användes för att studera den transmigration av NK-celler, inklusive CD56 ljusa CD16 dim / - och CD56 dim CD16 + NK-cellundergrupper och T-celler inkluderande CD4 + och CD8 + T-celler som två expel (Figur 1D + E, respektive). Den procentuella andelen av migrerade celler beräknades baserat på cellräkningar erhållna genom flödescytometri och normaliserade med användning count flödes fluorosfärer som en intern kontroll (Figur 1C). Den HBMEC monoskikt stimulerades med IFN-γ och TNF-α 24h före analysen för att efterlikna inflammatoriska tillstånd. Cytokin stimulering resulterade i ökad migration av alla analyserade lymfocytpopulationer. Detta kan vara på grund av att ett ökat uttryck av adhesionsmolekyler inklusive ICAM-1 (data visas inte). CD56 ljusa CD16 dim / - NK-celler uppvisade en högre migrationskapacitet jämfört med deras CD56 dim CD16 + NK över både ostimulerade (10,88% mot 0,86%) och IFN-γγ / TNF-α stimulerad (18,22% mot 2,94%) HBMEC (figur 1D). Var emellertid den relativa ökningen av transmigration som ett resultat av inflammation högre för CD56 dim CD16 + vs. + 167% för CD56 ljusa CD16 dim / -). Dessa resultat härma observationerna in vivo att CD56 ljusa CD16 dim / - NK-celler anrikas i det intratekala utrymmet. Sålunda synes blod-hjärnbarriären modell för att vara lämplig att analysera grundläggande principerna för immuncell diapedes av sällsynta lymfocytpopulationer i CNS 21. Slutligen transmigratory kapacitet av CD4 och CD8 T-cellunderuppsättningar visas (figur 1E).

Figur 1
Figur 1: Differential Migration av NK-cellundergrupper tvärs icke inflammerat och Inflammerade HBMEC Monoskikt. A. En bild av transwell insatser (vänster) och illustration av det experimentella uppställningen (höger). B. Validering av HBMEC barriärfunktioner. Vänster: immunhistokemisk färgning av den täta korsningen molecule ZO-1 med användning av kanin-anti-human ZO-1 (Abcam, 1: 200) och get-anti-kanin-IgG-Cy3 (1: 300) på HBMEC odlades i 3 dagar. Centrum: transendotelial elektriska motståndet (TEER) av HBMEC mellan dag 2 och dag 4 för odling. Höger: standardkurva för Evans Blue permeation för HBMEC med ( "inflammerad", röd) eller utan ( "icke inflammerat", svart) stimulering med 500 U / ml IFN-γ och TNF-α i 24 timmar. Transmigration analyser utförs 72 - 96 timmar efter sådd av HBMEC (svart pil). CE. PBMC härledd från 16 friska individer utsattes för migrationsanalyser såsom beskrivits i protokollet sektionen. 24 h före analysen, var halv av cellodlingsinsatser stimulerades med 500 lE / ml IFN-γ och TNF-α. Transmigrated celler skördades och analyserades med flödescytometri. C. Representativa resultat för PBMC härledd från kontroll in vitro väl (överst) och efter migration över icke inflammerat HBMEC (botten). NK cel ls var gated från totala lymfocyter som CD3 - CD56 + -celler och vidare särskiljas i CD56 ljusa CD16 dim / - ( "CD56 ljusa ") och CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") NK-cellunderuppsättningar. Flödes count fluorosfärer ( "pärlor") fram gated baserat på FSC / SSC-egenskaper och deras antal bestämdes i en FL3 kontra tidskurva. Exemplifierande beräkningar för att bestämma den procentuella andelen av migrerade CD56 ljusa och CD56 dim NK-celler visas till höger. D. Procentandel migrerade NK-celler såväl som CD56 ljusa och CD56 dim NK-cellunderuppsättningar, och E. procentandel av migrerade T-celler inkluderande CD4 + och CD8 + T-cellunderuppsättningar följande transmigration över icke inflammerat (svart) eller inflammerad (röd) HBMEC avbildad som medelvärde ± SEM. P-värden beräknades genom parat Students t-test; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi en teknik för att undersöka trans av lymfocyter över blod-hjärnbarriären. In vitro analys av lymfocyter migration till CNS är viktigt att studera grundläggande processer av lymfocyter extravasering potentiella sjukdomsrelaterade förändringar och nya behandlingsmetoder.

Flera modifieringar av blod-hjärnbarriären modell är möjliga. Till exempel, kan celler från det övre rummet analyseras för att undersöka sammansättningen av den icke-migrerade cellpopulation. Vidare kan behandling av HBMEC monoskiktet med IFN-γ och TNF-α 24 timmar före analysen användas för att efterlikna en inflammerad blod-hjärnbarriären för att studera effekten av inflammatoriska sjukdomar i centrala nervsystemet 21, 25. På liknande sätt ger behandling av HBMEC eller lymfocyter med andra ämnen tillåter att undersöka deras effekter på lymfocyt extravasering (t.ex. deraseffekt på adhesionsmolekyler) 30, 31. Kan studeras medverkan av vissa adhesionsmolekyler använder blockerande antikroppar för integriner eller deras ligander 32. Vidare experimentuppställning som presenteras här tillåter analys av kemotaktiska effekter från kemokiner eller supernatanter härledda från astrocyter eller andra celler 33, 34. Ersättning av HBMEC med primära humana hjärn härledda epitelceller breddar spektrumet för denna experimentuppställning för undersökning av blod-cerebrospinalvätska barriär 15. HBMEC bör inte ersättas med immortaliserade endotelceller eller celler härledda från andra organ för att bibehålla CNS-specificitet av modellen. Dock kan hjärnhärledda endotelceller från andra arter kan användas för att analysera transmigration i de respektive djuren 35. Dessutom retinsyra eller hydrocortisone har beskrivits för att öka barriärfunktioner och kan således användas 36, 37. I händelse av ett begränsat antal cell mängden celler som utsatts för analysen kan minskas, eftersom vår modell ger linjära återvinningsnivåer mellan 2 x 10 5 och ett x 10 6 PBMC (data ej visade). Att analysera sällsynta cellpopulationer följande transmigration kan det vara nödvändigt att en pool av celler från flera brunnar i syfte att erhålla tillräckliga celler som krävs för flödescytometri. Slutligen kan vår experimentuppställning också användas för att studera läkemedelstillförsel i CNS 38. En porstorlek av 3 pm används typiskt för att tillåta lymfocyt transmigration, medan en porstorlek av 0,4 | im förhindrar lymfocyt transmigration, men tillåter att studera läkemedelstillförsel 39, 40, 41, 42.

43. Centrifugering av HBMEC vid låga g-krafter och användning av tidiga passager (dvs.

Fastän vidhäftning till det protokoll som beskrivs här säkerställer meningsfulla och reproducerbara resultat, har denna teknik vissa begränsningar. Först av allt, in vivo blod-hjärnbarriären är bildad av ett antal celler, vilka interagerar på olika sätt och förstärka barriärfunktionen genom att påverka bildningen av täta förbindelser 1. Därför, även om detta blod-hjärnbarriären modellen är en god approximation av situationen in vivo, är viktiga aspekter saknas. Dessutom är lymfocyt extravasation in i CNS genom blod-hjärnbarriären en flerstegsprocess. Även om varje enskilt steg kan undersökas separat, inte tekniken presenteras här inte ge information om vemle processen för extravasation under inverkan av skjuvkrafter 2, 44, 45, 46. Slutligen kan analys av migrerade celler från PBMC vara utmanande beroende på frekvensen av cellerna av intresse, eftersom vanligtvis endast ensiffriga frekvenser av celler transmigrera. Därför kan separation av populationer av intresse före analysen eller sammanslagning av celler som migrerat över flera cellodlingsinsatser vara nödvändig. Andra modeller för analys av leukocytmigrering i CNS täcka en del av de aspekter som saknas i vår modell. Samodling med astrocyter pericyter, och / eller neuroner används för att efterlikna komplexiteten i blod-hjärnbarriären bättre 47. Modeller inklusive skjuvkrafter såsom DIV-BBB reflekterar mera de fysiologiska förhållanden, vilket således, vilket möjliggör en mer sofistikerad analys av lymfocyt diapedes 48. Sammanfattningsvis presenterar vi en lättillgänglig teknik som är lämplig för undersökning av kvalitativa och kvantitativa lymfocyt diapedes tvärs över blod-hjärnbarriären.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Immunologi lymfocyt extravasering lymfocyt migration CNS målsökande blod-hjärnbarriären HBMEC endotel
Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter