Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Lymfocytt uttredelse inn i sentralnervesystemet (CNS) er kritisk for immunovervåkning. Sykdomsrelaterte endringer av lymfocytt ekstravasasjon kan resultere i patofysiologiske forandringer i CNS. Således er undersøkelse av lymfocyttmigrering til CNS viktig å forstå inflammatoriske CNS-sykdommer og å utvikle nye tilnærmingsmåter terapi. Her presenterer vi en in vitro modell av det menneskelig blod-hjernebarrieren for å studere lymfocytt ekstravasasjon. Hjernen mikrovaskulære endotelceller (HBMEC) er confluently dyrket på en porøs polyetylentereftalat transwell sette inn for å etterligne endotelet i blod-hjerne-barrieren. Barrierefunksjonen blir bekreftet ved zonula okkludens immunhistokjemi, transendotelial elektrisk motstand (teer) målinger samt analyse av Evans Blue gjennomtrengning. Denne modellen tillater undersøkelse av diapedese av sjeldne lymfocyttundergrupper slik som CD56 CD16 lys dempe / - NK-celler. Furthermmalm, effekten av andre celler, cytokiner og kjemokiner, sykdomsrelaterte endringer og forskjellige behandlingsregimer på trekk kapasiteten av lymfocytter kan studeres. Til slutt, kan virkningen av inflammatoriske stimuli, så vel som forskjellige behandlingsregimer på den endoteliske barrieren skal analyseres.

Introduction

Lymfocyttmigrering fra blodet inn i vevet er avgjørende for immunologiske overvåkning. En sekvens av spesielle molekylære interaksjoner sørger for setespesifikk uttredelse inn i tynntarmen, hud, lymfeknuter, i sentralnervesystemet (CNS), og andre vev 1. Endringer i lymfocyttmigrering er involvert i patofysiologien av en rekke store spredningen sykdommer 2. Migrering inn i den immun-privilegerte CNS er strengt regulert og følgelig endringer av denne prosess er involvert i CNS-relaterte sykdommer som encefalomyelitt 3, neuromyelitis optica, slag, og multippel sklerose (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Derfor er det viktig å studere lymfocytt bloduttredelse å bedre forstå sykdom patofysiologi og å utvikle verktøy for en landgjenvinning av sykdomsbyrde 8, 9, 10, 11, 12.

Lymfocytter migrere inn i CNS via forskjellige ruter. Ekstravasering gjennom postkapillare venuler i det subarachnoide plass via blodet-cerebrospinalvæsken barrieren innenfor choroid plexus og over blod-hjernebarrieren er blitt beskrevet 1, 13, 14, 15. Migrasjon over blod-hjerne barrieren er utført av interaksjon av lymfocytter med endotelceller 14. I motsetning til endotelceller i periferien, endotelceller i CNS uttrykker store mengder av stramme koblingsmolekyler, for derved å strengt begrense mengden av celler og proteiner som er i stand til å krysse blod-hjerne-barrierenlass = "ekstern referanse"> 16. Inflammasjon resulterer i løsning av tette forbindelsene og induserer ekspresjon av adhesjonsmolekyler; således forsterke lymfocyttmigrering til CNS 1, 17, 18.

Ekstravasering gjennom blod-hjerne-barrieren er en flertrinnsprosess. Lymfocytter tjore til endotelcellene og deretter rulle langs den endotelet i en prosess som først og fremst formidlet av selektiner 1, 15. Deretter interaksjoner mellom chemokiner utskilt av endotelet og de respektive kjemokin reseptorer uttrykt på lymfocytter indusere konformasjonsendringer av integriner og dermed fremme fast adhesjon til endotelceller 1. Til slutt, lymfocytter enten gjennomsøking langs den endoteliske barrieren mot blodstrømmen før transmigrating inn i perivaskulære plass, eller stall umiddelbart og direkte Transmigrate på stedet av fast adhesjon 1, 19, 20. Alle disse trinnene å lymfocytt ekstravasasjon kan analyseres in vitro ved anvendelse av forskjellige teknikker 21. Time-lapse video mikroskopi brukes til å studere innledende tethering og rullende 15. Adhesjonsassayene gi detaljert informasjon om firmaet arrest til endotelbarrierer 22. Sjele assays som demonstrert her tillate analyse av immun-celle-transmigrasjon 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Ved å bruke den humane in vitro blod-hjerne barrieren modell, kunne vi nylig viser at en høyere MIGRAtory kapasitet av CD56 CD16 lys dempe / - NK-celler i forhold til deres CD56 dim CD16 + motstykker ble reflektert ved en overvekt av denne NK-celleundergruppen i det intratekale rommet 21. Dermed synes vår eksperimentelle oppsett for å være egnet til å etterligne in vivo situasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur av human hjerne mikrovaskulær endotelceller (HBMEC)

  1. Belegg av cellekulturflasker
    1. For å fremstille den fibronektin løsningen, tilsett 10 ml PBS til et 15 ml sentrifugerør. Tilsett 150 mL fibronektin og bland godt.
    2. For å dekke den nederste en T-25-cellekulturflaske tilsett 2 ml av den løsning fibronektin. Inkuber cellekulturflaske i minst 3 timer ved 37 ° C i inkubatoren. Fibronectinbelagt kolber kan lagres i 2 uker ved 37 ° C / 5% CO2.
  2. Seeding og cellekultur av HBMEC
    1. Aspirer fibronektin oppløsning fra bunnen av cellekulturflaske. Legg til en 7,2 x 10 4 HBMEC / cm suspendert i 6 ml ECM-b medium (= ECM-b supplert med 5% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin, og 1% endotelcellevekst supplement). Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2. Sjekk cellevekst daglig ved hjelp av et mikroskop.
    2. Endre medium hver 3. dag.Samle inn eller delt celler, når HBMEC nå ca 80% samløpet. HBMEC skal brukes mellom passasje 1 og 15 for å unngå tap av fysiologiske egenskaper.
  3. Innhøsting HBMEC.
    1. Fremstill accutase løsning ved å blande accutase (1x) med PBS i et forhold på 1: 1. Hold accutase oppløsning ved 37 ° C i et vannbad inntil videre anvendelse.
    2. Overfør ECM-b medium fra celledyrkningskolben til et 15 ml sentrifugerør. Vask HBMEC ved tilsetning av 5 ml PBS til bunnen av cellekulturflaske. Aspirer PBS og gjenta vasketrinnet to ganger til.
    3. Tilsett 2 ml forvarmes accutase løsning. Inkuber ved 37 ° C i 2 minutter. Etterpå HBMEC blir resuspendert ved godt å trykke på cellekulturflaske flere ganger. Celle løsgjøring styres ved hjelp av et mikroskop
    4. ECM-b-medium tidligere var lagret i et 15 ml rør ble tilsatt tilbake til den cellekulturflaske så snart HBMEC begynner å løsne. Skyll bunnen av kolben gjentatte ganger inntil det meste er HBMECsuspenderes på nytt.
    5. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved romtemperatur. Fjern supernatant og re-suspendere celler i 1 ml ECM-b medium. Cellene telles og fortynne cellesuspensjonen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 3 x 10 5 HBMEC per mL ECM-b medium.

2. Fremstilling av cellekulturen Innsett

  1. Belegging av cellekulturinnsatser
    Viktig: Unngå å berøre membran av cellekultur inserts.
    1. Tilsett 100 ul fibronektin-løsning (se 1.1.1) til hver cellekultur innsats (figur 1A) og en brønn av en 96-brønns flatbunnet plate (optisk kontroll brønn). Inkuber i minst 3 timer ved 37 ° C. Etter inkubasjon aspirat fibronektin løsning.
    2. Tilsett 100 ul HBMEC suspensjon til cellekultur innsatsene og de optiske kontrollbrønnen. Tilsetning av 600 ul ECM-b medium til det nedre rom i cellendyrkningsinnsatser. Inkuber i 3 - 4 dager ved 37 ° C / 5% CO2 inntil barriereintegritet (figur 1B) er nådd, kontrollerer cellevekst etter mikroskopisk evaluering av HBMEC i den optiske kontrollbrønnen. Merk: Cellevekst utover fire dager er ikke anbefalt.
    3. Valgfritt: For å etterligne inflammatoriske tilstander aspirere mediet fra det nedre rom, og erstatte den med ECM-b medium supplert med 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 timer før migreringen analysen.

3. Kvalitetskontroll med Evans Blue på Day of the Sjele analysen

  1. Fremstilling av Evans Blue løsning
    1. For å fremstille PBS / B27 løsning blanding 10 ml PBS med 200 ul B27 supplement ved anvendelse av et 15 ml sentrifugerør. Fortynn Evans Blue-stamoppløsning (20 mg / ml PBS) 1: 1000 med PBS / B27.
  2. Evans blue permeabilitet assay
    1. Aspirere mediet fra det nedre rom, etterfulgt av den øvre kammerav en cellekultur innskudd inneholdende et sammenflytende monolag HBMEC. Tilsett 100 ul av Evans Blue løsning til cellekulturen innsatsen.
    2. Tilsetning av 600 ul PBS / B27 til det nedre kammeret og inkuber i 60 minutter ved 37 ° C / 5% CO2. fjerne cellekulturinnsatsen forsiktig med tang.
  3. Evans blue måling
    1. Fjern PBS / B27 fra det nedre rom og overføre 100 ul av hver av to brønner av en svart polystyrol 96-brønns flatbunnet plate. Sett plate i en Tecan Infinite M200 Pro plateavleser og bestemme optimal z-posisjon.
    2. Mål eksitasjon av Evans-blått ved hjelp av respektive innstillinger (for eksempel: eksitasjon: 620 nm, emisjon: 680 nm, båndbredde eksitasjon: 9 nm, emisjon båndbredde: 20 nm, 175x forbedring, 25 blinker, tidspunkt for integrering: 20 mikrosekunder).
    3. For å bestemme HBMEC barrierefunksjoner sammenligne innsamlede data til en standardkurve som viser Evans Blue gjennomtrengningen gjennom HBMEC ved forskjellige tidspunkter etter frøkan celler (figur 1B, til høyre).

4. Migrasjon Assay

  1. Fremstilling av perifere mononukleære blodceller (PBMC).
    1. Tilsett 10 ml RPMI inn i et 15 ml sentrifugerør og tilsett 200 ul B27 supplement. Telle PBMC og sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter. * Resuspender PBMC til en endelig konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml RPMI / B27.
  2. Set-up av migreringen analysen
    1. Aspirer medium fra det nedre rom, etterfulgt av det øvre rom av celledyrkningsinnsatser inneholdende sammenflytende monolag HBMEC (figur 1A). Per donor tilsettes 100 mL PBMC-suspensjonen til hver cellekultur innsatsene og også til en brønn av en 24-brønners plate per (in vitro kontroll).
    2. Tilsetning av 600 ul RPMI / B27 til det nedre rom av cellekulturinnsatsene og 500 pl av PBMC av in vitro kontroll og inkuberes i 6 timer ved 37 ° C / 5% CO2.
    3. Høsting av overførte PBMC
      1. Ta ut cellekulturen innsatsen ved å anvende pinsett og omhyggelig skylling bunnen med 400 ul PBS uten å berøre membranen. Kast cellekulturen innsatsen.
      2. Tilsett 20 ul strømningstelle Fluorosfærer (ca. 1000 kuler / pl) til det nedre kammeret til cellekulturen sette inn så vel som til den in vitro kontroll og bland godt. Overføring 1 ml resulterende PBMC-suspensjonen for å flowcytometri rør.

    5. Flowcytometri

    1. prøveopparbeidelse
      1. Sentrifuger PBMC ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
      2. Fremstill antistoffoppløsning ved å tilsette fluorokromkonjugerte-konjugerte antistoffer til 100 pl flowcytometri buffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per prøve. For resultatene som er presentert nedenfor 1 pl CD4-FITC, ble en μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 pl CD8-A700, og 1 ul CD16-A750 anvendt pr prøve.
      3. Re-suspen PBMC i 100 pl av antistoffløsningen og inkuber i 30 minutter ved 4 ° C.
      4. Tilsett 250 ul flowcytometri buffer og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter.
    2. Prøve oppkjøp
      1. Re-suspen PBMC i den nødvendige mengde (varierer avhengig av flowcytometer anvendes) av flow-cytometri buffer.
      2. Erverve farget PBMC ved hjelp av et flow-cytometer med en aktiv detektor mellom 525 og 700 nm bølgelengde for å detektere strømningen telle Fluorosfærer (eksitasjon 488 nm, emisjon 525 til 700 nm).
        (De følgende trinnene er et eksempel hvis en Gallios flowcytometer drives med Kaluza G programvaren brukes:. (1) starter datamaskinen (2) Når operativsystemet er fullastet, starter strømningscytometer ved å trykke på "cytometer på" -knappen . (3) Legg den respektive oppkjøpet protokollen ved å trykke på "åpen protokoll" -knappen. (4) Velg ønsket protokoll og velg "åpne". (5) Duplikat protokollen for hver prøve ved å klikke med høyremuseknapp på protokollen synlig i den virtuelle karusellen og venstre klikk på feltet "duplikat". (6) Merk hver prøve i prøve listen. (7) Overfør prøvene til de angitte posisjonene av karusellen og starte kjøp).
    3. prøveanalyse
      1. Åpne resulterer flowcytometri data ved hjelp av den respektive programvare. Bestem antall subpopulasjoner av interesse for transmigrated PBMC samt celler fra in vitro kontrollbrønnene og flyttelle Fluorospheres ved hjelp av den respektive analyseprogramvare.
        (Et eksempel på portstyringsstrategien er gitt i resultatene delen (Figur 1 C: For å analysere den transmigrasjonen av NK-celle-undergrupper, første velger-lymfocytter i en sideveis spredningskanal (SSC) versus fremover spredningskanal (FSC) plottet Lymfocytter er. så fremvist i et CD3 versus CD56 tomt og CD56 + CD3 -. NK-celler er valgt for å skjelne mellom NK-celle-undergrupper, er NK-celler vises iet CD56 CD16 versus tomt og CD56 CD16 lys dim / - så vel som CD56 dim CD16 + NK-celler er valgt. I tillegg er strømningstelle Fluorosfærer valgt fra en FSC versus SSC tomt og etterfølgende fremvises på en plotting av en kanal med et emisjons mellom 525 og 700 nm i forhold til tiden for å bestemme deres antall.)
      2. For å beregne det totale celleantall for hver prøve, normalisere den detekterte antall celler ved hjelp av strømnings count Fluorospheres:
        ligningen
      3. Bestemme prosentandelen av migrerte celler som forholdet mellom totalt antall migrerte celler og totalt antall celler i in vitro kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative resultater som viser transmigrasjon av NK-celler og T-celleundergrupper ved hjelp av menneskelig blod-hjerne-barrieren modellen (figur 1A) er vist. Integriteten til HBMEC monolaget ble bekreftet ved farging av den stramme koblingsmolekylet ZO-1, transendotelial elektrisk motstand (teer) målinger, og Evans Blue permeasjon (figur 1B). Etter 3 - 4 dagers dyrking HBMEC uttrykt det stramme koblingsmolekylet ZO-1 (figur 1 B, venstre). Videre HBMEC vokste i monolag som utviser transendotelial elektrisk motstand (figur 1B i midten), så vel som redusert gjennomtrengning for Evans Blue (figur 1 B, høyre). HBMEC monolag ble anvendt for å studere transmigrasjon av NK-celler, inkludert CD56 CD16 lys dim / - og CD56 svakt CD16 + NK-celleundergrupper og T-celler blant CD4 + og CD8 + T-celler som to examples (figur 1D + E, henholdsvis). Prosentandelen av migrerte celler ble beregnet på grunnlag av celletellinger som oppnås ved strømningscytometri og ved hjelp av normaliserte strømningstelle Fluorosfærer som en intern kontroll (figur 1C). Den HBMEC monolaget ble stimulert med IFN-γ og TNF-α 24 timer før bestemmelsen til å etterligne inflammatoriske tilstander. Cytokin stimulering resulterte i økt migrering av alle analyserte lymfocyttpopulasjoner. Dette kan være på grunn av en økt ekspresjon av adhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1 (data ikke vist). CD56 CD16 lys dempe / - NK-celler utviste en høyere vandrende kapasitet i forhold til deres CD56 dempe CD16 + NK tvers av både ikke-stimulerte (10,88% vs. 0,86%) og IFN-γγ / TNF-α stimulert (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (figur 1D). Imidlertid er den relative økning i transmigrasjon som et resultat av betennelse var høyere for den CD56 CD16 + dim vs. + 167% for CD56 CD16 lys dim / -). Disse resultater etterligner in vivo-observasjoner som CD56 CD16 lys dim / - NK-celler er anriket i den intratekal rommet. Dermed virker den blod-hjernebarrieren modell for å være egnet for å analysere grunnleggende prinsipper for immun-celle-diapedese av sjeldne lymfocyttpopulasjoner til CNS 21.. Til slutt blir den transmigratory kapasitet av CD4 og CD8 T-celleundergrupper vist (figur 1E).

Figur 1
Figur 1: Differensial Migrering av NK-celleundergrupper på tvers Uninflamed og betent HBMEC Monolag. A. Et bilde av transwell innsatser (venstre) og illustrasjon av det eksperimentelle oppsettet (til høyre). B. Validering av HBMEC barrierefunksjoner. Venstre: immunhistokjemisk farging av den stramme krysset molecule ZO-1 ved anvendelse av kanin anti-humant ZO-1 (Abcam, 1: 200) og geite-anti-kanin-IgG-Cy3 (1: 300) på HBMEC dyrket i 3 dager. Center: transendotelial elektrisk motstand (teer) av HBMEC mellom dag 2 og dag 4 av dyrkingen. Høyre: Standardkurven for Evans Blue-gjennomtrengning for HBMEC med ( "betent", red) eller uten ( "uninflamed", black) stimulering med 500 U / ml IFN-γ og TNF-α i 24 timer. Sjele forsøk ble utført under 72 - 96 timer etter utsåing av HBMEC (sort pil). CE. PBMC avledet fra 16 friske individer ble utsatt for migrering assays som beskrevet i fremgangsmåten delen. 24 timer før bestemmelsen, ble halvparten av cellekultur innsatsene stimulert med 500 IU / ml IFN-γ og TNF-α. Transmigrated cellene ble høstet og analysert ved flow-cytometri. C. Representative resultater for PBMC avledet fra in vitro kontroll i tillegg (øverst) og etter migrasjon over uninflamed HBMEC (nederst). NK cel ls ble gated fra samlede lymfocytter som CD3 - CD56 + celler og utmerker seg videre inn i CD56 CD16 lys dim / - ( "CD56 lys ") og CD56 dim CD16 + (" CD56-dim") NK-celleundergrupper. Flow count Fluorosfærer ( "perler") ble gated basert på FSC / SSC egenskaper og deres antall ble bestemt i en FL3 som funksjon av tid plottet. Eksempler på beregninger for å bestemme prosentandelen av migrerte CD56 lys og CD56 dim NK-celler, er vist til høyre. D. Prosent av migrerte NK-celler, så vel som CD56 og CD56 lys dim NK-celle-undergrupper, og E. prosentandel av migrerte T-celler blant CD4 + og CD8 + T-celleundergrupper følgende transmigrasjon på tvers uninflamed (sort) eller betent (rød) HBMEC angitt som middelverdi ± SEM. P-verdier ble beregnet ved paret student-t-test; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en teknikk for å undersøke sjele av lymfocytter over menneskelig blod-hjerne barrieren. In vitro-analyse av lymfocyttmigrering til CNS er viktig å undersøke grunnleggende prosesser for lymfocytt ekstravasasjon, potensielle sykdomsrelaterte endringer, og nye terapeutiske tilnærminger.

Flere modifikasjoner av blod-hjerne-barrieren modell er mulig. For eksempel kan celler fra det øvre kammeret bli analysert for å undersøke sammensetningen av den ikke-overførte cellepopulasjon. Videre kan behandlingen av den HBMEC monolag med IFN-γ og TNF-α 24 timer før analysen bli anvendt for å etterligne et betent blod-hjernebarrieren for å studere effekten av inflammatoriske forstyrrelser i sentralnervesystemet 21, 25. Tilsvarende behandling av HBMEC eller lymfocytter med andre stoffer gjør det mulig å undersøke deres effekter på lymfocytt- ekstravasasjon (f.eks sinvirkning på adhesjonsmolekyler) 30, 31. Involvering av visse adhesjonsmolekyler kan studeres ved hjelp av blokkerende antistoffer for integriner og deres ligander 32. Videre er det eksperimentelle oppsettet som presenteres her muliggjør analyse av kjemotaktiske effekter av kjemokiner eller supernatanter som stammer fra astrocytter eller andre celler 33, 34. Erstatning av HBMEC med primære human hjerne avledet epitelceller utvider spekteret av denne eksperimentelle oppsettet for undersøkelse av blod-spinalvæske barriere 15. HBMEC skal ikke erstattes med udødeliggjorte endoteliale celler eller celler avledet fra andre organer for å opprettholde CNS-spesifisiteten av modellen. Imidlertid kan hjerneavledet endotelceller fra andre arter benyttes for å analysere transmigrasjon i de respektive dyrene 35. I tillegg, retinoisk syre eller hydrocortisone har blitt beskrevet for å øke barrierefunksjoner og kan således bli anvendt 36, 37. I tilfelle av begrenset celleantall mengden av celler som utsettes for målingen kan bli redusert, fordi vår modell gir lineære utvinningsgraden mellom 2 x 10 og 5 x 10 1 6 PBMC (data ikke vist). For å analysere sjeldne cellepopulasjoner følgende transmigrasjon kan det være nødvendig å bassenget celler fra flere brønner for å oppnå tilstrekkelig antall celler som kreves for strømningscytometri. Endelig vår eksperimentelle oppsettet kan også brukes til å studere stoffet levering i CNS 38. En porestørrelse på 3 um er typisk brukt for å tillate lymfocytt transmigrasjon, mens en porestørrelse på 0,4 pm hindrer lymfocytt transmigrasjon, men gjør det mulig å studere medikamentavgivelse 39, 40, 41, 42.

43. Sentrifugering av HBMEC ved lave g-krefter og bruk av tidlige passasjer (dvs.

Selv om tilslutning til protokollen som er beskrevet her sikrer at meningsfulle og reproduserbare resultater, har denne teknikken noen begrensninger. Først av alt, in vivo blod-hjernebarrieren er dannet av et antall celler, som reagerer på forskjellige måter og styrke barrierefunksjonen ved å påvirke dannelsen av tette forbindelsene 1. Derfor, selv om dette blod-hjerne-barrieren modellen er en god tilnærming til in vivo situasjonen, er viktige aspekter mangler. I tillegg lymfocytt uttredelse inn i CNS over blod-hjerne barrieren er en flertrinnsprosess. Mens hver enkelt trinn kan undersøkes hver for seg, ikke teknikken som presenteres her ikke gi informasjon om hvemle prosess av ekstravasasjon under påvirkning av skjærkrefter 2, 44, 45, 46. Til slutt, kan analyse av migrerte celler fra PBMC være utfordrende avhengig av hyppigheten av cellene av interesse, fordi som regel bare ett siffer frekvenser av celler transmigrere. Derfor kan separasjon av populasjoner av interesse før bestemmelsen eller gruppering av cellene som migrerte på tvers av flere celledyrkningsinnsatser være nødvendig. Andre modeller for analyse av leukocytter i CNS dekke noen av de aspektene som mangler i vår modell. Ko-kultur med astrocytter, pericytter, og / eller nerveceller brukes for å etterligne kompleksiteten av blod-hjerne-barrieren bedre 47. Modeller inkludert skjærkrefter som for eksempel DIV-BBB viser flere fysiologiske betingelser, og dermed muliggjøre en mer sofistikert analyse av lymfocytt-diapedese 48. Som en oppsummering presenterer vi en lett tilgjengelig teknikk som er egnet for undersøkelse av kvalitativ og kvantitativ lymfocytt diapedese tvers av humant blod-hjerne-barrieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Immunology utgave 122 lymfocytt ekstravasasjon lymfocyttmigrering CNS homing blod-hjerne-barrieren HBMEC endotel
Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter