Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) is essentieel voor immuun surveillance. Ziekte-gerelateerde veranderingen van lymfocyten extravasatie kan resulteren in pathofysiologische veranderingen in het centrale zenuwstelsel. Aldus onderzoek lymfocytenmigratie in het CZS is belangrijk inflammatoire CNS-ziekten te begrijpen en nieuwe therapie benaderingen te ontwikkelen. Hier presenteren we een in vitro model van het menselijk bloed-hersenbarrière lymfocyten extravasatie bestuderen. Menselijk brein microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) worden confluent gekweekt op een poreuze polyethyleentereftalaat Transwell voegen aan het endotheel van de bloed-hersenbarrière nabootsen. Barrièrefunctie wordt gevalideerd door zonula occludens immunohistochemie transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en analyse van Evans blauw permeatie. Dit model maakt het mogelijk onderzoek naar de diapedesis van zeldzame lymfocyten zoals CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen. Furthermerts, de werking van andere cellen, cytokines en chemokines, ziektegerelateerde veranderingen en verschillende behandelingsregimes op het trekkende capaciteit van lymfocyten kunnen worden bestudeerd. Tenslotte kan het effect van inflammatoire stimuli evenals verschillende behandelingsregimes op de endotheliale barrière te analyseren.

Introduction

Lymfocytenmigratie uit het bloed naar de weefsels is cruciaal voor immuun surveillance. Een reeks van specifieke moleculaire interacties zorgt plaatsspecifieke extravasatie in kleine darm, huid, lymfeknopen, het centrale zenuwstelsel (CZS) en andere weefsels 1. Veranderingen in lymfocytenmigratie betrokken zijn bij de pathofysiologie van een aantal wijdverbreide ziekten 2. Migratie in de immuun-geprivilegieerde CNS wordt strak gereguleerd en dus veranderingen van deze werkwijze zijn betrokken bij CZS-gerelateerde ziekten zoals encefalomyelitis 3, neuromyelitis optica, beroerte en multiple sclerosis (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Daarom is het belangrijk om lymfocyten extravasatie bestuderen om beter te begrijpen ziekte pathofysiologie en hulpmiddelen voor een te ontwikkelen melioration ziektelast 8, 9, 10, 11, 12.

Lymfocyten migreren in het CNS via verschillende routes. Extravasatie tot postcapillaire venules in de subarachnoïdale ruimte via de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière in de choroid plexus en over de bloed-hersenbarrière zijn beschreven 1, 13, 14, 15. Migratie over de bloed-hersenbarrière wordt uitgevoerd door de interactie van lymfocyten aan endotheelcellen 14. In tegenstelling tot endotheliale cellen in de periferie, endotheliale cellen van het CNS tot expressie grote hoeveelheden tight junction moleculen, waardoor strikte beperking van het aantal cellen en eiwitten die in staat de bloed-hersenbarrièrelass = "xref"> 16. Ontsteking leidt tot loskomen van nauwe overgangen en induceert de expressie van adhesiemoleculen; dus verbeteren lymfocytenmigratie in het CZS 1, 17, 18.

Extravasatie via de bloed-hersenbarrière is een meerstaps werkwijze. Lymfocyten tether de endotheelcellen en rol langs het endotheel in een proces in hoofdzaak gemedieerd door selectinen 1, 15. Vervolgens interacties tussen chemokinen uitgescheiden door het endothelium en de respectieve chemokinereceptoren tot expressie gebracht op lymfocyten conformatieveranderingen van integrinen, waardoor stevige adhesie aan endotheelcellen bevorderen 1. Tenslotte lymfocyten ofwel kruipen langs de endotheliale barrière tegen de bloedstroom voordat transmigrerende in de perivasculaire ruimte of onmiddellijk en rechtstreeks verzendende kraamigrate op de plaats van stevige adhesie 1, 19, 20. Al deze stappen lymfocyt extravasatie kan worden geanalyseerd in vitro gebruik van verschillende technieken 21. Time-lapse video microscopie wordt gebruikt om de initiële tethering en rollen 15 te bestuderen. Hechting testen leveren gedetailleerde informatie over firma arrestatie belemmeringen 22 endotheel. Transmigratie assays zoals hier getoond laten analyse van immuuncel transmigratie 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Met het menselijke in vitro bloed-hersenbarrière model konden we onlangs laten zien dat een hogere migrAtory aantal CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen in vergelijking met hun CD56 dim CD16 + tegenhangers werd gereflecteerd door een overwicht van deze NK-cel subsets in de intrathecale ruimte 21. Zo, onze experimentele opstelling lijkt geschikt zijn om de in vivo situatie na te bootsen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture of Human Brain microvasculaire endotheelcellen (HBMEC)

  1. Coating van celkweek kolven
    1. De fibronectine te bereiden, voeg 10 ml PBS om een ​​15 ml centrifugebuis. Voeg 150 ul fibronectine en meng goed.
    2. Met het onderdeksel een celkweekkolf T-25 2 ml van de fibronectine-oplossing. Incubeer de celkweek kolf gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C in de incubator. Fibronectine gecoate kolven worden opgeslagen gedurende 2 weken bij 37 ° C / 5% CO2.
  2. Zaaien en celcultuur van HBMEC
    1. Aspireren fibronectine oplossing uit de bodem van de celkweek kolf. Voeg 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² gesuspendeerd in 6 ml ECM-b medium (= ECM-b aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine en 1% endothele celgroei supplement). Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2. Controleer celgroei dagelijks met behulp van een microscoop.
    2. Verander het medium om de 3 dagen.Oogst cellen of splitsen wanneer HBMEC verwachting ongeveer 80% confluentie. HBMEC worden gebruikt tussen passage 1 en 15 tot verlies van fysiologische eigenschap belet.
  3. Harvest HBMEC.
    1. Bereid Accutase oplossing door mengen Accutase (1x) met PBS in een verhouding van 1: 1. Houd Accutase oplossing bij 37 ° C in een waterbad tot verder gebruik.
    2. Transfer ECM-b medium van de celkweek kolf met 15 ml centrifugebuis. HBMEC wassen door toevoeging van 5 ml PBS aan de bodem van de celkweek kolf. Zuig PBS en herhaal de wasstap nog twee keer.
    3. Voeg 2 ml voorverwarmde oplossing Accutase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min. Daarna HBMEC worden opnieuw geschorst door stevig de celkweek kolf meerdere malen te tikken. Cell detachement wordt bestuurd met behulp van een microscoop
    4. De ECM-b-medium eerder opgeslagen in een 15 ml buis naar het celkweekkolf zodra HBMEC beginnen los toegevoegd. Spoel de bodem van de kolf totdat de meeste HBMEC zijngeresuspendeerd.
    5. Breng de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeren bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml ECM-b medium. Aantal cellen en verdun de celsuspensie tot een eindconcentratie van 3 x 10 ml per 5 HBMEC ECM-b medium bereiken.

2. Bereiding van de Cell Culture Inserts

  1. Coating van celkweek inserts
    Belangrijke opmerking: Raak de membraan van de celkweek inserts.
    1. Voeg 100 ul fibronectine-oplossing (zie 1.1.1) aan elke celkweek insert (Figuur 1A) en één putje van een 96 putjes vlakke bodemplaat (optische controle putje). Incubeer gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C. Na incubatie aspiraat fibronectine oplossing.
    2. Voeg 100 ul HBMEC suspensie aan de celkweek inserts en de optische controleputje. Voeg 600 ul ECM-b medium naar het onderste compartiment van de celcultuur inserts. Incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C / 5% CO2 totdat integriteit van de barrière (figuur 1B) wordt bereikt, controleer celgroei door microscopische evaluatie van de HBMEC in de optische controlewell. Let op: de groei van de cel langer dan vier dagen wordt niet aanbevolen.
    3. Optioneel: bootsen ontstekingen Zuig het medium van het onderste compartiment en vervang deze ECM-b medium aangevuld met 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 uur voor de migratieassay.

3. Quality Control met Evans Blue op de Dag van de transmigratie Assay

  1. Bereiding van Evans Blue oplossing
    1. PBS / B27-oplossing mengsel 10 mL PBS bereid met 200 ul B27 supplement met een 15 ml centrifugebuis. Evans Blue verdunde voorraadoplossing (20 mg / ml PBS) 1: 1000 met PBS / B27.
  2. Evans blue permeabiliteitstest
    1. Zuig het medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartimentéén celkweek insert met een confluente monolaag HBMEC. Voeg 100 ul Evans Blue oplossing voor de celkweek insert.
    2. Voeg 600 ul PBS / B27 naar het onderste compartiment en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C / 5% CO2. Verwijder voorzichtig de celkweek insert behulp van een tang.
  3. Evans blauw meting
    1. Verwijder PBS / B27 uit het onderste compartiment en breng 100 ui elk van twee putjes van een zwarte polystyreen met 96 putjes met vlakke bodemplaat. Inzetplaat in een Tecan Infinite M200 Pro plaatlezer en bepaalt een optimale Z-positie.
    2. Maat excitatie Evans Blue gebruik respectieve instellingen (bijvoorbeeld: excitatie: 620 nm, emissie: 680 nm, excitatiebandbreedte: 9 nm, emissie bandbreedte van 20 nm, 175x vergroting, 25 flitsen, integratietijd: 20 ps).
    3. Bepalen HBMEC barrièrefunctie vergelijk verzamelde gegevens met een standaardcurve afbeelding van Evans Blue permeatie door HBMEC op verschillende tijdstippen na zaading cellen (Figuur 1B, rechts).

4. Migratie Assay

  1. Bereiding van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC).
    1. Voeg 10 ml RPMI in een 15 ml centrifugebuis en voeg 200 ul B27 supplement. PBMC tellen en centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer PBMC tot een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen / ml RPMI / B27.
  2. Set-up van de migratieassay
    1. Aspireren medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartiment van celkweek inserts samenvloeiende monolagen HBMEC (Figuur 1A). Per donor voeg 100 ul PBMC suspensie elk voor celkweek inserts alsook op één putje van een plaat met 24 putjes per (in vitro controle).
    2. Voeg 600 pl RPMI / B27 naar het onderste compartiment van de celkweek inserts en 500 pi aan de PBMC van de in vitro controle en incubeer 6 uur bij 37 ° C / 5% CO2.
    3. Oogsten van gemigreerde PBMC
      1. Haal de celkweek insert met behulp van een tang en voorzichtig de bodem met 400 pi PBS te spoelen zonder het aanraken van het membraan. Gooi de celkweek insert.
      2. Voeg 20 ul stroom count FluoroSpheres (ongeveer 1000 kralen / ul) aan het onderste compartiment van de celkweek te voegen en om de in vitro controle en meng goed. Breng 1 ml PBMC verkregen suspensie stroomcytometrie buizen.

    5. Flowcytometrie

    1. monstervoorbereiding
      1. Centrifugeer PBMC bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Bereid antilichaamoplossing door toevoeging fluorochroom geconjugeerde antilichamen aan 100 pl flowcytometrie buffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per monster. Voor de onder 1 pi CD4-FITC gepresenteerde resultaten, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ul CD56-PC7, 1 pl CD8-A700 en 1 ul CD16-A750 werden gebruikt per monster.
      3. Re-schorten PBMC in 100 pi van de antilichaamoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
      4. Voeg 250 ul flowcytometrie buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
    2. sample overname
      1. Resuspendeer PBMC in de vereiste hoeveelheid (afhankelijk van de gebruikte flowcytometer) van flowcytometrie buffer.
      2. Verwerven gekleurd PBMC met een flow cytometer met een actieve detector van 525 tot 700 nm golflengte stroming count FluoroSpheres detecteren (excitatie 488 nm, emissie 525-700 nm).
        (De volgende stappen zijn een voorbeeld wanneer een Gallios flowcytometer bediend Kaluza G software wordt gebruikt. (1) Start de computer (2) Wanneer het besturingssysteem volledig is geladen, start de flowcytometer door op de "cytometer op" knop . (3) Laad de respectievelijke overname protocol door op "open protocol" te drukken. (4) Kies de gewenste protocol en selecteer "open". (5) Dubbele het protocol voor elk monster door het klikken met de rechtermuisknop op de protocol zichtbaar in de virtuele carrousel en een links-klik op het veld "duplicate". (6) Label elke monster in het monster lijst. (7) Breng de monsters op de aangegeven plaatsen van de carrousel en start de acquisitie.)
    3. monsteranalyse
      1. Open resulterende flowcytometrie gegevens met behulp van de betreffende software. Bepaal aantal subpopulaties van belang voor transmigrated PBMC en cellen uit in vitro controleputjes en stromen telling FluoroSpheres met de respectievelijke analysesoftware.
        (Een voorbeeld van de gating strategie wordt gegeven in de resultaten gedeelte (Figuur 1 C: Aan de transmigratie van NK-cel subsets analyseren eerst selecteren lymfocyten in een zijwaartse verstrooiing kanaal (SSC) versus voorwaartse verstrooiing kanaal (FSC) diagram Lymfocyten zijn. vervolgens verschijnt een CD3 versus CD56 plot en CD56 + CD3 -. NK cellen gekozen Ter onderscheiding van NK-cel subsets worden NK cellen weergegeveneen CD56 versus CD16 plot en CD56 heldere CD16 dim / - evenals CD56 dim CD16 + NK-cellen zijn geselecteerd. Daarnaast zijn stroom telling FluoroSpheres gekozen uit een FSC-SSC versus grafiek en vervolgens weergegeven in een grafiek van een kanaal met een emissie van 525 tot 700 nm versus tijd hun aantal te bepalen.)
      2. Het totale aantal cellen van elk monster te berekenen, normaliseren het gedetecteerde aantal cellen met behulp stroming count FluoroSpheres:
        Vergelijking
      3. Bepalen percentage gemigreerde cellen als verhouding tussen het totale gemigreerde cellen en totale cellen in het in vitro controle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve resultaten tonen transmigratie van NK-cellen en T-cel subsets met het menselijk bloed-hersenbarrière model (Figuur 1A) getoond. De integriteit van de monolaag HBMEC werd bevestigd door kleuring van de nauwe overgang molecuul ZO-1, transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en Evans Blue permeatie (Figuur 1B). Na 3-4 dagen kweek HBMEC sprak de nauwe overgang molecuul ZO-1 (Figuur 1B, links). Bovendien HBMEC gegroeid in monolagen vertoont transendotheliaal elektrische weerstand (figuur 1B midden) en verminderde permeatie voor Evans blauw (Figuur 1B, rechts). HBMEC monolagen werden gebruikt om de transmigratie van NK-cellen te bestuderen, waaronder CD56 heldere CD16 dim / - en CD56 dim CD16 + NK-cel subsets en T-cellen, waaronder CD4 + en CD8 + T-cellen als twee examples (Figuur 1 D + E, respectievelijk). Het percentage gemigreerde cellen werd berekend op basis celtellingen verkregen door flowcytometrie en genormaliseerd met behulp stroom tellen FluoroSpheres als een interne controle (Figuur 1C). De HBMEC monolaag werd gestimuleerd met IFN-γ en TNF-α 24 vóór de test om ontstekingen na te bootsen. Cytokinestimulatie resulteerde in verhoogde migratie van alle geanalyseerde lymfocyt populaties. Dit kan worden veroorzaakt door een verhoogde expressie van adhesiemoleculen zoals ICAM-1 (gegevens niet getoond). CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen vertoonden een hogere trekkende capaciteit in vergelijking met hun CD56 dim CD16 + NK in zowel ongestimuleerde (10,88% vs. 0,86%) en IFN-γγ / TNF-α gestimuleerde (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (figuur 1D). De relatieve toename van transmigratie als gevolg van ontsteking was hoger voor de CD56 dim CD16 + tegenover + 167% voor CD56 heldere CD16 dim / -). Deze resultaten bootsen de in vivo waarnemingen dat CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen worden verrijkt in de intrathecale ruimte. Dus de bloed-hersenbarrière model lijkt geschikt basisprincipes van immuuncel diapedesis zeldzame lymfocyt populaties te analyseren in het CZS 21 zijn. Tenslotte wordt de transmigratory capaciteit van CD4 en CD8 T-cel subsets aangetoond (figuur 1E).

Figuur 1
Figuur 1: Differentiële migratie van NK-cel subsets in niet-ontstoken en ontstoken HBMEC monolagen. A. Een beeld van Transwell-inserts (links) en weergave van de experimentele opstelling (rechts). B. Validatie van HBMEC barrièrefunctie. Links: immunohistochemische kleuring van de tight junction molecule ZO-1 onder toepassing van konijnen tegen humaan ZO-1 (Abcam, 1: 200) en geiten anti-konijn IgG Cy3 (1: 300) op HBMEC gekweekt gedurende 3 dagen. Center: transendothele elektrische weerstand (TEER) van HBMEC tussen dag 2 en dag 4 van de kweek. Rechts: standaardcurve voor Evans blauw permeatie voor HBMEC met ( "ontstoken", red) of zonder ( "niet-ontstoken", zwart) stimulatie met 500 U / ml IFN-γ en TNF-α gedurende 24 uur. Transmigratie assays worden uitgevoerd 72-96 uur na het uitzaaien van de HBMEC (zwarte pijl). CE. PBMC verkregen van 16 gezonde individuen werden onderworpen aan migratie assays zoals beschreven in het hoofdstuk protocol. 24 uur voor de test helft van de celkweek inserts werden gestimuleerd met 500 IU / ml IFN-γ en TNF-α. Transmigrated cellen werden geoogst en geanalyseerd door flow cytometrie. C. Representatieve resultaten van PBMC afgeleid van de in vitro controle bron (boven) en na migratie over niet-ontstoken HBMEC (onder). NK cel ls werden afgesloten van totale lymfocyten CD3 - CD56 + cellen en verder onderscheiden in CD56 heldere CD16 dim / - ( "CD56 bright ") en CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") NK-cel subsets. Flow count FluoroSpheres ( "beads") werden gated op basis van FSC / SSC karakteristieken en hun aantal werd bepaald in een FL3 versus tijd plot. Illustratieve berekening van het percentage CD56 gemigreerde lichte en CD56 dim NK-cellen rechts weergegeven bepalen. D. Percentage gemigreerde NK-cellen en CD56 en CD56 dim heldere NK-cel-subsets en E. percentage gemigreerde T cellen, waaronder CD4 + en CD8 + T-cel subsets volgende transmigratie over niet-ontstoken (zwart) of ontstoken (rood) HBMEC weergegeven als gemiddelde ± SEM. P-waarden werden berekend met gepaarde student t-test; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een techniek om de transmigratie van lymfocyten over het menselijk bloed-hersenbarrière te onderzoeken. In vitro analyse van lymfocyt migratie naar het CZS is belangrijk basisprocessen van lymfocyten extravasatie mogelijke ziektegerelateerde veranderingen en nieuwe therapeutische benaderingen bestuderen.

Verschillende modificaties van de bloed-hersenbarrière model mogelijk. Bijvoorbeeld kunnen cellen van het bovenste compartiment worden geanalyseerd om de samenstelling van de niet-gemigreerde cellen populatie te onderzoeken. Bovendien kan de behandeling van de monolaag met HBMEC IFN-γ en TNF-α 24 uur voor de assay worden gebruikt om een ontstoken bloed-hersenbarrière nabootsen om het effect van inflammatoire aandoeningen van het CZS 21, 25 bestuderen. Ook de behandeling van HBMEC of lymfocyten met andere stoffen maakt het onderzoeken van hun effecten op lymfocyten extravasatie (bijvoorbeeld hungevolgen adhesiemoleculen) 30, 31. De betrokkenheid van bepaalde adhesiemoleculen kan worden bestudeerd met behulp van blokkerende antilichamen tegen integrines en hun liganden 32. Bovendien is de experimentele opstelling maakt hier gepresenteerde analyse van chemotactische effecten van chemokinen of supernatanten afgeleid van astrocyten of andere cellen 33, 34. Vervanging van HBMEC met primaire menselijke hersenen afgeleide epitheelcellen verbreedt het spectrum van deze experimentele opstelling voor onderzoek naar de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière 15. HBMEC mag niet worden vervangen door geïmmortaliseerde endotheelcellen of cellen afkomstig van andere organen CZS-specificiteit van het model te handhaven. Echter, kan de hersenen afgeleide endotheelcellen van andere soorten worden gebruikt transmigratie analyseren de desbetreffende dieren 35. Bovendien, retinoïnezuur of hydrocortisone zijn beschreven barrièrefunctie verhogen en kan dus worden toegepast 36, 37. Bij beperkte aantal cellen de hoeveelheid cellen onderworpen aan de assay kan worden beperkt, omdat ons model verschaft lineaire opbrengst tussen 2 x 10 5 tot 1 x 10 6 PBMC (gegevens niet getoond). Zeldzame celpopulaties na transmigratie analyseren kan noodzakelijk pool cellen uit verschillende bronnen om voldoende cellen vereist voor flowcytometrie verkrijgen. Tot slot konden onze experimentele opstelling ook worden gebruikt voor de afgifte van geneesmiddelen te bestuderen in het CNS 38. Een poriegrootte van 3 urn wordt gewoonlijk gebruikt om lymfocyten transmigratie mogelijk, dat een poriëngrootte van 0,4 urn voorkomt lymfocyt transmigratie, maar maakt het mogelijk om geneesmiddelafgifte 39, 40, 41, 42 bestuderen.

43. Centrifugering van HBMEC bij lage g krachten en gebruik van vroege passages (dwz

Hoewel hechting aan de hier beschreven protocol zorgt betekenisvolle en reproduceerbare resultaten Deze techniek heeft een aantal beperkingen. Allereerst in vivo de bloed-hersenbarrière wordt gevormd door een aantal cellen, die reageren op verschillende manieren en de barrièrefunctie te versterken door wijziging vorming van tight junctions 1. Daarom, hoewel dit bloed-hersen barrière model is een goede benadering van de in vivo situatie, belangrijke aspecten ontbreken. Bovendien, extravasatie van lymfocyten in het CZS door de bloed-hersenbarrière is een meerstaps werkwijze. Terwijl elke enkele stap afzonderlijk kan worden onderzocht, is de techniek die hier geen informatie over het wiele werkwijze extravasatie onder invloed van afschuifkrachten 2, 44, 45, 46. Ten slotte zou de analyse van gemigreerde cellen uit PBMC uitdagend zijn, afhankelijk van de frequentie van de cellen van belang, omdat meestal alleen frequenties single-digit van de cellen transmigreren. Daarom kan scheiding van de bevolking van belang voorafgaand aan de test of pooling gemigreerde cellen op meerdere celkweek inserts nodig. Andere modellen voor de analyse van migratie van leukocyten in het CZS betrekking op een aantal van de aspecten ontbreken in ons model. Co-kweek met astrocyten, pericyten, en / of neuronen worden gebruikt om de complexiteit van de bloed-hersenbarrière beter 47 nabootsen. Modellen waaronder afschuifkrachten zoals DIV-BBB geven eerder de fysiologische omstandigheden aldus mogelijk maken van een meer verfijnde analyse van lymfocyt diapedesis 48. Kortom, presenteren we een gemakkelijk toegankelijke techniek die geschikt zijn voor het onderzoek van de kwalitatieve en kwantitatieve lymfocyt diapedesis over het menselijk bloed-hersenbarrière.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Immunologie lymfocyt extravasatie lymfocytenmigratie CNS homing bloedhersenbarrière HBMEC endotheel
Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter