Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l'indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l'endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l'analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l'impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.

Introduction

migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti 1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione 2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite 3, neuromielite ottica, ictus, e la sclerosi multipla (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Pertanto, è importante studiare linfociti stravaso di capire meglio la malattia fisiopatologia e di sviluppare strumenti per un melioration di malattia onere 8, 9, 10, 11, 12.

Linfociti migrano nel SNC tramite percorsi distinti. Stravaso attraverso venule postcapillari nello spazio subaracnoideo attraverso la barriera sangue fluido cerebrospinale all'interno del plesso coroide e attraverso la barriera emato-encefalica sono stati descritti 1, 13, 14, 15. Migrazione attraverso la barriera ematoencefalica è condotta dall'interazione di linfociti con cellule endoteliali 14. Contrariamente alle cellule endoteliali in periferia, cellule endoteliali del SNC esprimono elevate quantità di molecole di giunzione strette, così strettamente limitando la quantità di cellule e proteine ​​in grado di attraversare la barriera emato-encefalicalass = "xref"> 16. l'infiammazione in allentamento delle giunzioni strette e induce l'espressione di molecole di adesione; quindi, aumentando la migrazione dei linfociti nel SNC 1, 17, 18.

Lo stravaso attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Linfociti cordicella per le cellule endoteliali e quindi rotolare lungo l'endotelio in un processo principalmente mediato da selectine 1, 15. Successivamente, le interazioni tra chemochine secrete dall'endotelio ed i rispettivi recettori per chemochine espressi sui linfociti inducono cambiamenti conformazionali di integrine, promuovendo così ferma adesione alle cellule endoteliali 1. Infine, linfociti sia strisciare lungo la barriera endoteliale contro il flusso di sangue prima trasmigranti nello spazio perivascolare, o stallo immediatamente e direttamente trasmigrate al sito della ditta adesione 1, 19, 20. Tutte queste fasi di linfociti stravaso possono essere analizzate in vitro con tecniche distinti 21. Time-lapse microscopia video viene utilizzato per studiare il tethering iniziale e rotolamento 15. Saggi di adesione forniscono informazioni dettagliate su arresto ditta per endoteliali barriere 22. Saggi trasmigrazione come dimostrato qui consentono l'analisi della trasmigrazione immuno-cella 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Utilizzando l'umano in vitro di sangue modello encefalica, potremmo recentemente dimostrare che una più alta migrcapacità Atory di CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK rispetto al loro CD56 dim CD16 + controparti è riflessa da una predominanza di questo sottogruppo di cellule NK nel vano intratecale 21. Così, il nostro apparato sperimentale sembra essere adatto per simulare la situazione in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC)

  1. Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare
    1. Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene.
    2. Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina flaconi possono essere conservati per 2 settimane a 37 ° C / 5% di CO 2.
  2. Semina e coltura cellulare di HBMEC
    1. soluzione fibronectina Aspirare dal fondo del pallone di coltura cellulare. Aggiungere 7,2 x 10 4 HBMEC / cm sospesi in 6 mL ECM-b medie (= ECM-b integrato con 5% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, e 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali). Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. Controllare la crescita delle cellule al giorno utilizzando un microscopio.
    2. Cambiare la media ogni 3 giorni.Raccogliere o cellule dividere, quando HBMEC raggiungere circa il 80% di confluenza. HBMEC deve essere utilizzato tra passaggio 1 e 15 per evitare la perdita delle proprietà fisiologiche.
  3. Harvest HBMEC.
    1. Preparare accutase soluzione miscelando accutase (1x) con PBS a un rapporto di 1: 1. Mantenere accutase soluzione a 37 ° C in un bagno d'acqua fino ad ulteriore utilizzo.
    2. Trasferimento ECM-b mezzo dal pallone di coltura di cellule in una provetta da centrifuga 15. Lavare HBMEC aggiungendo 5 ml di PBS al fondo del pallone di coltura cellulare. Aspirare PBS e ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
    3. Aggiungere 2 ml di soluzione pre-riscaldato accutase. Incubare a 37 ° C per 2 min. Successivamente, HBMEC vengono risospese saldamente toccando il pallone di coltura cellulare più volte. Cellule distacco è controllato tramite un microscopio
    4. L'ECM-b-medio precedentemente memorizzato in una provetta da 15 mL viene aggiunto nuovamente al pallone di coltura cellulare non appena HBMEC inizia a staccarsi. Risciacquare il fondo del pallone volte fino a più HBMEC sonoRISOSPESO.
    5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml ECM-b medie. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 3 x 10 5 HBMEC per mL ECM-b medie.

2. Preparazione del Colture cellulari Inserti

  1. Rivestimento di inserti colture cellulari
    Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti colture cellulari.
    1. Aggiungere 100 microlitri soluzione fibronectina (vedi 1.1.1) per ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto (controllo ottico bene). Incubare per almeno 3 ore a 37 ° C. Dopo soluzione di incubazione aspirare fibronectina.
    2. Aggiungere 100 microlitri di sospensione HBMEC agli inserti di coltura cellulare e il controllo ottico bene. Aggiungere 600 microlitri ECM-b mezzo al compartimento inferiore della cellainserti coltura. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2 fino integrità della barriera (Figura 1B) viene raggiunto, controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica del HBMEC nel controllo ottico bene. Nota: non è consigliabile la crescita delle cellule al di là di quattro giorni.
    3. Opzionale: Per simulare condizioni infiammatorie aspirare il terreno dal compartimento inferiore e sostituirla con ECM-b mezzo integrato con 500 U / ml di IFN-γ / TNF-α 24 h prima del saggio di migrazione.

3. Controllo di qualità con Evans Blue nel Giorno del saggio Trasmigrazione

  1. Preparazione della soluzione di blu Evans
    1. Per preparare PBS / B27 soluzione della miscela 10 mL PBS con supplemento B27 200 microlitri utilizzando una provetta da centrifuga 15. Diluire soluzione madre blu Evans (20 mg / ml di PBS) 1: 1000 con PBS / B27.
  2. Evans saggio di permeabilità blu
    1. Aspirare il terreno dal vano inferiore, seguita da vano superioredi un inserto di coltura cellulare contenente un confluenti HBMEC monostrato. Aggiungere 100 ml di Evans soluzione blu per l'inserto coltura cellulare.
    2. Aggiungere 600 microlitri di PBS / B27 al vano inferiore e incubare per 60 min a 37 ° C / 5% di CO 2. Rimuovere con attenzione l'inserto di coltura cellulare con pinze.
  3. misurazione blu Evans
    1. Rimuovere PBS / B27 dal compartimento inferiore e trasferire 100 microlitri ciascuno a due pozzetti di una polistirolo nero 96 pozzetti a fondo piatto. Inserire piatto in un lettore di piastre Tecan Pro Infinite M200 e determinare z-posizione ottimale.
    2. Misura eccitazione di Evans blue utilizzando rispettive impostazioni (ad esempio: eccitazione: 620 nm, emissione: 680 nm, banda di eccitazione: 9 nm, emissione di banda: 20 nm, valorizzazione 175x, 25 lampeggia, tempo di integrazione: 20 ms).
    3. Per determinare funzioni di barriera HBMEC confronta le acquisiti dati con una curva standard raffigurante Evans blu permeazione attraverso HBMEC a tempi diversi dopo semecellule ing (Figura 1B, destra).

4. Migrazione Assay

  1. Preparazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).
    1. Aggiungere 10 ml RPMI in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 microlitri B27 supplemento. Contare le cellule PBMC e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml RPMI / B27.
  2. Set-up del test di migrazione
    1. Aspirare mezzo dal compartimento inferiore, seguita da scompartimento superiore di inserti colture cellulari contenenti confluenti HBMEC monostrati (Figura 1A). Per donatore aggiungere 100 microlitri di sospensione PBMC ciascun agli inserti coltura cellulare ed anche ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a (controllo in vitro).
    2. Aggiungere 600 microlitri RPMI / B27 al vano inferiore degli inserti colture cellulari e 500 microlitri al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 ° C / 5% di CO 2.
    3. La raccolta delle migrata PBMC
      1. Estrarre l'inserto coltura cellulare utilizzando una pinza e risciacquare con cura il fondo con 400 microlitri di PBS senza toccare la membrana. Scartare dell'inserto coltura cellulare.
      2. Aggiungere 20 ml fluorosfere conteggio del flusso (circa 1.000 perline / mL) al vano inferiore della coltura cellulare inserire nonché al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 ml di sospensione risultante PBMC di citometria a flusso tubi.

    5. Citometria a Flusso

    1. preparazione del campione
      1. Centrifuga PBMC a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Preparare la soluzione di anticorpo aggiungendo anticorpi fluorocromo coniugato a 100 microlitri citometria a flusso tampone (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per campione. Per i risultati presentati di seguito 1 ml CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ml CD56-PC7, 1 ml CD8-A700, e 1 ml CD16-A750 sono stati utilizzati per campione.
      3. Risospendere PBMC in 100 microlitri della soluzione di anticorpi e incubare per 30 min a 4 ° C.
      4. Aggiungere 250 microlitri di citometria a flusso di buffer e centrifugare a 300 xg per 5 min.
    2. acquisizione del campione
      1. Risospendere PBMC nella quantità richiesta (variabile a seconda del citometro a flusso utilizzato) della citometria a flusso tampone.
      2. Acquisire macchiato PBMC usando un citometro a flusso con una sonda attiva tra 525 e 700 nm per rivelare fluorosfere conteggio flusso (eccitazione 488 nm, emissione 525 - 700 nm).
        (Le seguenti operazioni sono un esempio, se si utilizza un flusso Gallio citometro operato con software Kaluza G:. (1) Avviare il computer (2) Quando il sistema operativo è completamente caricato, avviare il citofluorimetro premendo il tasto "citometro a pulsante" . (3) Caricare il rispettivo protocollo di acquisizione premendo il tasto "protocollo aperto". (4) Scegliere il protocollo richiesto e selezionare "aperto". (5) Duplicate il protocollo per ogni campione cliccando con il dirittopulsante del mouse sul protocollo visibile nel carosello virtuale e un clic sinistro sul campo "duplicato". (6) Etichettare ogni campione nella lista di campioni. (7) Trasferire i campioni alle posizioni indicate della giostra e avviare l'acquisizione.)
    3. L'analisi dei campioni
      1. Aprire il flusso risultante citometria dati utilizzando il relativo software. Determinare il numero di sottopopolazioni di interesse per trasmigrata PBMC così come le cellule in vitro da pozzetti di controllo e il flusso fluorosfere conteggio utilizzando il rispettivo software di analisi.
        (Un esempio della strategia di gating è dato nella parte risultati (Figura 1 C: Per analizzare la trasmigrazione di sottoinsiemi cellule NK, selezionare prima linfociti in un canale laterale scatter (SSC) rispetto a canale forward scatter plot (FSC) linfociti sono. poi visualizzati in una CD3 contro trama CD56 e CD56 + CD3 -. Le cellule NK sono selezionati per distinguere tra sottogruppi NK-cellule, le cellule NK vengono visualizzati inun CD56 contro CD16 e CD56 CD16 trama brillante dim / - così come CD56 CD16 dim + cellule NK vengono selezionate. Inoltre, fluorosfere conteggio flusso sono scelti da un terreno FSC rispetto SSC e successivamente visualizzato in una trama di un canale con emissione tra 525 e 700 nm in funzione del tempo per determinare il loro numero.)
      2. Per calcolare il numero totale di cellule di ciascun campione, normalizzare il numero di cellule rilevata utilizzando fluorosfere conteggio flusso:
        Equazione
      3. Determinare la percentuale di cellule migrate come rapporto tra cellule migrate totali e cellule totali nel controllo in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L'integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 - 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 (Figura 1B, sinistra). Inoltre, HBMEC cresciuto in monostrati espongono resistenza transendoteliale elettrica (Figura 1B centrale) nonché ridotta permeazione Evans blue (Figura 1B, destra). Monostrati HBMEC sono stati usati per studiare la trasmigrazione delle cellule NK CD56 compreso brillante CD16 dim / - e CD56 dim CD16 + sottoinsiemi NK e delle cellule T, tra cui cellule come due ex CD4 + e CD8 + Tamples (Figura 1D + E, rispettivamente). La percentuale di cellule migrate è stata calcolata sulla base delle conte cellulari ottenute mediante citometria di flusso e normalizzati utilizzando fluorosfere conteggio flusso come controllo interno (Figura 1C). Il monostrato HBMEC è stata stimolata con IFN-γ e TNF-α 24h prima del test per simulare condizioni infiammatorie. stimolazione citochina comportato un aumento della migrazione di tutte le popolazioni linfocitarie analizzati. Questo potrebbe essere dovuto ad un aumento dell'espressione di molecole di adesione compreso ICAM-1 (dati non mostrati). CD56 luminoso CD16 dim / - cellule NK esposte una capacità migratoria maggiore rispetto alla loro CD56 dim CD16 + NK attraverso sia non stimolate (10,88% vs 0,86%) e IFN-γγ / TNF-α stimolata (18,22% vs 2,94%) HBMEC (Figura 1D). Tuttavia, l'aumento relativo di trasmigrazione come risultato di infiammazione era superiore per il CD56 dim CD16 + rispetto al + 167% per CD56 CD16 luminoso dim / -). Questi risultati imitano le osservazioni in vivo che CD56 luminoso CD16 dim / - cellule NK sono arricchiti nel vano intratecale. Così, il modello di barriera emato-encefalica sembra essere adatto per analizzare i principi fondamentali della diapedesi immunitaria delle cellule di popolazioni di linfociti rari nel SNC 21. Infine, la capacità trasmigratori di CD4 e CD8 sottogruppi di cellule T è mostrato (Figura 1E).

Figura 1
Figura 1: migrazione differenziale di sottoinsiemi cellule NK attraverso uninflamed e infiammate HBMEC monostrati. A. Una foto di inserti transwell (a sinistra) e illustrazione del setup sperimentale (a destra). B. Validazione delle funzioni di barriera HBMEC. Sinistra: colorazione immunoistochimica del mol giunzione strettoecule ZO-1 utilizzando il coniglio anti-umano ZO-1 (Abcam, 1: 200) e di capra anti-IgG di coniglio-Cy3 (1: 300) su HBMEC coltivate per 3 giorni. Centro: la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) di HBMEC tra il giorno 2 e il giorno 4 di coltivazione. A destra: curva standard per evans permeazione blu per HBMEC con ( "infiammato", rosso) o senza ( "uninflamed", nero) stimolazione con 500 U / mL IFN-γ e TNF-α per 24 ore. saggi di trasmigrazione vengono eseguiti 72 - 96 ore dopo la semina del HBMEC (freccia nera). CE. PBMC derivate da 16 individui sani sono stati sottoposti a test di migrazione come descritto nella sezione del protocollo. 24 h prima del saggio, metà degli inserti coltura cellulare sono state stimolate con 500 IU / ml di IFN-γ e TNF-α. cellule trasmigrato state raccolte e analizzate mediante citometria di flusso. C. rappresentativi risultati per PBMC derivate dal controllo in vitro ben (in alto) e dopo la migrazione di tutti uninflamed HBMEC (in basso). NK cel ls stati gated da linfociti totali come CD3 - cellule CD56 + e ulteriormente distinguere in CD56 CD16 luminoso dim / - ( "CD56 luminoso ") e CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") sottoinsiemi NK-cellule. fluorosfere conteggio del flusso ( "perle") sono stati gated sulla base di FSC / SSC caratteristiche ed il loro numero è stato determinato in un FL3 rispetto al plot tempo. Calcoli esemplificativi per determinare la percentuale di cellule CD56 e CD56 luminoso dim NK migrati vengono visualizzati sulla destra. D. percentuale di cellule NK migrate nonché dim sottoinsiemi NK-cellule CD56 luminoso e CD56, e E. percentuale di cellule T CD4 + compresi migrate e CD8 + sottogruppi di cellule T seguenti trasmigrazione attraverso uninflamed (nero) o infiammata (rosso) HBMEC raffigurato come media ± SEM. P-valori sono stati calcolati in coppia studente t-test; ** p <0.01, *** p <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici.

Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero essere analizzati per indagare la composizione della popolazione di cellule non migrate. Inoltre, il trattamento del monostrato HBMEC con IFN-γ e TNF-α 24 ore prima del test può essere utilizzato per simulare una barriera emato-encefalica infiammato per studiare l'effetto di disturbi infiammatori SNC 21, 25. Analogamente, il trattamento di HBMEC o linfociti con altre sostanze permette investigare loro effetti sulla linfociti stravaso (es loroeffetto sulle molecole di adesione) 30, 31. Il coinvolgimento di alcune molecole di adesione può essere studiata utilizzando anticorpi bloccanti per integrine o loro ligandi 32. Inoltre, l'apparato sperimentale qui presentata consente l'analisi degli effetti chemiotattici da chemiochine o supernatanti derivati da astrociti o altre cellule 33, 34. Sostituzione di HBMEC con il cervello umano cellule epiteliali primarie derivate allarga lo spettro di questa configurazione sperimentale per indagine della barriera sangue fluido cerebrospinale-15. HBMEC non dovrebbe essere sostituito con cellule endoteliali immortalizzate o cellule derivate da altri organi per mantenere CNS specificità del modello. Tuttavia, le cellule endoteliali cerebrali derivate da altre specie potrebbero essere usati per analizzare trasmigrazione nei rispettivi animali 35. Inoltre, l'acido retinoico o hydrocortisone sono stati descritti per aumentare le funzioni di barriera e potrebbe quindi essere impiegato 36, 37. In caso di numero di cellule limitato la quantità di cellule sottoposte al test può essere ridotta, perché il nostro modello prevede tassi di recupero lineare tra 2 x 10 5 e 1 x 10 6 PBMC (dati non mostrati). Per analizzare le popolazioni di cellule rare seguenti trasmigrazione potrebbe essere necessario cellule piscina da diversi pozzi per ottenere cellule sufficienti richieste per citometria a flusso. Infine, il nostro setup sperimentale potrebbe anche essere utilizzato per studiare il rilascio di farmaci nel SNC 38. Una dimensione dei pori di 3 um è tipicamente utilizzato per consentire linfociti trasmigrazione, mentre una dimensione dei pori di 0,4 um impedisce linfociti trasmigrazione, ma consente di studiare drug delivery 39, 40, 41, 42.

43. Centrifugazione HBMEC a forze inferiori g e l'utilizzo dei primi passaggi (cioè

Sebbene aderenza al protocollo qui descritto assicura risultati significativi e riproducibili, questa tecnica ha alcune limitazioni. Prima di tutto, in vivo la barriera emato-encefalica è formato da un numero di cellule che interagiscono in vari modi e rafforzare la funzione di barriera modificando la formazione di giunzioni strette 1. Pertanto, anche se questo modello barriera ematoencefalica è una buona approssimazione della situazione in vivo, aspetti importanti sono mancanti. Inoltre, linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Mentre ogni singolo passo può essere indagato a parte, la tecnica qui presentata non fornisce informazioni sul chile processo di stravaso sotto l'influenza di forze di taglio 2, 44, 45, 46. Infine, l'analisi di cellule migrate da PBMC potrebbe essere difficile a seconda della frequenza delle cellule di interesse, perché di solito solo frequenze sola cifra di cellule trasmigrano. Pertanto, la separazione delle popolazioni di interesse prima del dosaggio o pool di cellule migrate in più inserti di coltura cellulare può essere necessario. Altri modelli per l'analisi della migrazione dei leucociti nel sistema nervoso centrale coprono alcuni degli aspetti mancanti nel nostro modello. Co-coltura con astrociti, periciti, e / o neuroni vengono utilizzati per simulare la complessità della barriera emato-encefalica meglio 47. Modelli tra forze di taglio come DIV-BBB riflettono più le condizioni fisiologiche, pertanto, consentendo un'analisi più sofisticata di linfociti diapedesi 48. In sintesi, vi presentiamo una tecnica facilmente accessibile per l'indagine qualitativa e quantitativa di diapedesi dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Immunologia linfociti stravaso la migrazione dei linfociti CNS homing barriera emato-encefalica HBMEC endotelio
L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter