Summary
8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저> 24 시간 동안 연장 될 수있다.
Abstract
해부 다음 8 시간 - 신경 조직 준비, 뇌 조각 망막 wholemount 급성, 보통 6 유지 될 수있다. 이 실험 시간을 제한 한 연구에 따라 이용되는 동물의 수를 증가시킨다. 이러한 목욕 적용 염료의 장기간의 사전 배양을 필요로 칼슘 이미징이 제한은 특별히 영향 프로토콜을. (3) 내의 박테리아 성장 지수 - 슬라이싱 후 4 시간 단단히 조직 상태의 감소와 관련된다. 본 연구는 성장 인자를 함유하는 항생제, 멸균 방법, 또는 조직 배양 배지 없이도 시간의 장기간 (> 24 h)에 대한 가능한 신경 조직을 유지하기 위하여, 급성 제제 세균의 증식을 제한하는 방법을 설명한다. UV 조사에 의해 세포 외 유체를 순환 15에서 사용자 지정 유지 챔버 내에서 조직을 유지함으로써 - 16 ° C는, 조직은 전기 생리 특성, 또는 칼슘시의 차이를 보여줍니다> 24 시간 postdissection에서 세포 내 칼슘 염료를 통해 gnaling. 이러한 방법은 급성 신경 조직을 사용하는 사람들에 대한 실험 시간을 연장 할뿐만 아니라, 실험 목적을 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄일 것이고, 급성 신경 조직 배양 용 금 표준을 설정한다.
Introduction
전기 생리학 및 기능적 영상 (칼슘, 전압 감응 염료) 신경에 가장 일반적으로 사용되는 실험 기술이있다. 뇌 슬라이스 준비하고 여기에 검사됩니다 망막 wholemount은 마취제 나 근육 이완제에서 오염없이 전기 생리 특성과 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공합니다. 뇌 슬라이스와 망막의 특정 회로 뇌 네트워크 (1)의 연구를 허용, 문화 또는 세포 균질 달리 구조적 무결성을 유지 wholemount. 격리 된 조직에서 녹음은 심장 박동 및 호흡과 관련된 운동으로 생체 내 녹음을 통해 이점을 제거해야합니다. 또한, 직접 시각화 대상이되는 세포의 특정 클래스 및 약리 도구 2, 3의 로컬 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
패치 클램프 녹음 및 CALCIUM은 로딩 염료 망막 wholemount에는 망막 신경절 세포 (RGC) 층을 포함하고, 세포에 직접 액세스를 방지 멤브레인 (ILM)를 제한 이너의 존재에 의해 복잡하다. 일반적으로이 멤브레인은 하나의 셀에 기가 옴 씰의 패치 피펫 및 형성의 직접 적용 할 수 있도록 유리 피펫으로 긁어된다. 또한, 목욕 적용 칼슘 염료는 ILM을 통과하지 않고 하나 역행 시신경 5에서 다음 주사를 운반 또는 조직 (6)를 통해 전기 천공,이 멤브레인 (4) 아래에 주입해야합니다. 색소 성 망막염의 설치류 모델을 사용하는 경우 또한,의 RD / RD 마우스는 ILM은 두껍고 더 꿰 뚫을 수있다. 여기서는 패치 클램프 recordi 대한 망막 신경절 세포에 편재 칼슘 염료 로딩 및 직접 액세스를 모두 허용하는 효소 소화 7과 ILM을 제거하는 방법을 사용하여NGS 8.
뇌 조각 또는 망막 wholemount 중 하나에서 성공적인 녹음 해부하고 가능한 신경 조직의 배양에 따라 달라집니다. 통상적으로, 조직을 실험의 아침 추출하고,이 기록을 위해 사용될 때까지 인공 뇌척수액 (ACSF)에서 배양 하였다. 이 시간 창 다음 중요한 저하, 8 시간 - 일반적으로 조직은 6 가능한 남아있다. 그러나, 뇌 조각 wholemount 망막 제제 모두는 일반적으로 짧은 시간주기 내에서 기록 될 수있는 것보다 더 많은 조직을 생성한다. 결과적으로, 조직은 종종 일의 마지막 폐기 및 박리 후속 일 다시 종료된다. 이것은 또 다른 동물 사용 및 설치 및 해부 / 반복 염색 ~ 2 시간을 의미합니다. 다음 프로토콜이 이용되는 소수의 동물을 의미 이상을 24 시간 동안 신경 조직의 수명을 연장하는 방법을 설명하고, 실험적인 시간이 가능하다. 조직의 생존 w전기 생리 특성과 칼슘 역학을 기록을 통해 평가하고, 이러한 속성은 <4 시간과> 24 시간 postdissection 사이의 구별 할 수 있었다있다.
이러한 결과는 장기간 배양 후 하나의 셀 속성은 그대로하고 기능뿐만 아니라 나타냅니다 만, 칼슘 이미징 및 전기 생리 녹음에 의해 평가로 네트워크 활동은, 24> 변경 시간 postdissection입니다. 또한, 우리는 칼슘 염료가 어떤 해로운 영향을주지 않고 장기간 세포에 남아있을 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜의 적용은 외부 환경이 고도로 조절되면 급성 신경 조직에서 신경 세포의 기능 활성이 장기간 유지 될 수 있음을 보여준다. 조직 생존 인해 상이한 배양 프로토콜 실험실간에 크게 변화 더욱이,이 방법은 급성 NEU의 상태에서 변화를 줄이기 위해 적용되어야 이상적인 파라미터 금 표준을 확립RONAL 조직.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
프로토콜은 아래의 C57BL / 6 및 C3H / 그는 (retinally 퇴화) 마우스의 신경 조직의 제조 방법을 설명하지만, 유사한 기술들이 다른 종에도 적용 할 수있다. 모든 동물은 건강하고 표준 온도 조건, 습도, 12 시간 조명 / 어두운주기, 음식과 물을 무료로 이용할 취급했고, 어떤 의도 스트레스 자극없이. 모든 실험 승인 및 웨스턴 시드니 대학 동물 관리 및 윤리위원회에 따라 수행하고 동물 사용 및 관리 지침 (동물 연구 기관 # A9452, # A10396 및 #의 A8967)에 따라되었다.
1. 뇌 조각 준비
- 이소 플루 란 (5 %)의 흡입에 의해 동물을 마취 및 설치류 단두대를 사용하여 목을 벨. 이전 9 설명한대로, 신속하게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 생리 솔루션 (ACSF) (단위 : mm)를 포함 넣 : 125 염화나트륨,의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2를 25 2.5의 KCl, 1NaHCO3을 25 덱 스트로스 carbogen 포화 (95 % O 2 / 5 % CO 2 혼합물 310 mOsm하여 pH 7.4).
- 진동 마이크로톰 300 μm의 두께, 관심 영역에서 뇌 조각을 잘라.
- 이전 10 11 바와 같이 carbogen 흐름 및 온도 - 밀접하게 모니터링하여 pH 수준 (7.4의 pH 7.2)을 제어 주문품 배양 시스템 슬라이스 전송.
- 15 ~ 35 ° C로 초기 챔버 온도를 설정 - 30 분, 천천히 15로 감소 - 그림 1C에서와 같이 16 ° C. 필요할 때까지 다음 중 전기 생리학 또는 이미징, 배양 시스템에서 슬라이스를 품어.
참고 : 슬라이스가 칼슘 이미징에 사용하는 경우, RT 아래 조직을 냉각하기 전에 다음 단계를 수행합니다.
2. 망막 Wholemount 준비 및 내부 경계 막 제거
- 두 정상에서 망막 wholemounts을 준비실험실 조명 조건이나 어두운 레드 / 적외선 빛.
- 자궁 경부 전위 즉시 명백히하다 눈으로 동물을 안락사. 에임스 미디어, 또는 ACSF 포함하는 하나의 작은 오라 세라 따라 잘라 내기, 장소 (MM) 확인 : (125)의 NaCl을, 25의 NaHCO3, 3의 KCl, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2, 10 글루코스, 0.5 L 글루타민, 및 carbogen로 포화 (2 / 5 % CO 2 혼합물을 95 % O; ~ 300 mOsm하여 pH 7.4)에서 RT.
- 즉시 작은 가위로 오라 세라 따라 절단 집게로 렌즈와 유리체를 제거하여 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 실온에서 배양 시스템에서 조직을 놓습니다.
참고 : 망막 조직이 15 느린 온도 감소 후, 눈 컵에서 유지 될 수있다 - 필요할 때까지 배양 시스템에서> 24 시간 동안 16 ° C. - Earl's- 30 U / mL의 파파인, 1 MM의 L - 시스틴, 0.5 mM의 EDTA와 0.005 %의 DNase의를 포함하는 작은 유리 항아리에 망막을 포함한 눈 컵을 전송의 ILM을 제거하려면20 분 동안 37 ° C에서 균형 소금 용액 (BSS). 뚜껑을 통해 용액에 95 % O 2 / 5 % CO 2를 적용하지만 거품하지 않습니다. 젊은 동물 (<6 주)에서 조직을 사용하는 경우, 반 강도 솔루션을 희석.
- 얼 BSS에서 10 분 동안 ovomucoid (10 ㎎ / ㎖) 및 BSA (10 ㎎ / ㎖) 용액에 조직을 배치하여, 소화 효소를 중지. 16 ° C - 워시 조직을 철저하게 ACSF와 배양 시스템에 전송하기 전에 15에 온도를 줄일 수 있습니다.
- 필요할 때까지 눈 컵에서 망막 조직을 유지한다. 현미경에 전송, 눈 컵에서 망막을 분리하고 면도칼 4 조각으로 잘라. 전체 망막이 필요한 경우에는 평평 할 수 있도록 망막의 주위에 4 개의 작은 상처를 만든다.
참고 : 이미징 실험, 배양 시스템에 전송하기 전에 칼슘 염료와 부하 내용은 아래를 참조하십시오.
3. 인큐베이터에서 조직을 유지
- 용액에 떠있는 박테리아를 방사하다하기 위해 (5W / 2P 살균기 UV 램프, 254 ㎚) 주 챔버로부터 분리 및 UVC 빛 W 1.1에 노출 (이전 12 설명한 바와 같이 내장, UVC 실) 두 번째 챔버를 통해 ACSF를 순환 (그림 1A). ACSF의 과열을 방지하기 위해 30 분 - 15 분마다 15 사이에 26 다양한 시간에 ON이 임의의 기능을 사용하여 프로그램 타이머를 통해 제어 UVC 빛 타이밍.
- 12 mL의에 UVC 챔버 내의 유량을 설정 / 분으로 12 이전보고 하였다. 신경 조직을 손상시킬 수있는 챔버, UVC 외부 조명을 방지하는 알루미늄 호일로 UVC 챔버 커버.
주 : 어두운 적응 망막 조직의 경우, 빛을 제외 할 주요 챔버로 맞춤 커버를 적용합니다. - circula하는 연동 펌프를 사용하여TE 두 챔버를 통해 용액 (ACSF)와 0의 범위 내의 원하는 온도로 냉각 또는 주 챔버를 가열하거나 냉각 기능 펠티에 열전 냉각 판 - 50 ° C. 장기 생존을위한 16 ° C - 최적의 조직 배양를 들어, 15을 사용합니다.
4. 칼슘 염료로드
- 개별 연구자의 선호도에 따라 칼슘 염료를 선택합니다. 여기에서 우리는의 Fura-오전 2시, FLUO-오전 8시 또는 FLUO-오전 4시를 사용합니다. 그러나,이 방법은 또한 다른 염료에 적용될 수있다 : 1 mM의 용액 및 1 %의 블록 공중 합체에 DMSO 칼슘 염료를 용해 (예를 들어, 플루로 닉 산 (127))를 10 분 동안 최종 50 μL의 부피 및 초음파 처리한다.
- 망막 10 μM, 뇌 조각 0.01 %의 블록 공중 합체, 및 20 μM (망막), 0.02 %의 블록 공중 합체의 최종 농도로 용액 ACSF 추가. F 37 ° C (의 Fura-2 AM) 또는 실온에서 (FLUO-4를 오전 젊은 동물, 45 분 동안 화장실에 부하로부터 망막 (파파인 치료) 및 뇌 조각에서루오-8 AM).
- 성인 동물 (> 12 주)에 대한 직접 뇌 조각 위에 염료 (50 μL)를 피펫, 그리고 깊은 층에 염료를 더 잘 침투 할 수 있도록 75 분 동안 유지한다.
- 염료 배양 동안 침수 슬라이스의 충분한 산소를 보장하기 위해, ACSF 2.5 mL에 희석 칼슘 염료와 닫힌 뚜껑 (직경 2.5 cm의 원형 항아리, 3.5 cm 높이)와 유리 로딩 챔버를 준비합니다. 95 % O 2 / 5 % CO 2으로 연속적 네이트. 거품하지 마십시오.
- 실험 사용할 때까지 16 ° C - 염료로드를 따라 천천히 15 온도를 감소 배양 시스템에 ACSF 및 전송과 조직을 씻는다.
5. 전기 생리 녹음 및 이미지
- 현미경 침수 기록 챔버 내에서 조직을 배치하고, (4)의 유량으로 산화 된 ACSF으로 관류 - RT (~ 22 ° C) 또는 생리적 온도에서 5 mL / 분 중 (~ 35 ° C). 홀리신장과 금 또는 백금 와이어의 U 자 모양의 조각을 통해 접착 나일론 골드 스레드로 만든 '하프' '만든 사용자 정의를 사용하여 장소에 D 조직.
- 전기 생리학의 경우 :
- 5-6 MΩ의 최종 저항을 달성하기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 기록 피펫을 준비합니다.
- 이전 13 설명 된 바와 같이 내부 솔루션의 4 μL와 CCD 카메라를 사용하여 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 세포를 시각화 - 3 피펫을 입력합니다. 세포 내 용액을주의 깊게 실험 결과를 달성하기 위해 각각의 실험에 맞게 조정되어야한다.
- 위치 피펫 양압을 유지하면서 미세 조작기를 이용하여 세포막에 피펫 홀더 흡입구를 통해서 주어지는. ILM이 망막에서 제거 된 이후, 더 이전에 막 스크래핑 필요가 없습니다. 피펫은 셀되면, 부드러운 음을 적용피펫에 압력이 기가 옴 밀봉을 달성했다. 이어서 부압 짧은 양의 세포막을 파열.
- 해당 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 또는 전압 클램프 녹음을합니다.
- 칼슘 이미징 :
- 의 Fura-2의 비율 적 이미징, 340 nm 내지 380 nm 인 여기 파장을 제공하는 초고속 파장 스위처를 사용한다. 510 ± 20 ㎚의 방출 필터를 사용하여 각 셀로부터 방출 된 광을 전달하고 고감도, 고속 디지털 카메라로 촬영.
- 550 nm의 대역 통과 필터 - 515 내지 490 nm의 대역 통과 필터 및 출사 광 - FLUO-4, 필터의 여기 광 460 내지 단일 여기 파장. 가장 빠르고 가장 민감한 녹화 등의 고속 디지털 카메라를 사용합니다. 필요에 따라 이미지를 획득.
- 시간의 함수 중 어느 하나의 파장 (FLUO-4) 또는 파장 비율을 이용로 형광의 변화를 측정방법은 (는 Fura-2), 미리 14 8 바와 같이.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
배양 중에 ACSF의 세균 부하 및 온도의 긴밀한 조절은 신경 조직의 생존을 유지하는 것이 필수적이다. 16 ° C (도 1) - 이는 UVC 광 조사 15에서 ACSF의 온도를 유지 통해 최적화 될 수있다. (도 1C APS), 다음 경우 사이의 변동성을 줄일 신경 조직을 배양 할 때 따라서 매개 변수를위한 황금 표준을 제공하고, 환경 조건의 기록 (pH와 온도.)와 실험자를 제공합니다 또한, ACSF 스탬프 매개 변수 실험.
조직 환경의 엄격한 규제를 활성화 그림 1. 배양 시스템. 냉각 펠티에 판, 주 챔버, 연동 펌프 및 UVC 챔버로 구성 배양 시스템의 A, 개략도. B,ACSF의 입구 및 출구 지점을 나타내는 주 챔버뿐만 아니라 carbogen 입구 온도와 pH가 프로브의 측면도. 나타낸 바와 같이 조직은 메쉬에 배치됩니다. 모든 측정 프로브는 구조적 안정성을 허용하도록 뚜껑에 부착된다. 배양하는 동안 ACSF의 온도와 산도를 설명 C, ACSF 매개 변수 스탬프입니다. D, 측정 프로브의 장착 구멍을 보여 주 챔버의 상위 뷰입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
조직 생존률은 네트워크 활동 (도 2)뿐만 아니라, 칼슘 응답 (도 2B, C)을 포함하는 다양한 촬상 방법에 의해 측정 될 수있다. 로컬 상기 네트워크 활동을 모니터링하기 위해 ACSF는 염화칼륨 (KCl을 30 mM의) 고 농도 함유인가이는 적용되는 K +의 주변에서 신경 세포의 탈분극과 신경교되었다. 이 탈분극은 세포 생존율에 대한 생리 지표로서 역할 칼슘 과도 (도 2B, C) 및 급상승 활동 (도 2d)의 증가가 관찰 될 수있다. 우리의 결과는 배양 시스템에서> 24 시간 동안 배양 하였다 조각의 활동을 급상승하는 것은 "신선한"조각이 짧은 기간 (도 2D> 4 시간) 동안 배양 비슷한 것을 보여줍니다. 또한, 휴식 막 잠재력, 입력 저항, 시정을 포함 모두 수동 및 능동 막 특성의 세포 전기 생리 녹음을 통해 모니터링 된 개별 신경 세포 생존 능력, 및 활동 전위는 문헌 (15) (그림 2E, F에보고 된 매개 변수를 비교했다 ).
장기간 배양 후 뇌 조각 그림 2. 전기 생리 및 칼슘 속성. 뇌 조각 A, 이미지는 네트워크 활동을 측정하기 위해 사용되는 두 개의 세포 외 기록 전극으로 나눈 다음, 28 시간을 촬영. 세 번째 전극 (별표로 표시) KCl을 30 mM의 퍼프하는 데 사용됩니다. B, KCl을 목욕 응용 프로그램에 다음과 같은 세포 내 칼슘 과도의 증가를 묘사> 24 시간 동안 FLUO-오전 4시로드 조각의 시간 경과 이미지. C, 간단한의 KCl의 응용 프로그램 (30 mM의 1의) 다음 세포 내 칼슘 과도. 레드 - 평균 신호, 그레이 - B에서와 같이 하나의 세포에서 칼슘 흔적. D, 이전과 KCl을 (빨간색 화살표)의 적용 후 네트워크 활동의 세포 외 생리 학적 기록은 "신선한"조각 사이에 크게 변화가 없었다 (<4 시간 postdissection) 및 인큐베이터에서> 24 시간 동안 배양 하였다 그들. 탈분극에 [K +]의 증가에 반응 가능한 뉴런 KCl을 나타내는 애플리케이션 직후 급상승 활성의 증가를 참고. E & F, 수동 (E), 2 시간 (청색 흔적) 또는 배양 시스템에서 배양 26 시간 (검은 흔적) 다음 피라미드 신경 세포의 활성 (F) 막 특성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
retinally 축퇴 RD / RD 마우스의 wholemount 망막의 신경절 세포 층의 세포에 대한 직접적인 액세스를 제공하기 위해, ILM은 효소 파파인 (7, 8)에 의해 분해 하였다. 소화 후 망막 신경절 세포 및 변위 무 축삭 세포 명확 싶게 가시화 될 수있다ER DIC 조명 (도 3a), 세포는 ILM의 사전 스크래핑없이 패치 클램프 기록의 대상이 될 수있다. RGC 대표 전류 클램프 녹음은 그림 3b에 도시된다. 패치 피펫을 통해 세포의 탈분극 파파인 처리 다음 세포의 생존율을 나타내는 용량 의존적 활동 전위 발생을 일으켰다.
ILM의 제거는 또한 대형 상징의 Fura-오전 2시 (도 3D)와 F 0 380분의 340 nm의 비율이 상대적으로 크게 증가하여 30 mM의 KCl을 애플리케이션에 응답 세포 신경절 세포 층 (GCL)의 유비쿼터스 염색 허용 세포 내 칼슘 농도 (그림 3E) 증가. 칼슘 농도는 다음과 같은 자극을베이스 라인으로 돌아와 세포이어서 유사한 진폭 응답을 생성하도록 자극 할 수있다. 또한, 이러한 응답은 R 사이의 구별했다etinae는 기록 <4 시간과> 24 시간 postdissection (그림 3 층, G).
그림 3 : 망막 Wholemount의 전기 생리 및 칼슘 녹음. 파파인 소화 후 GCL의 망막 신경절 세포에서 패치 클램프 녹음의 A, 미분 간섭 대비 이미지. 각각 50, 100, 150 pA를 함께 탈 분극 때 B는 세포 농도 의존적 급상승 응답을 유지한다. C & D는의 Fura - 오전 2시의 목욕 응용 프로그램 전에 내 경계 막 제거는 망막 신경절 세포의 유비쿼터스 로딩 이미지는 380 nm의 여기로 촬영 할 수 있습니다. E는, 30 mM의 KCl을 ASCF이인가되는 경우, 염색 된 세포의 85 %가 380분의 340 비율의 증가에 대응했다. F & G, 30 mM의 KCl을 신청 한 후 기준에 380분의 340 비율 반환의 증가 (빨간색 막대), 세포 후속 자극에 절개 다음 모두 <4 시간과> 24 시간 반응한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 문서함으로써 실험 목표를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄이고, 이미징 및 전기 생리학 실험에 급성 신경 조직의 생존을 연장하는 배양 방법을 설명합니다. 두 가지 방법은 시간에 신경 조직의 열화 관장 : ⅰ) 증가 박테리아 수준 및 방출 박테리아 독소의 동반 증가 및 외상성 슬라이싱 절차 (10)를 다음과 ⅱ) 흥분 독성. 급성 신경 조직 환경 무방비 바와 같이, 산도, 온도, 박테리아 수준 가까이 모니터링을 통해 조직 환경의 엄격한 조절은 네트워크 무결성뿐만 아니라 세포 활성을 유지하는데 필수적이다. 해부 및 조직 처리 (파파인 소화, 칼슘 염료 로딩) 실험 시간의 감소를 야기 완료를 통해 2 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나, 조직이 손실없이 측정> 24 시간 동안 배양 시스템에서 유지 될 수 있기 때문에 IN 생존 7, 8,이 제제는 결과> 24 시간을 얻기 위해 한 번에 완료 될 필요가있다. 3RS 전략의 일환으로 (교체 환원, 제련) 동물 16 윤리적 사용 원칙을 제공하는 목적으로,이 방법은 이런 종류의 실험에 사용 된 동물의 수를 감소에 큰 영향을 미칠 것이다.
망막 wholemount 조직의 ILM의 소화 패치 클램프 녹음 및 목욕 응용 프로그램에 의해 유비쿼터스 칼슘 염료로드의 GCL 세포를 쉽게 타겟팅 할 수 있습니다. 이 기술은 ILM이 유리 피펫으로 긁어에 의해 위반하는 것이 훨씬 두껍고 단단하다있는 퇴화 망막에 특히 유용하다. 또한, 파파인 제제는 GCL의 갭 - 접합 결합 세포로부터 기록하도록 두 전극을 이용하여 쌍을 이루는 셀 기록을 수행하는 방식으로, 이전에 가능하지 않은 것을 제공한다. 하나K + 수용체 발현 파파인 6 해리 다음 감광체에서 변경되는 것으로 도시 된 바와 같이, 파파인 소화 가능성 정상 망막 생리학에 일부 영향을 미친다. 망막 구조가 영향을받는 것도 가능하다. Velte 및 Masland 일부 RGC의 somas과 수상 돌기가 ILM을 제거하는 파파인 처리에 의해 손상되었다하더라도 RGC 가장 신경 세포의 소마에 원위 수상 돌기에서 성공적 세포의 구조적 무결성을 나타내는 기록 할 수 있다는 것을 보여 주었다 5를 처리합니다. 중요한 것은, 전술 한 바와 같이, 망막 색소 상피 (RPE) 및 공막에 부착 된 망막을 떠나는 것은 파파인 확산으로부터 외측 망막을 분리하고이 프로토콜은 WT의 망막에 적용될 때 감광체 외측 세그먼트에 어떤 악영향을 감소시킬 수있다. 두 경우 모두, 파파인 처리 또는 ILM의 연삭에서 발생 일부 세포 손상은, 실험자는 experim에 적합한 방법을 선택해야ental 질문입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
