Langvarig Inkubation af akut neuronalt væv for Elektrofysiologi og Calcium-billeddannelse

Summary

Når fjernes fra kroppen, er neuronalt væv stærkt påvirket af miljømæssige forhold, der fører til eventuel nedbrydning af vævet efter 6 - 8 timer. Ved hjælp af en unik inkubation fremgangsmåde, som nøje overvåger og regulerer det ekstracellulære miljø af vævet, kan vævslevedygtighed blive udvidet betydeligt i> 24 timer.

Abstract

Akut neuronale væv præparater, hjerne skiver og retinal wholemount, kan normalt kun opretholdes i 6 - 8 timer efter dissektion. Dette begrænser den eksperimentelle tid, og øger antallet af dyr, der er brugt per undersøgelse. Denne begrænsning specifikt påvirkninger protokoller såsom calcium imaging, der kræver langvarig præ-inkubering med bad-anvendte farvestoffer. Eksponentiel bakterievækst inden for 3 - 4 timer efter slicing tæt korreleret med et fald i væv sundhed. Denne undersøgelse beskriver en fremgangsmåde til at begrænse antallet af bakterier i akutte præparater for at opretholde levedygtige nervevæv i længere tid (> 24 h) uden behov for antibiotika, sterile procedurer, eller vævskultur medier indeholdende vækstfaktorer. Ved at cykle den ekstracellulære væske gennem UV-bestråling og holde vævet i en brugerdefineret bedrift kammer ved 15 - 16 ° C vævet viser ingen forskel i elektrofysiologiske egenskaber eller calcium signaling gennem intracellulære calcium farvestoffer ved> 24 timer postdissection. Disse metoder vil ikke kun forlænge eksperimentel tid for dem ved hjælp akut nervevæv, men vil reducere antallet af dyr, der kræves for at fuldføre eksperimentelle mål, og vil sætte en guld standard for akut neuronalt væv inkubation.

Introduction

Elektrofysiologi og funktionel billeddannelse (calcium, spænding følsomme farvestoffer) er to af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle teknikker i Neuroscience. Brain slice præparater og retinal wholemount, som vil blive behandlet her, er et middel til at undersøge elektrofysiologiske egenskaber og synaptisk konnektivitet uden forurening fra anæstetika eller muskelrelaksantia. Hjerneskiver og retinal wholemount bevare deres strukturelle integritet, i modsætning kulturer eller cellehomogenater, tillader undersøgelsen af særlige kredsløb og hjernenetværk ^1. Optagelser fra isolerede væv har fordele i forhold til in vivo optagelser, da bevægelser forbundet med hjerteslag og respiration er elimineret. Desuden direkte visualisering giver specifikke klasser af celler, der skal målrettet og lokal anvendelse af farmakologiske værktøjer ^{2, 3.}

Patch-clamp optagelser og calcium farvestof-belastning i retinal wholemount kompliceres af eksistensen af ​​Inner Begrænsning Membrane (ILM), som dækker Retinal ganglieceller (RGC) lag og forhindrer direkte adgang til cellerne. Typisk er denne membran skrabes væk med en glaspipette til at tillade direkte anvendelse af et plaster pipette og dannelse af en gigaohm forseglingen på en enkelt celle. Hertil kommer, at bad påført calcium farvestoffer ikke krydse ILM og skal enten injiceres under denne membran ^4, retrogradt transporteres efter injektion på synsnerven ⁵ eller elektroporeret gennem vævet ^6. Endvidere, når anvendelse af en gnaver-model af retinitis pigmentosa, rd / rd mus, ILM er tykkere og mere uigennemtrængelig. Her bruger vi en teknik til at fjerne ILM med enzymatisk fordøjelse ^7, at give både allestedsnærværende calcium farvestof-belastning, og direkte adgang til retinale ganglieceller til patch-clamp RECORDINGS ^8.

Succesfulde optagelser fra enten hjernen skiver eller retinal wholemount afhænger dissektion og inkubering af levedygtigt neuronalt væv. Typisk væv ekstraheres om morgenen for eksperimentet og inkuberet i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), indtil det anvendes til optagelser. Normalt væv forbliver levedygtige i 6 - 8 timer, med betydelig nedbrydning følger denne tidsvindue. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae præparater normalt producerer mere væv end der kan optages inde fra denne korte tidsperiode. Derfor bliver vævet ofte kasseret i slutningen af ​​dagen og dissektion afsluttes igen på de efterfølgende dage. Det betyder et andet dyr anvendes, og ~ 2 timers opsætning og dissektion / farvning gentaget. Følgende protokol beskriver en fremgangsmåde til at forlænge levetiden af ​​neuronvæv i mere end 24 timer, hvilket betyder færre dyr anvendes, og mere eksperimentelle tid til rådighed. Tissue levedygtighed wsom vurderet gennem optagelse af elektrofysiologiske egenskaber og calcium dynamik, og disse egenskaber var ikke skelnes mellem <4 timer og> 24 timer postdissection.

Disse resultater viser, at ikke alene er encellede egenskaber intakt og funktionel efter forlænget inkubation, men netværksaktivitet, som vurderet ved calcium-billedbehandling og elektrofysiologiske optagelser, er uændret> 24 timer postdissection. Endvidere viser vi, at calcium farvestoffer kan forblive i celler i længere perioder uden at forårsage nogen skadelige virkninger. Anvendelsen af ​​denne protokol viser, at den funktionelle aktivitet af neuroner i akut neuronal væv kan opretholdes i lange perioder, når det eksterne miljø er stærkt reguleret. Da levedygtighed væv varierer meget mellem laboratorier på grund af forskellige inkubation protokoller, denne metode etablerer en guld standard for de ideelle parametre, der skal anvendes til at reducere variation i sundhed akut neuronal væv.

Protocol

Protokollen nedenfor beskriver fremstillingen af ​​C57BL / 6 og C3H / He (retinally degenerere) mus neuronalt væv, men tilsvarende teknikker kan anvendes til andre arter. Alle dyr var sunde og håndteres med standardbetingelser for temperatur, fugtighed, 12 timers lys / mørke cyklus, fri adgang til mad og vand, og uden nogen bestemt stress stimuli. Alle forsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med vestlige Sydney University Animal Care og etik udvalg og i henhold til dyret brug og retningslinjer pleje (Animal Research Authority # A9452, # A10396 og # A8967).

1. Brain Slice Forberedelse

1. Bedøver dyret ved inhalation af isofluran (5%) og halshugge anvendelse af en gnaver guillotine. Fjern hjernen hurtigt, som tidligere beskrevet ⁹ og placere den i iskold fysiologisk opløsning (aCSF) indeholdende (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 1 _MgCI2, 1,25 NaH _{2 PO4,} 2 _CaCl2, 25_NaHCO3, 25 dextrose og mættet med carbogen (95% _O2 / 5% CO _2-blanding; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Skær hjerneskiver, i området af interesse, 300 um tyk med en vibrerende mikrotom.
3. Overfør skiver til en specialbygget inkubation system, der overvåger nøje og styrer pH-niveauer (pH 7,2-7,4), carbogen flow og temperatur som tidligere beskrevet ^{10, 11.}
4. Indstil indledende kammer temperatur til 35 ° C i 15 - 30 min, og derefter langsomt reducere til 15 - 16 ° C som vist i figur 1C. Derefter inkuberes skiver i inkubationssystemet indtil det skal bruges, enten til elektrofysiologi eller billeddannelse.
   BEMÆRK: Hvis der skal anvendes skiver for calcium-imaging Følg nedenstående trin før afkøling væv under RT.

2. Retinal wholemount Forberedelse og Inner begrænsende membran Removal

1. Forbered retinale wholemounts under enten normallaboratorie lysforhold eller dim rød / infrarødt lys.
2. Aflive dyr ved cervikal dislokation og umiddelbart enucleate øjne. Lav et lille snit langs ora serrata og sted i enten Ames medier, eller aCSF indeholdende (mM): 125 NaCl, 25 _NaHCO3, 3 KCI, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 glucose, 0,5 L-glutamin, og mætte med carbogen (95% _O2 / 5% CO _2-blanding; ~ 300 mOsm; pH 7,4), ved stuetemperatur.
3. Fjern straks hornhinden, linsen og glaslegemet ved at skære langs ora serrata med lille saks og fjerne linsen og glaslegemet med pincet. Placer væv i inkubationssystemet ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Retinal væv kan opretholdes i øjet-cup, efter langsom reduktion temperatur til 15 - 16 ° C i> 24 timer i inkubationssystemet indtil brug.
4. For at fjerne ILM, overføre øjet-cup indeholder nethinden til et lille glas krukke indeholdende 30 U / ml papain, 1 mM L-cystin, 0,5 mM EDTA og 0,005% DNase i Earl's-Balanced Salt Solution (BSS) ved 37 ° C i 20 min. Påfør 95% _O2 / 5% CO ₂ til opløsningen gennem låget, men ikke boble. Hvis der anvendes væv fra unge dyr (<6 uger), fyldes op halv styrke.
   1. Stop enzymatisk spaltning, ved at anbringe vævet i en ovimucoid (10 mg / ml) og BSA (10 mg / ml) i 10 minutter i Earls BSS. Vask væv grundigt med aCSF før overførsel til inkubationen og nedbringe temperaturen til 15 - 16 ° C.
5. Oprethold retinal væv i øjet-cup indtil brug. For overførsel til mikroskopet, isolere nethinden fra øjet-cup og skæres i 4 stykker med en barberblad. Hvis hele nethinden er påkrævet, lave fire små snit i periferien af ​​nethinden, så den kan ligge fladt.
   BEMÆRK: imaging eksperimenter, belastning med calcium-farvestoffer før overførsel til inkubationen systemet, se nedenfor.

3. Fastholdelse Væv i inkubatoren

(figur 1A, B).
1. Cirkulere aCSF gennem et andet kammer (UVC kammer, bygget som tidligere beskrevet ¹²⁾ isoleret fra de vigtigste kammer og udsættes for 1,1 W UVC lys (254 nm, 5W / 2P sterilisator UV-lampe) for at eradiate bakterier flyder i opløsning (fig 1A). Kontrol UVC lys timing via en programmerbar timer ved hjælp af en tilfældig funktion, der tændes på tidspunkter varierende mellem 15 og 26 min hver 15 - 30 min for at undgå overdreven opvarmning af aCSF.
2. Indstil strømningshastighed i UVC kammeret til 12 ml / min som tidligere rapporteret ^12. Dæk UVC kammer med alufolie for at forhindre UVC belysning uden for kammeret, som kan skade neuronal væv.
   BEMÆRK: For mørke tilpasset retinal væv, anvende en skræddersyet dækning til de vigtigste kammer for at udelukke lys.
3. Brug en peristaltisk pumpe til cirkulationte opløsningen (aCSF) gennem de to kamre og en Peltier termoelektrisk kold plade køler til enten kold eller opvarme hovedkammeret til de ønskede temperaturer i området 0 - 50 ° C. For optimal væv inkubation bruge 15-16 ° C til lang sigt.

4. Calcium Dye Loading

1. Vælg calcium farvestoffer, baseret på præference for den enkelte forsker. Her bruger vi Fura-02:00, Fluo-08:00 eller Fluo-04:00. Imidlertid kan denne fremgangsmåde anvendes på andre farvestoffer samt: opløse calcium farvestoffer i DMSO til en 1 mM opløsning og 1% blokcopolymerer (f.eks pluronsyre-127) til et endeligt volumen på 50 pi og soniker i 10 min.
2. Tilsættes opløsning til aCSF til en slutkoncentration på 10 uM, 0,01% blokcopolymerer for hjerneskiver, og 20 uM (nethinden), 0,02% blokcopolymerer til nethinden. I retinae (papain behandlet) og hjernen skiver fra unge dyr, belastning til badet i 45 minutter ved 37 ° C (Fura-2 AM) eller ved stuetemperatur (Fluo-4 AM FLuo-8 AM).
   1. For voksne dyr, (> 12 uger) pipette de farvestoffer (50 ul) direkte på hjernen skiver og vedligeholde i 75 min for at tillade bedre indtrængning af farvestoffet ind i de dybe lag.
   2. For at sikre tilstrækkelig iltning af den neddykkede skive under farvestof inkubation forberede et glas loading kammer med lukket låg (cirkulær krukke med diameter 2,5 cm, 3,5 cm højde) med calcium farvestoffer fortyndet i 2,5 ml aCSF. Ilte kontinuerligt med 95% _O2 / 5% _CO2. Må ikke boble.
3. Efter farvestof lastning, vaskes vævet med aCSF og overførsel til inkubationssystemet, langsomt reducere temperaturen til 15 - 16 ° C indtil eksperimentel anvendelse.

5. Elektrofysiologiske Optagelser og Imaging

1. Placer væv i en neddykket optagelse kammer under et mikroskop, og perfundere med oxygeneret aCSF ved en strømningshastighed af 4 - 5 ml / min, enten ved stuetemperatur (~ 22 ° C) eller fysiologisk temperatur (~ 35 ° C). Hold vævet på plads ved hjælp af en skræddersyet '' harpe '', fremstillet af nylon eller guldtråde strakt og limet på tværs af en U-formet stykke guld eller platin wire.
2. For elektrofysiologi:
   1. Forbered optagelse pipetter fra 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilikatglas ved hjælp af en mikropipette aftrækker at opnå en endelig modstand på 5-6 MQ.
   2. Fyld pipetten med 3 - 4 pi intern opløsning som tidligere beskrevet ¹³ og visualisere celler under infrarød Differential Interference Contrast (IR-DIC) under anvendelse af et CCD-kamera. Den intracellulære opløsning bør omhyggeligt skræddersyet til hvert forsøg for at opnå eksperimentelle resultater.
   3. Position pipette, og samtidig opretholde positivt tryk påføres gennem en sugeport på holderen pipetten, på membranen af ​​en celle under anvendelse af en mikromanipulator. Da ILM er fjernet fra nethinden, er ingen skrabning forudgående membran påkrævet. Når pipetten er på cellen, forsigtigt negativtryk til pipetten for at opnå en gigaohm forsegling. Derefter brydes cellemembranen med en kort undertryk.
   4. Gør hel-celle strøm-eller spænding-clamp optagelser under anvendelse af standard teknikker som passende.
3. Calcium-imaging:
   1. For ratiometrisk billeddannelse af Fura-2, skal du bruge en ultra-high speed bølgelængde switcher til at give excitationsbølgelængder på 340 nm og 380 nm. Pass udsendte lys fra individuelle celler gennem en emission filter 510 ± 20 nm, og fange med en høj følsomhed, højhastigheds digital kamera.
   2. For en enkelt excitationsbølgelængde af Fluo-4, filter excitation lys gennem 460 - 490 nm båndpasfilter og udsendte lys gennem en 515 - 550 nm båndpasfilter. For den hurtigste og mest følsomme optagelse bruge en højhastigheds digital kamera sådan. Erhverve billeder efter behov.
   3. Måle ændringer i fluorescens som funktion af tiden, enten ved en enkelt bølgelængde (Fluo-4) eller ved hjælp af bølgelængden forholdetFremgangsmåde (Fura-2), som tidligere beskrevet ^{8, 14.}

Representative Results

Tæt regulering af den bakterielle belastning og temperatur af aCSF under inkubation er vigtigt at opretholde neuronalt væv levedygtighed. Dette kan optimeres gennem bestråling med UVC lys og opretholdelse af temperaturen af aCSF ved 15 - 16 ° C (figur 1). Desuden aCSF parametre stempel (APS, figur 1C) giver forsøgslederen med en registrering af de miljømæssige forhold (pH og temp.), Hvilket giver en guld standard for parametre, når inkubere neuronal væv, som, hvis de følges, vil reducere variation mellem eksperimenter.

Figur 1. En Incubation system, der giver Tight forordning af Tissue Miljø. A, Skematisk diagram af inkubationen system bestående af en kølende Peltier plade, hovedkammeret, peristaltisk pumpe og UVC kammer. B,Set fra siden af ​​hovedkammeret viser indløbs- og ud- punkter i aCSF, samt carbogen indløbs-, temperatur- og pH-sonder. Væv placeres på nettet som angivet. Alle målesonder er fastgjort til låget for at tillade strukturel stabilitet. C, aCSF Parametre Stempel beskriver temperatur og pH af aCSF under inkubation. D, Ovenfra af hovedkammeret viser monteringshuller til målesonderne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tissue levedygtighed kan måles ved hjælp af net-aktivitet (figur 2), samt forskellige billeddannende metoder, herunder calcium responser (figur 2B, C). For at overvåge netværksaktivitet, anvendt vi aCSF indeholder en høj koncentration af kaliumchlorid (KCl, 30 mM) lokalt,som førte til depolarisering af neuroner og glia i omegnen af den påførte K ^+. Denne depolarisering kan observeres ved stigningen i calcium transienter (figur 2B, C) og spiking aktivitet (figur 2D), som også tjener som en fysiologisk indikator for cellelevedygtighed. Vores resultater viser, at spiking aktivitet i skiver, der blev inkuberet i> 24 timer i inkubationssystemet svarede til "friske" skiver inkuberet i kortere perioder (> 4 h Figur 2D). Endvidere individuel neuron levedygtighed, der blev overvåget gennem intracellulære elektrofysiologiske optagelser af både passive og aktive membran egenskaber, herunder den hvilende membranpotentiale, input modstand, tidskonstant, og aktionspotentialet var sammenlignelig med parametre rapporteret i litteraturen ¹⁵ (figur 2E, F ).

Figur 2. Elektrofysiologiske og Calcium Egenskaber for Brain Skiver efter længere tids inkubation. A, Billede af en hjerne skive taget 28 timer efter udskæring med to ekstracellulære registreringselektroder der anvendes til måling af netværksaktivitet. En tredje elektrode (markeret med asterisk) anvendes til at puste 30 mM KCl. B, Time lapse billeder af skiver fyldt med Fluo-04:00 i> 24 timer, skildrer en stigning i intracellulære calcium transienter efter bad anvendelse af KCl. C, intracellulært calcium transienter følgende korte anvendelse af KCl (30 mM; 1 s). Rød - gennemsnitlig signal, Grå - calcium spor i enkelte celler som vist i B. D, ekstracellulære fysiologiske optagelse af netværksaktivitet før og efter anvendelse af KCl (røde pile) var stort set uændret mellem "friske" skiver (<4 timer postdissection), Og dem, der blev inkuberet i> 24 timer i inkubatoren. Bemærk stigningen i spiking aktivitet umiddelbart efter KCl ansøgning angiver levedygtige neuroner, der reagerer på stigning i [K ^+] med depolarisering. E & F, Passive (E), og aktive (F) membran egenskaber pyramideformet neuron Følgende 2 h (blå spor) eller 26 timer (sorte spor) inkubation i inkubationssystemet. Klik her for at se en større version af dette tal.

At give direkte adgang til cellerne i ganglion cellelag wholemount nethinden i retinally degenererede rd / rd-mus, blev ILM spaltet af enzymet papain ^{7, 8.} Efter fordøjelse, kan RGC'er og fordrevne amacrine celler tydeligt visualiseres undER kan målrettes DIC belysning (figur 3A), og celler til patch-clamp-optagelser uden forudgående skrabning af ILM. Repræsentative strøm-clamp optagelser fra en RGC er vist i figur 3B. Depolarisering af cellen via patch-pipetten forårsagede dosisafhængig aktionspotentiale generation, hvilket indikerer levedygtigheden af ​​celler efter papain-behandling.

Fjernelse af ILM også tilladt allestedsnærværende farvning af ganglion cellelag (GCL) med Fura-02:00 (figur 3D) og celler reagerede på 30 mM KCl ansøgning med en stor stigning i 340/380 nm-forholdet i forhold til F _0, som betyder en stor stigning i intracellulær calcium koncentration (figur 3E). Calcium niveauer vendte tilbage til baseline efter stimulering og celler kunne efterfølgende stimuleret til at producere en tilsvarende amplitude respons. Desuden er disse reaktioner var ikke skelnes mellem retinae registreret ved <4 timer og> 24 h postdissection (figur 3F, G).

Figur 3: Elektrofysiologiske og Calcium Optagelser i Retinal wholemount. A, Differential interferens kontrast billede af en patch-clamp optagelse fra en retinal ganglion celle i GCL efter papain fordøjelse. B, Celler bevarer afhængige dosis spiking reaktioner når depolariseret med 50, 100 og 150 pA hhv. C & D, Fjernelse af den indre begrænsende membran før bad anvendelse af Fura-02:00 giver allestedsnærværende belastning af retinale ganglieceller, billede taget med 380 nm excitation. E, når 30 mM KCl ASCF anvendes, 85% af farvede celler reagerede med en stigning i 340/380 forholdet. F & G, Stigningen i 340/380 forholdet vender tilbage til baseline efter 30 mM KCl ansøgning (røde bjælker), Og celler reagerer på efterfølgende stimulation både <4 timer og> 24 timer efter dissektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne artikel beskriver en inkubation metode til at forlænge holdbarheden af ​​akut neuronal væv til billedbehandling og elektrofysiologiske eksperimenter og dermed reducere de antallet af dyr, der er nødvendige for at gennemføre eksperimentelle mål. To vigtige processer regulerer forringelse af neuronal væv over tid: i) øget bakterier niveauer, og den ledsagende stigning i bakteriel endotoksin frigivet, og ii) excitotoksicitet som følger den traumatiske udskæring procedure ^10. Som akut nervevæv er miljømæssigt forsvarsløs, stram regulering af vævet miljøet gennem nøje overvågning af pH, temperatur og bakterier niveauer er afgørende for at opretholde den cellulære aktivitet samt nettets integritet. Dissektion, og vævsbehandling (papainfordøjelse, calcium farvestof loading) kan tage over 2 timer at fuldføre, hvilket medfører en reduktion i eksperimentel tid. Men da vævet kan holdes i inkubationssystemet for> 24 timer uden et målbart tab in levedygtighed ^{7, 8,} dette præparat skal kun udfyldes én gang for at opnå> 24 timer af resultater. Som en del af 3R strategi (erstatning, begrænsning, forfining) til formål at give vejledende principper for etisk brug af dyr ^16, denne metode vil have en stor indflydelse på at reducere antallet af dyr, der anvendes i disse typer af eksperimenter.

Fordøjelse af ILM af retinal wholemount væv gør det nemt målretning af celler i GCL for patch-clamp optagelser og allestedsnærværende calcium farvestof lastning af bad ansøgning. Disse teknikker er særligt nyttige til degenererede retinae, hvor ILM er meget tykkere og sværere at bryde ved skrabning med en glaspipette. Desuden papain forberedelse giver en måde at udføre parret-celle optagelser ved hjælp af to elektroder til at optage fra gap junction koblede celler i GCL, noget der ikke har været tidligere var muligt. Imidlertid, Papainfordøjelse sandsynligvis har nogle effekter på normal retinal fysiologi som K ⁺ receptor-ekspression er blevet vist at blive ændret i fotoreceptorer efter dissociation med papain ^6. Det er også muligt, at retinal arkitektur er påvirket. Velte og Masland viste, at selv om nogle RGC SOMA og dendritter blev beskadiget af papain behandling til fjernelse af ILM, kunne de med held optage fra RGC dendritter distalt for soma i de fleste neuroner, der angiver den strukturelle integritet af cellerne og processer ^5. Vigtigt er det, forlader nethinden knyttet til det retinale pigment epitel (RPE) og sclera, som beskrevet ovenfor, isolerer den ydre nethinde fra papain diffusion og kan reducere de negative virkninger for fotoreceptor ydre segmenter, når denne protokol anvendes til WT retinae. I begge tilfælde, papain behandling, eller skrabning af ILM, nogle cellebeskadigelse vil forekomme, skal forsøgslederen vælge den metode, der passer til experimEntal spørgsmål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232