Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS'de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini - Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.

Introduction

dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS'ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah.

Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = "xref"> 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar.

Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering'i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar.

In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim - NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücreleri Kültürü (HBMEC)

  1. hücre kültürü şişelerinde kaplanması
    1. Fibronektin, bir çözelti hazırlamak bir 15 mL santrifüj tüpüne 10 ml PBS ekleyin. 150 ul fibronektin ekleyin ve iyice karıştırın.
    2. alt kapak için bir T-25 hücre kültür şişesi fibronektin çözeltisi 2 ml. kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de en az 3 saat boyunca hücre kültür şişesi inkübe edin. Fibronektin kaplanmış şişeler 37 ° C /% 5 CO2 ile 2 hafta boyunca depolanabilir.
  2. Tohumlama ve HBMEC hücre kültürü
    1. Hücre kültür şişesi altından aspire fibronektin çözeltisi. 6 ml ECM-b ortamda süspansiyon haline getirilmiş 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² ekle (= ECM-b,% 5 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiştir). 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak günlük hücre büyümesini kontrol edin.
    2. 3 günde ortamı değiştirin.Hasat veya HBMEC yaklaşık% 80 konfluansa ulaşmalarına bölünmüş hücreleri. HBMEC fizyolojik özellikleri kaybını önlemek için geçit 1 ile 15 arasında kullanılmalıdır.
  3. Hasat HBMEC.
    1. 1 oranında PBS ile Accutase (1x) ile muamele Accutase çözelti hazırlayın: 1 arasındadır. sonraki kullanıma kadar bir su banyosu içinde 37 ° C 'de Accutase çözüm tutun.
    2. 15 ml santrifüj tüpüne hücre kültür şişesi ECM-b ortamı aktarın. Hücre kültür şişesinin dibinde 5 ml PBS ilave edilerek HBMEC yıkayın. PBS aspire ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın.
    3. 2 mL Accutase önceden ısıtılmış solüsyonu ekleyin. 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Sonrasında HBMEC sıkıca hücre kültürü şişesi birkaç kez dokunarak yeniden askıya alınır. Hücre kopması, bir mikroskop kullanılarak kontrol edilir
    4. Daha önce, bir 15 ml tüp içinde saklanan ECM-b-orta kısa HBMEC ayırmak için başlangıç ​​olarak geri hücre kültür şişesi içine ilave edilir. En HBMEC kadar tekrar tekrar şişenin alt durulayınyeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
    5. 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 mL ECM-b ortamda hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayımı ve ml ECM-b ortamı başına 3 x 10 5 HBMEC bir son konsantrasyon elde etmek için bir hücre süspansiyonu seyreltin.

Hücre Kültürü ekler 2. hazırlanması

  1. hücre kültürü ekler kaplanması
    Önemli not: hücre kültürü ekler zarını dokunmaktan kaçının.
    1. Her bir hücre kültürü eki 100 uL fibronektin çözeltisi (1.1.1 bakınız) (Şekil 1A) ve bir 96-gözlü düz tabanlı plakanın bir kuyu (optik kontrol çukur) ekleyin. 37 ° C'de en az 3 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon aspirat fibronektin çözeltisi sonra.
    2. 100 uL HBMEC hücre kültürü ekler süspansiyonun ve iyi optik kontrol ekleyin. Hücrenin alt bölmeye 600 ul ECM-b orta ekleyinkültür ekleri. , 37 ° C / 5 bariyer bütünlüğünü (Şekil 1B) kadar% CO2 ulaşıldığında 4 gün de optik kontrol HBMEC mikroskopik değerlendirme hücre büyümesini kontrol - 3 inkübe edin. Not: Dört gün ötesinde Hücre büyümesi önerilmez.
    3. İsteğe bağlı: enflamatuvar koşulları taklit etmek için alt bölmeden orta aspire ve 24 saat göç deneyi öncesinde 500 U / ml IFN-γ / TNF-a ile takviye ECM-b ortamı ile değiştirin.

Hicret Testinin gününde Evans Blue ile 3. Kalite Kontrolü

  1. Evans mavisi çözeltisinin hazırlanması
    1. 15 ml santrifüj tüpü kullanılarak 200 ul B27 eki ile, PBS / B27 çözeltisi karışımı 10 ml PBS hazırlamak. Evans mavi stok çözeltisi ile seyreltilir (20 mg / ml PBS) 1: PBS / B27 1.000.
  2. Evans mavisi geçirgenlik deneyi
    1. Üst bölme, ardından alt bölmeden orta aspirekonfluent tek tabaka HBMEC ihtiva eden bir hücre kültürü ucun. hücre kültürü eki 100 mcL Evans mavisi solüsyonu ekleyin.
    2. Alt bölmeye 600 uL PBS / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Dikkatle forseps kullanarak hücre kültürü eki çıkarın.
  3. Evans mavisi ölçüm
    1. alt bölme PBS / B27 çıkarın ve siyah bir polistirol 96-gözlü düz dipli levhanın iki oyuklarına 100 uL her aktarın. bir Tecan Sonsuz M200 Pro plaka okuyucuda plaka yerleştirin ve optimal z konumunu belirler.
    2. (Örneğin: eksitasyon: 620 nm, emisyon: 680 nm, bant genişliği eksitasyon: 9 nm, emisyon bant genişliği: 20 nm, 175x geliştirme, 25 yanıp söner, entegrasyon süresi: 20 us) Evans mavisi kullanılarak ilgili ayarlar Ölçü uyarım.
    3. HBMEC bariyer fonksiyonu tohum sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavi geçirgenliğini tasvir eden bir standart eğriye elde edilen veriler karşılaştırma belirlemek içining hücreler (sağ Şekil 1B).

4. Yer değiştirme tahlili

  1. periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) hazırlanması.
    1. 15 ml lik santrifüj tüpüne 10 ml RPMI ekleyin ve 200 uL B27 ek ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'de PBMC ve santrifüj hücreleri sayın. 5 x 10 6 hücre / ml RPMI / B27 bir nihai konsantrasyona kadar PBMC yeniden askıya.
  2. göç deneyi kunnak
    1. Konfluent HBMEC mono tabakalar (Şekil 1A) ihtiva eden hücre kültürü eklerin üst bölme ve ardından alt bölmeden orta aspire. Donör başına başına 24 oyuklu plakanın bir oyuk (in vitro kontrol), hücre kültürü ekler 100 uL PBMC süspansiyonu, her ekleme ve.
    2. In vitro kontrol ait PBMC hücre kültürü ekler ve 500 uL alt bölmeye 600 uL RPMI / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 de 6 saat inkübe edilir.
    3. Taşınan PBMC'nin Hasat
      1. forseps kullanılarak hücre kültürü eki çıkarın ve dikkatli bir şekilde membran dokunmadan 400 uL PBS ile alt yıkayın. Hücre kültürü eki atın.
      2. 20 uL akış sayısı flüoro ekleme hücre kültürünün alt bölüme (yaklaşık 1.000 boncuk / uL) in vitro kontrol için hem de eklemek ve iyice karıştırın. borular akış sitometrisi PBMC süspansiyonun devri 1 ml.

    5. Akış Sitometri

    1. örnek hazırlama
      1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin PBMC.
      2. 100 ul florokrom-eşlenik antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın numune başına (PBS /% 1 BSA / 2 mM EDTA) içinde tampon akış sitometrisi. 1 uL CD4-FITC aşağıdaki sonuçları elde etmek için, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5 @, 1 uL, CD56-PY7, 1 uL CD8-A700 ve 1 uL CD16-A750 numune başına kullanılmıştır.
      3. PB Re-askıyaAntikor çözeltisinin 100 uL MC ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
      4. 250 uL, 5 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj akış sitometrisi ekleyin.
    2. Numune toplama
      1. gereken miktarda PBMC askıya yeniden akış sitometrisi tampon maddesiyle (kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişir).
      2. akış sayısı flüoro tespit etmek için 525 ile 700 nm dalga boyunda arasında aktif detektörü ile akış sitometresiyle lekeli PBMC Edinme (eksitasyon 488 nm, emisyon 525-700 nm).
        (Aşağıdaki adımlar Kaluza G yazılımı ile çalışan sitometresi Gallios akış kullanıldığında bir örnektir. (1) başlatın işletim sistem tamamen dolu olduğu zaman (2), renkli "sitometresinde" tuşuna basarak akış sitometresi başlangıç . (3) "açık protokol" düğmesine basarak ilgili edinim protokolünü yükleyin. (4) gerekli protokolü seçin ve "açık" seçeneğini seçin. (5) sağ ile tıklayarak her numune için protokol çoğaltınSanal atlıkarınca ve "yinelenen" sahada sol klik görünür protokolüne fare düğmesi. (6) örnek bir liste her bir örnek olarak etiketleyin. (7) döner piramit belirtilen pozisyonlarında örnekleri aktarın ve satın alma başlar.)
    3. Numune analizi
      1. İlgili yazılım kullanarak veri sitometrisi Açık çıkan akışı. In vitro kontrol gözlerinden elde transmigrant PBMC ilgi olarak hücre alt popülasyonlarının sayısını belirler ve ilgili analiz yazılımı kullanılarak sayım flüoro akar.
        (Yolluk stratejinin bir örneği (Şekil sonuç bölümünde 1 C verilmiştir: İleri saçılma kanalı (FSC) grafiği yana doğru bir dağılım kanalı (SSC) içerisinde lenfositleri seçmek için, ilk, NK-hücre alt setlerinin bir transmigrasyonu, analiz etmek lenfositlerdir. daha sonra bir CD56 grafiği CD3 ve CD56 +, CD3 görüntülenen -. NK hücreleri seçilmektedir NK-hücre alt kümeleri arasında ayrım yapmak için, NK hücreleri de gösterildiBir CD56 CD16 karşı grafiğidir ve CD56 parlak CD16 / dim - hem de CD56 loş CD16 + NK hücreleri seçilmektedir. Buna ek olarak, akış sayısı florosferler bunların sayısını belirlemek için zamana karşı 525 ila 700 nm arasında bir emisyon ile bir kanalın bir arsa görüntülenen daha sonra FSC SSC karşı grafiğinden seçilir ve.)
      2. Her numunenin toplam hücre sayısını hesaplamak için, akış sayısı flüoro kullanarak hücrelerin tespit sayısını normalize:
        Denklem
      3. Toplam geçen hücre ve in vitro kontrol toplam hücrelerin arasındaki oran olarak yayılan hücrelerin yüzdesini belirlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NK-hücresi ve insan kan-beyin bariyeri modeli (Şekil 1A) kullanılarak T-hücresi alt kümelerinin bir transmigrasyonu, Örnek teşkil eden sonuçlar gösterilmektedir. HBMEC tek tabaka bütünlüğü sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçülmesi, ve Evans mavisi geçirgenlik (Şekil 1B) lekelenmesi ile doğrulandı. 3 sonra - 4 gün kültür HBMEC sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1 (sol Şekil 1B,) olarak ifade edilmiştir. Bundan başka, HBMEC (sağ, Şekil 1B) Evans mavisi için transendotelyal elektrik direnci (Şekil 1B, orta) ve aynı zamanda düşük nüfuz sergileyen tek tabaka içinde büyüdü. Ve CD56, CD4 + ve CD8 + T iki ex hücreler de dahil olmak üzere CD16 + NK-hücre alt ve T hücrelerini loş - HBMEC mono tabakalar CD56 parlak CD16 / dim içeren NK hücrelerinin bir transmigrasyonu yapısını incelemek için kullanılmıştıramples (sırasıyla Şekil 1D + E). Göç eden hücre yüzdesi, bir iç kontrol (Şekil 1C) olarak akış sitometrisi ve normalize kullanılarak akış sayısı flüorosfer ile elde edilen hücre sayısı üzerinden hesaplanmıştır. HBMEC tek tabaka enflamatuvar koşulları taklit etmek üzere tahlilde önce IFN-y ve TNF-α, 24 saat ile uyarılmıştır. Sitokin uyarılması analiz edilen tüm lenfosit popülasyonu artan göç ile sonuçlanmıştır. Bu, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin ifadesindeki artışa olabilir (veriler gösterilmemiştir). CD56 parlak CD16 / dim - kendi CD56 ile kıyaslandığında, NK hücreleri, daha yüksek bir göç kapasitesi sergilemiştir uyarılmış hem de uyanlmamış (10.88 ve% 0.86%) ve IFN-γγ / TNF-a arasında CD16 + NK dim (18.22 ve% 2.94%) HBMEC (Şekil 1D). Bununla birlikte, iltihaplanma sonucu göçü nispi artış + CD16 dim CD56 için daha yüksekti parlak CD16 + için 342 ve% + 167% / dim -). Bu sonuçlar, CD56 parlak CD16 / dim in vivo gözlemler taklit - NK hücreleri intratekal bölmesine zenginleştirilmiştir. Bu nedenle, kan-beyin bariyeri modeli CNS 21 içine nadir lenfosit popülasyonu bağışıklık hücresi diyapedezin temel ilkelerini analiz için uygun olacak gibi görünüyor. Son olarak, CD4 ve CD8 T hücresi alt kümelerinin transmigratory kapasitesi (Şekil 1 E) gösterilmektedir.

Şekil 1
Şekil 1: Enflamasyon olmayan ve iltihaplı HBMEC mono-tabakalar üzerinde, NK-hücre alt Diferansiyel Göç. C. Transwell ekler (sol) ve deneysel düzenek (sağ) gösterim resmi. HBMEC baryer fonksiyonları B. Doğrulama. Sol: sıkı bağlantı mol immünohistokimyasal boyamaecule ZO-1 tavşan anti-insan ZO-1 (Abcam, 1: 200) kullanılarak: 3 gün boyunca yetiştirilen HBMEC üzerinde anti-tavşan IgG-Cy3 (300 1) ve keçi. Centre: 2. günde ve yetiştirme 4 gün arasında HBMEC transendotelyal elektrik direnci (TEER). Sağ: ile ( "İltihaplı" kırmızı) ve olmayan ( "Enflamasyon olmayan", siyah) uyarılması ile HBMEC için Evans mavi nüfuz için standart eğri 500 U / ml IFN-γ ve 24 saat süre ile, TNF-α. 96 saat HBMEC (siyah ok) ekimden - göçü deneyleri 72 gerçekleştirilir. CE. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi 16 sağlıklı bireylerden elde edilen PBMC, göç deneylere tabi tutulmuştur. tahlilden önce 24 saat, hücre kültürü ekler yarısı ile uyarılmıştır 500 lU / ml IFN-γ, TNF-α. Transmigrant hücreler hasat edilmiştir ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. PBMC C. Örnek sonuçlar iyi in vitro kontrol (en üst) ve Enflamasyon olmayan HBMEC (alt) boyunca taşıma işleminden sonra elde edilen. NK cel / dim CD56 + hücreleri ve CD56 parlak CD16 içine daha fazla seçkin - - ( "CD56 parlak ") ve CD56 loş CD16 + (" CD56 dim"), NK-hücre alt ls toplam CD3 olarak lenfositlerden geçirilmiştir. Akış sayım Flüorosferler ( "boncuk") FSC / SSC özelliklerine göre kapılı edildi ve sayıları zaman grafiği bir FL3 tespit edilmiştir. Örnek hesaplamalar sağda gösterilmiştir geçirilmiş CD56 parlak ve CD56 loş NK hücrelerinin yüzdesini belirlemek mümkündür. Göç NK hücreleri D. yüzdesi olarak CD56, aydınlık ve CD56 loş, NK-hücre alt ve CD4 + ve Enflamasyon olmayan (siyah) boyunca Tenâsüh veya iltihaplı (kırmızı), aşağıdaki, CD8 + T-hücre alt kümesine dahil olmak üzere göç T hücrelerinin, E. yüzdesi HBMEC, ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir. P-değerleri eşleştirilmiş Student t-testi ile hesaplandı; ** p <0.01, *** P <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS'ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir.

Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bundan başka, 24 saat önce deney, IFN-y ve TNF-a ile HBMEC tek tabaka tedavi enflamatuar CNS bozuklukları 21, 25 etkisini incelemek amacıyla, iltihaplı kan-beyin engelini taklit etmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, diğer maddeler ile HBMEC veya lenfositler tedavisi lenfosit ekstravazasyonunun üzerindeki etkisini inceleyen sağlar (örneğin onlarınadezyon molekülleri üzerinde etki) 30, 31. Bazı yapışma moleküllerine katılımı entergnler ya da ligandları 32 bloke edici antikorların kullanıldığı incelenebilir. Bundan başka, burada sunulan deney düzeneği kemokinlerin veya astrosit veya başka hücrelerden 33, 34 türetilmiş süpernatanlarından kemotaktik etkileri analizine izin verir. Primer insan beyin türevi epitel hücreleri ile HBMEC değiştirilmesi, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyeri 15 araştırılması için, bu deney düzeneği spektrumunu genişletmektedir. HBMEC modelinin merkezi sinir sistemi spesifikliğini muhafaza etmek için diğer organlar elde ölümsüzleştirilmiş endotel hücreleri ya da hücreleri ile değiştirilmesi gerekir. Ancak, başka türlerin beyin türevli endotel hücreler, ilgili hayvan 35 transmigrasyonun analiz etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, retinoik asit veya hidrolizocortisone bariyer fonksiyonlarını geliştirmek için tarif edilmiştir ve bu yüzden, 37 36 bir şekilde kullanılabilecektir. Bizim modeli PBMC (veriler gösterilmemiştir) 6 ila 10 x 5 x 10 2 ile 1 arasında doğrusal geri kazanım oranlarını sağlar, çünkü sınırlı hücre sayıları halinde analize tabi hücre miktarı, azaltılabilir. göçüne aşağıdaki nadir hücre popülasyonlarının analiz etmek için akış sitometrisi için gerekli olan yeterli hücreleri elde etmek için birkaç kuyulardan havuz hücreleri için gerekli olabilir. Son olarak, deney düzeneği de CNS 38 içine ilaç verilmesini incelemek için kullanılabilir. 0.4 um arasında bir gözenek boyutuna lenfosit transmigrasyonun önler, ancak ilaç teslim 39, 40, 41, 42 çalışma sağlar, oysa 3 um arasında bir gözenek boyutu tipik haliyle, lenfosit transmigrasyonun izin vermek için kullanılır.

43, kan-beyin bariyeri güvenilirliğinin değerlendirilmesi için gösterildiği gibi HBMEC tek tabaka kalitesi izdiham mikroskopik değerlendirme gibi Evans mavisi nüfuz ile analiz edilebilir. Düşük g kuvvetleri ve erken pasajlar kullanımlarda HBMEC santrifüjlenmesi (yani

Burada anlatılan protokole uyulması anlamlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlasa da, bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Her şeyden önce, in vivo olarak kan-beyin bariyeri, çeşitli yollarla etkileşim ve sıkı birleşme 1 oluşumunu etkileyen bariyer fonksiyonunu güçlendirmek hücreleri, bir dizi ile oluşturulur. Bu kan-beyin bariyeri modeli, in vivo durumu iyi bir yaklaşım olmasına rağmen Dolayısıyla, önemli yönleri eksik. Ek olarak, kan-beyin bariyeri boyunca merkezi sinir sistemi içine lenfosit ekstravazasyon çok aşamalı bir süreçtir. Her bir adım ayrı ayrı araştırılmalıdır mümkün olmakla birlikte, burada sunulan teknik kim hakkında bilgi sağlamazkesme kuvvetleri 2, 44, 45, 46 etkisi altında ekstravazasyon le proses. hücrelerin genellikle sadece tek haneli frekansları transmigrate Son olarak, bu PBMC'den geçen hücre analizi, ilgilenilen hücrelerden sıklığına bağlı olarak zor olabilir. Bu nedenle, daha önceki çok sayıda hücre kültürü ekler arasında geçen hücre deneyi ya da havuzu ilgi popülasyonlarının ayrılması gerekli olabilir. CNS içine lökosit göç analizi için diğer modeller bizim modelinde eksik yönlerinin bazı kapsar. Astrositler, perisitler ve / veya nöronlarla Co-kültür, kan-beyin bariyerinin 47 daha karmaşıklığı taklit etmek için kullanılır. Örneğin DIV BBB kesme kuvvetleri dahil modelleri lenfosit diyapedezin 48 daha sofistike bir analiz sağlayarak, bu nedenle, daha fazla fizyolojik kondisyon göstermektedir. Özet olarak, insan kan-beyin bariyeri boyunca nitel ve nicel lenfosit diyapedezin araştırılması için uygun kolay ulaşılabilir bir teknik sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Immunology Sayı 122 lenfosit ekstravazasyon lenfosit göçü merkezi sinir sistemi hedef arama kan-beyin bariyeri HBMEC endotel
Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter